于　哲，張　爽

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712000)

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魚腥草內(nèi)生放線菌F03培養(yǎng)條件的優(yōu)化及抑菌活性物質(zhì)的初步研究

于哲，張爽

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712000)

摘要：F03是分離于秦嶺野生魚腥草根部的一株抗菌活性較強的內(nèi)生放線菌。以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用單因素實驗和正交實驗對魚腥草內(nèi)生放線菌F03培養(yǎng)基的碳源、氮源和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行初步研究。優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基為：葡萄糖30 g，蔗糖10 g，黃豆粉10 g，蛋白胨10 g，K2HPO4 0.3 g，NaCl 1 g，CaCO3 2 g，蒸餾水1 000 mL；最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵液初始pH值8，發(fā)酵時間7 d，發(fā)酵溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速140 r·min-1，接種量7%；抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性好；Doskochilova溶劑系統(tǒng)紙層析測定結(jié)果表明，該發(fā)酵液中對金黃色葡萄球菌具有抑菌活性的物質(zhì)為水溶性抗生素。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生放線菌；最佳培養(yǎng)基；發(fā)酵條件；優(yōu)化；魚腥草；抑菌活性物質(zhì)

植物內(nèi)生菌因能產(chǎn)生與宿主植物相似或活性更強、結(jié)構(gòu)更新穎的代謝產(chǎn)物而成為近年來的研究熱點。目前使用的抗生素大部分來自放線菌的代謝產(chǎn)物，其中鏈霉菌屬產(chǎn)生的抗生素種類最多[1-3]。植物內(nèi)生放線菌作為一類特殊環(huán)境下的新型微生物資源，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中最重要的組成部分，在防治疾病和減輕病害等方面具有獨特優(yōu)勢。因此，從植物內(nèi)生放線菌中尋找和開發(fā)具有抑菌活性的菌株和新型的生物制劑，對推動我國醫(yī)藥發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

魚腥草為藥食兩用植物，具有清熱解毒、消癰排膿、利濕通淋等功效，且對多種細(xì)菌、真菌均有較明顯的抗菌作用[4]。近年來，魚腥草內(nèi)生菌受到研究者的廣泛關(guān)注。胡汝曉等[5]研究了魚腥草不同部位內(nèi)生菌的分布情況，發(fā)現(xiàn)魚腥草不同部位存在著大量的內(nèi)生菌，開發(fā)潛力巨大。楊春平等[6]對魚腥草內(nèi)生放線菌進(jìn)行分離并研究了其對不同植物病原菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)有幾株放線菌對多種病原菌都有很好的抑菌活性。研究表明，分離于秦嶺野生魚腥草根部的內(nèi)生放線菌F03的發(fā)酵液對多種細(xì)菌、真菌均有很好的抑菌活性，特別是對金黃色葡萄球菌的抑菌效果尤為顯著。

鑒于此，作者以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用單因素實驗和正交實驗對魚腥草內(nèi)生放線菌F03培養(yǎng)基的碳源、氮源和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行初步研究，旨在提高該菌株抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量，擬為后續(xù)抑菌活性物質(zhì)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1實驗

1.1菌種與培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌、魚腥草內(nèi)生放線菌F03，陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院微生物實驗室。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉 10 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.2～7.4。

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.4～7.6。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、K2HPO40.3 g、NaCl 1 g、 CaCO32 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2方法

1.2.1種子液的制備

將培養(yǎng)5 d的魚腥草內(nèi)生放線菌F03用打孔器打成直徑5 mm的菌餅，放入裝有50 mL高氏一號發(fā)酵液的250 mL三角瓶中，每瓶放入3個菌餅。在30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1、pH值為7的條件下培養(yǎng)5 d，即得種子液。

1.2.2發(fā)酵液的制備

按5%的接種量將培養(yǎng)好的種子液無菌操作下轉(zhuǎn)接到裝有100 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液的三角瓶中，在發(fā)酵液初始pH值為7、搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1、30 ℃下振蕩培養(yǎng)9 d后，用布氏漏斗過濾，棄去菌體，即得發(fā)酵液。

1.2.3抑菌活性的測定

用直徑4 mm的打孔器在涂有金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)皿中打2個菌孔，用移液槍吸取50 μL發(fā)酵液于菌孔中，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～96 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.4培養(yǎng)基碳源、氮源的篩選

(1)碳源的篩選

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，用蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉作為培養(yǎng)基的碳源，其它成分保持不變。通過測量抑菌圈直徑，篩選出最佳碳源。

(2)氮源的篩選

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，用黃豆粉、酵母粉、蛋白胨和(NH4)2SO4作為培養(yǎng)基的氮源，其它成分保持不變。通過測量抑菌圈直徑，篩選出最佳氮源。

1.2.5最佳發(fā)酵條件的篩選

(1)發(fā)酵液初始pH值的篩選

在優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵液初始pH值分別調(diào)至5、6、7、8、9、10，在30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1、接種量5%的條件下發(fā)酵培養(yǎng)9 d，得發(fā)酵液。測量發(fā)酵液的抑菌圈直徑，篩選出最佳發(fā)酵液初始pH值。

(2)發(fā)酵時間的篩選

按5%的接種量將種子液接入100 mL發(fā)酵液中，在篩選出的最佳發(fā)酵液初始pH值的基礎(chǔ)上，于30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1的條件下分別發(fā)酵培養(yǎng)5 d、7 d、9 d、11 d、13 d，得發(fā)酵液。測量發(fā)酵液的抑菌圈直徑，篩選出最佳發(fā)酵時間。

(3)發(fā)酵溫度的篩選

在篩選出的最佳發(fā)酵液初始pH值和發(fā)酵時間的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵液分別在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵液。測量發(fā)酵液的抑菌圈直徑，篩選出最佳發(fā)酵溫度。

(4)搖床轉(zhuǎn)速的篩選

在篩選出的最佳條件下，將發(fā)酵液放入轉(zhuǎn)速分別為100 r·min-1、120 r·min-1、140 r·min-1、160 r·min-1、180 r·min-1的搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，得發(fā)酵液。測量發(fā)酵液的抑菌圈直徑，篩選出最佳搖床轉(zhuǎn)速。

(5)接種量的篩選

在篩選出的最佳條件下，分別按3%、5%、7%、9%、11%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得發(fā)酵液。測量發(fā)酵液的抑菌圈直徑，篩選出最佳接種量。

1.2.6發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)的研究

(1)抑菌活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性的測定

將發(fā)酵液在60 ℃和100 ℃下分別放置60 min、120 min、180 min、240 min后，用蒸餾水調(diào)體積至原始體積。用打孔法分別測量發(fā)酵液的抑菌圈直徑，以未處理的發(fā)酵液為對照。

(2)抑菌活性物質(zhì)酸堿穩(wěn)定性的測定

將發(fā)酵液的pH值分別用1 mol·L-1HCl、1 mol·L-1NaOH調(diào)至1、3、5、7、9、11、13，靜置30 min、60 min、90 min后，再分別調(diào)發(fā)酵液的pH值到7，用打孔法測量發(fā)酵液的抑菌圈直徑，以未處理的發(fā)酵液為對照。

(3)發(fā)酵液Doskochilova溶劑系統(tǒng)紙層析

用移液槍取100 μL發(fā)酵液均勻點到距濾紙(10 cm×15 cm)邊緣10 mm處，再放入裝有展開劑的試管(12 mm×18 cm)中飽和20 min。將飽和的點樣濾紙的一邊浸沒于展開劑中約5 mm，待展開劑擴(kuò)展到濾紙約10 cm處取出，自然晾干。將晾干的濾紙放入鋪有金黃色葡萄球菌的LB平板上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取出觀察抑菌圈位置，記錄Rf值。

2結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)基碳源、氮源的篩選

2.1.1碳源的篩選(圖1)

圖1　碳源對發(fā)酵液抑菌活性的影響

從圖1可看出，以葡萄糖作為碳源時，發(fā)酵液的抑菌活性最高，其次是蔗糖。說明，放線菌F03對葡萄糖和蔗糖的利用率高，更易合成活性產(chǎn)物。因此，選擇葡萄糖和蔗糖作為碳源。

2.1.2氮源的篩選(圖2)

從圖2可看出，以黃豆粉和蛋白胨作為氮源時，發(fā)酵液的抑菌活性最高?？赡苁且驗?，黃豆粉中除了有微生物需要的氮源外，還有一些其它有利于放線菌活性物質(zhì)合成的復(fù)雜化合物。因此，選擇黃豆粉和蛋白胨作為氮源。

2.1.3碳源、氮源的正交實驗

根據(jù)單因素實驗篩選出的最佳碳源和氮源設(shè)計正交實驗，正交實驗的因素與水平見表1，正交實驗結(jié)果見表2。

圖2　氮源對發(fā)酵液抑菌活性的影響

表1正交實驗的因素與水平/%

Tab.1　Factors and levels of orthogonal experiment/%

表2正交實驗結(jié)果

Tab.2　Results of orthogonal experiment

從表2可看出，在7#的碳氮源配比下，發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最高。因此，放線菌F03的最適培養(yǎng)基為葡萄糖30 g、蔗糖10 g、黃豆粉10 g、蛋白胨10 g、K2HPO40.3 g、NaCl 1 g、CaCO32 g、蒸餾水1 000 mL。

2.2發(fā)酵條件的篩選

2.2.1發(fā)酵液初始pH值的篩選(圖3)

由圖3可知，發(fā)酵液初始pH值對發(fā)酵液的抑菌活性影響顯著。在酸性條件下不適合活性產(chǎn)物的合成，抑菌活性較低；在偏堿性條件下，抑菌活性較高，當(dāng)發(fā)酵液初始pH值為8時，抑菌圈直徑最大。因此，發(fā)酵液的最佳初始pH值為8。

圖3　發(fā)酵液初始pH值對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.2.2發(fā)酵時間的篩選(圖4)

圖4　發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，活性代謝產(chǎn)物不斷增多，發(fā)酵液的抑菌活性不斷升高；到第7 d時，發(fā)酵液的抑菌活性達(dá)到最高；但隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長，發(fā)酵液的抑菌活性呈下降趨勢，即代謝產(chǎn)物的活性不斷降低。因此，選擇7 d為最佳發(fā)酵時間，不僅可以節(jié)約成本，還可以提高活性產(chǎn)物含量。

2.2.3發(fā)酵溫度的篩選(圖5)

圖5　發(fā)酵溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖5可知，在24～32 ℃范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌活性先升高后降低，在28 ℃時達(dá)到最高。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.2.4搖床轉(zhuǎn)速的篩選(圖6)

圖6　轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖6可知，搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液的抑菌活性有一定的影響。在搖床轉(zhuǎn)速為100 r·min-1時，發(fā)酵液的抑菌活性最低，可能是因為，微生物在合成活性代謝產(chǎn)物時需要大量氧氣，若搖床轉(zhuǎn)速太慢，所提供的氧氣量較少，不利于合成活性產(chǎn)物。隨著搖床轉(zhuǎn)速的加快，抑菌活性升高，但搖床轉(zhuǎn)速超過140 r·min-1后，繼續(xù)加快轉(zhuǎn)速，抑菌活性反而降低。因此，選擇最佳搖床轉(zhuǎn)速為140 r·min-1。

2.2.5接種量的篩選(圖7)

圖7　接種量對發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖7可知，若接種量太少，發(fā)酵液的抑菌活性較低，這是由于，菌體太少，產(chǎn)生的活性物質(zhì)相應(yīng)較少；隨著接種量的增加，抑菌活性先升高后降低，在7%時達(dá)到最高。這可能是由于，菌株量過多，大部分營養(yǎng)成分用于前期的菌體生長，以至于后期代謝產(chǎn)物的合成受到影響。因此，選擇最佳接種量為7%。

2.3發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)的研究

2.3.1抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性(圖8)

圖8　抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

由圖8可知，發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)在60 ℃和100 ℃下均比較穩(wěn)定。雖然在100 ℃下放置一段時間后抑菌活性稍有下降，但總體來說，抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較好。

2.3.2抑菌活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性(圖9)

圖9　抑菌活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性

由圖9可知，pH值對發(fā)酵液抑菌活性影響不大，發(fā)酵液的抑菌活性僅在pH值為1、3時稍低。因此，發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性較好。

2.3.3Doskochilova溶劑系統(tǒng)紙層析測定結(jié)果(圖10)

由圖10可看出，發(fā)酵液中抑菌活性成分在第5和第6溶劑系統(tǒng)，即正丁醇飽和的濃度為0.5 mol·L-1、pH值為7的磷酸緩沖液和正丁醇飽和的內(nèi)含2%對甲基苯磺酸的水中的Rf值比較大，均在0.9左右。其它溶劑系統(tǒng)的Rf值都比較小，有的甚至為0。參照經(jīng)典的抗生素紙色譜，初步推斷發(fā)酵液中的抑菌活性成分是一種大極性的水溶性抗生素。

圖10發(fā)酵液的Doskochilova溶劑系統(tǒng)的Rf值

Fig.10TheRfvalues of the fermentation broth in Doskochilova solvent system

3結(jié)論

通過單因素實驗和正交實驗確定了魚腥草內(nèi)生放線菌F03的最佳培養(yǎng)基為：葡萄糖30 g，蔗糖10 g，黃豆粉10 g，蛋白胨10 g，K2HPO40.3 g，NaCl 1 g，CaCO32 g，蒸餾水1 000 mL。最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵液初始pH值8，發(fā)酵時間7 d，發(fā)酵溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速140 r·min-1，接種量7%。發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較好，發(fā)酵液中的抑菌活性成分是一種大極性的水溶性抗生素。

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Optimization of Fermentation Conditions forEndophyticActinomyceteF03 fromHouttuyniaCordataand Preliminary Study on Antibacterial Active Substances

YU Zhe,ZHANG Shuang

(CollegeofPharmacy,ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Connerce,Xianyang712000,China)

Abstract：F03 is an Endophytic actinomycete with strong antibacterial activity,which was separated from Qinling Mountains wild Houttuynia cordata root.Using S.aureus as an indicator bacterium,single factor experiment and orthogonal experiment were used to optimize the carbon source,nitrogen source of the medium and fermentation conditions.The antibacterial active substances of the fermentation broth was studied.The optimal culture medium was as follows:glucose 30 g,sucrose 10 g,soybean powder 10 g,peptone 10 g,K2HPO4 0.3 g,NaCl 1 g,CaCO3 2 g,distilled water 1 000 mL.The optimal fermentation conditions were as follows:initial pH value of fermentation broth 8,fermentation time 7 d,fermentation temperature 28 ℃,shaking speed 140 r·min-1,inoculum 7%.The antibacterial active substances had good thermal stability and acid-base stability.The results of paper chromatography of Doskochilova solvent systems showed the main antibacterical active substance to S.aureus was water-soluble metabolite.

Keywords：Endophytic actinomycete;optimal culture medium;fermentation condition;optimization;Houttuynia cordata;antibacterial active substance

中圖分類號：TQ 920.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)02-0050-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.02.011

作者簡介：于哲(1989-)，女，陜西三原人，助教，研究方向：天然藥物化學(xué)，E-mail：529741506@qq.com。

收稿日期：2015-11-02