閆偉紅，馬玉寶，陳　云，王　凱，孟慶偉，張晶然

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草原研究所/農(nóng)業(yè)部牧草資源與利用重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特　010010； 2.曲阜

師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜　273165； 3.內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特　010010；

4.呼和浩特職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特　010010)

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干旱脅迫對老芒麥DNA表觀遺傳變化的MSAP分析

閆偉紅1，馬玉寶1，陳云2，王凱1，孟慶偉3，張晶然4

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草原研究所/農(nóng)業(yè)部牧草資源與利用重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010； 2.曲阜

師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜273165； 3.內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010；

4.呼和浩特職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010)

摘要：經(jīng)田間旱作選育發(fā)現(xiàn)，老芒麥物候期較長、植株高大、葉量豐富、穗大、牧草產(chǎn)量高、抗逆性較強、適應(yīng)北方干旱與半干旱氣候條件生長。試驗采用土壤模擬干旱脅迫方法，處理18號和153號優(yōu)質(zhì)老芒麥材料，并對其基因組DNA進(jìn)行甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)分析。結(jié)果表明：老芒麥基因組中約有58.2%～85.5%的 CCGG位點發(fā)生了胞嘧啶甲基化；隨著干旱處理強度的增加，基因組DNA發(fā)生甲基化變化的位點的比率持續(xù)上升；甲基化水平及狀態(tài)變化存在材料差異性。由此推論，DNA去甲基化是植物耐旱機制的一部分。

關(guān)鍵詞：老芒麥；MSAP；干旱脅迫；DNA甲基化

表觀遺傳指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變，即基因型未發(fā)生變化而表型卻發(fā)生了改變，是一種DNA序列外的遺傳方式[1]。DNA甲基化作為其中一種重要方式在外源基因防御、基因表達(dá)調(diào)控、個別基因表達(dá)模式的遺傳等途徑中起著重要的作用[2]。脅迫條件下，核基因組胞嘧啶和腺嘌呤上可增加或減少甲基基團(tuán)，修飾并未改變DNA序列，但影響了位點理化性質(zhì)，形成了“表觀座位”,通過改變?nèi)旧|(zhì)空間構(gòu)象、基因表達(dá)產(chǎn)生“表觀性狀”[3]。這種現(xiàn)象雖然具有可逆性，但DNA甲基化比較穩(wěn)定，一旦形成將可以延續(xù)若干個世代。由于其隨機性變異較小，因而這種表觀遺傳改變可能引起脅迫誘導(dǎo)的基因進(jìn)化[4-6]。

甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)是改良的AFLP技術(shù)[7]，由2種對甲基化敏感程度不同的限制性內(nèi)切酶HpaⅡ和MspⅠ對5′-CCGG位點甲基化特異性切割，因其能夠有效檢測出樣品DNA中大量的甲基化位點，多態(tài)性高，引物設(shè)計簡單，無需知道所分析的DNA序列，即可對全基因組范圍內(nèi)胞嘧啶甲基化程度進(jìn)行分析，又能檢測DNA片段特異性位點甲基化狀態(tài)的特性[8]。利用該技術(shù)，前人研究了多種植物在鹽、重金屬、干旱、低溫脅迫、病原物侵染等逆境條件下的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)在逆境條件下DNA甲基化的程度和狀態(tài)均會發(fā)生改變[9]。目前，眾多國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)用此技術(shù)檢測了黑麥、水稻、小麥、棉花、蘿卜、銀杏、毛竹、高粱、油菜、石斛、辣椒等植物的甲基化狀態(tài)[9-19]。

老芒麥(Elymussibiricus)，別名西伯利亞野麥草，是披堿草屬的模式種[20]，多年生疏叢型中旱生植物，在年降水量為400～500 mm的地區(qū)，可行旱地栽培。大量研究表明，老芒麥具有較高的粗蛋白含量和消化率，較好的適口性，易栽培，適應(yīng)性強，在建造人工放牧草地方面價值較高；嚴(yán)重旱災(zāi)時仍獲33.33 kg/hm2干草的高產(chǎn)[21,22]。試驗將對經(jīng)多年田間旱作評價發(fā)現(xiàn)物候期較長、植株高大、葉量豐富、穗大、牧草產(chǎn)量高、抗逆性較強、遺傳多樣性豐富[23]、適應(yīng)北方干旱與半干旱氣候條件生長的老芒麥幼苗種質(zhì)材料進(jìn)行抗旱性分子機制研究，進(jìn)一步探討干旱脅迫下老芒麥幼苗基因組 DNA甲基化水平和狀態(tài)的變化及規(guī)律，為從 DNA水平上揭示老芒麥對干旱脅迫響應(yīng)機制提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料培育與干旱處理

供試?yán)厦Ⅺ湶牧?8號來源于新疆伊犁州特克斯縣城北種牛場，153號來源于山西右玉。

供試材料挑選均勻一致的種子種植到直徑18 cm的花盆中?？刂茥l件為光照14 h/26℃，黑暗10 h/18 ℃，相對濕度均為50%，溫室正常生長，生長期間按常規(guī)進(jìn)行統(tǒng)一管理，幼苗材料長至8～10 cm時開始處理。采用盆栽法模擬土壤干旱進(jìn)行處理[24]，在處理前3 d對所有材料進(jìn)行澆水，使每盆土壤處于飽和含水狀態(tài)，以正常澆水(土壤含水量保持在38.877±2.25%)為對照(處理時間為0 d)，干旱處理時間為4、6、8 d。取對照及不同處理的幼苗進(jìn)行DNA的提取與MSAP分析，取樣時間為早晨8∶00～9∶00。

1.2MSAP分析

基因組DNA的提取采用改良的CTAB法[25，26]?；蚪MDNA的酶切、連接、預(yù)擴增及選擇性擴增，均采用付勝杰等[27]建立的小麥MSAP反應(yīng)體系及程序。雙酶切組合為EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ，接頭和預(yù)擴增引物序列(表1)。

酶切反應(yīng)體系( 40 μL)500 ng模板DNA，15U EcoR，10U HpaⅡ(或MspⅠ)，4 μL 10× T buff，0.8 μL BSA反應(yīng)混合液在37℃保溫3 h，然后80℃滅活20 min，-20℃保存?zhèn)溆?。向上述反?yīng)液中，加入連接反應(yīng)體系(50 μL)70U T4 DNA 連接酶，1.5 μL EcoRⅠ接頭，1.5 μL HpaⅡ/ MspⅠ接頭，1 μL DNA連接酶Buffer，1 μL BSA，16℃連接過夜，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

預(yù)擴增反應(yīng)體系40 μL， 包括酶連產(chǎn)物稀釋液4 μL，10× PCR Buffer 4 μL，10 mmol/μL dNTP 1μL，預(yù)擴增引物E1和H1(表1)各1.5 μL，1.5 UTaqDNA 聚合酶，以94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 1 min循環(huán)29次，擴增產(chǎn)物備用。

選擇性擴增反應(yīng)體系20 μL，為稀釋20倍的預(yù)擴增產(chǎn)物2 μL，2 μL 10×PCR buff，10 mmol/μL dNTP 0.7 μL，選擴引物E2和HM2均是50 ng，0.5 UTaqDNA聚合酶。PCR 程序為94℃ 30 s， 65℃(每個循環(huán)下降0.7℃) 30 s，72℃ 1 min，共11個循環(huán)，接著94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，23個循環(huán)。變性后的產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳結(jié)束銀染顯色。

表1　試驗所用接頭和引物序列

1.3數(shù)據(jù)處理

基于MSAP方法的原理[28]HpaⅡ和MspⅠ對5′-CCGG-3′位點甲基化特異性切割的反應(yīng)不同，前者能切割無甲基化和單鏈DNA甲基化，后者能切割無甲基化和內(nèi)甲基化(雙鏈DNA內(nèi)部甲基化)。因此，對酶切片段進(jìn)行MSAP分析能夠反應(yīng)酶切位點的甲基化狀態(tài)及程度，根據(jù)這一原理以及所做的試驗可得出同一DNA分別用 HpaⅡ和MspⅠ酶切后進(jìn)行選擇性擴增，在聚丙烯酰胺凝膠電泳分析膠上能檢測出4種甲基化類型(圖1)，Ⅰ.H、M均無帶，即該位點發(fā)生了雙鏈外部甲基化；Ⅱ.H無帶、M有帶，即該位點發(fā)生了雙鏈內(nèi)部甲基化，即為全甲基化；Ⅲ.H有帶、M無帶，即該位點發(fā)生了單鏈外部甲基化，即為半甲基化；Ⅳ.H、M均有帶，即該位點無甲基化發(fā)生。通過這些條帶的比對，可得出不同樣品 DNA甲基化狀態(tài)的變化情況。

將凝膠上有帶的地方標(biāo)“1”，無帶的地方標(biāo)“0”，將凝膠上的條帶轉(zhuǎn)化為“1,0”矩陣后，分析其甲基化水平。

2結(jié)果與分析

2.1干旱脅迫對老芒麥DNA甲基化水平變化的影響

MSAP分子標(biāo)記分析表明，經(jīng)干旱脅迫后幼苗期的18號與153號材料的總DNA甲基化狀態(tài)有一定差異，基因組CCGG位點發(fā)生的甲基化方式基本同時出現(xiàn)全增或全減的總甲基化和全甲基化(表2、3)。

2.2干旱脅迫后老芒麥基因組DNA甲基化水平變化狀況

以24對選擇性引物(表2)進(jìn)行擴增，篩選出多態(tài)性豐富、重復(fù)性較好的15對引物，共擴增出多態(tài)性條帶475條(表3)，18號和153號材料甲基化總帶數(shù)介于255～340，平均為304條，MSAP百分率介于58.2%～85.5%，平均為64%，其中,全甲基化百分率介于34.2%～45.5%，平均為39.9%，干旱處理0、4、6、8 d的MSAP(%)均值依次為57.6%，64.1%，69%，77.6%。隨著處理時間的增加，土壤干旱脅迫能導(dǎo)致老芒麥幼苗基因組DNA胞嘧啶甲基化水平的增加，但是全甲基化率低于半甲基化率。

圖1　選擇性擴增的凝膠電泳圖譜Fig.1　Gel electrophoresis atlas by selective amplification注：M.100bp DNA ladder；泳道從左往右依次為18號干旱處理0、4、6、8，153號干旱處理0、4、6、8 d；圖中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 分別對應(yīng)表2中的4種條帶類型

幼苗期干旱脅迫處理材料的DNA甲基化水平變化結(jié)果表明(表 2)，與對照相比18和153號的幼苗干旱脅迫處理后甲基化程度(以MSAP%為標(biāo)準(zhǔn))均有所增加，但增加程度不同，說明干旱脅迫對耐旱老芒麥幼苗甲基化程度有一定影響。2份材料甲基化率有所上升，而全甲基化率是先下降后上升，但是18號半甲基化率一直上升，而153號先上升后下降。18號材料的DNA甲基化水平脅迫前后的增幅大于153號材料，表明干旱脅迫誘導(dǎo)的DNA甲基化水平變化具有材料特異性。

表2　老芒麥干旱脅迫處理下的DNA甲基化水平

2.3干旱脅迫對老芒麥DNA甲基化狀態(tài)變化的影響

與對照相比，不同時間干旱脅迫的老芒麥幼苗基因組DNA甲基化帶型變化有3類共11種帶型(表3)：A類為單態(tài)性條帶，即處理與對照具有相同的甲基化位點，表明干旱處理未對這類位點的甲基化狀態(tài)造成影響；B、C均為多態(tài)性條帶，即處理組具有與對照組不同的甲基化位點，表明CCGG位點在干旱脅迫后甲基化狀態(tài)發(fā)生了改變，其中，B類為甲基化帶，即干旱脅迫導(dǎo)致老芒麥幼苗基因組DNA甲基化水平增加；C類為去甲基化帶，即干旱脅迫導(dǎo)致老芒麥幼苗基因組DNA甲基化水平下降(表3)。干旱脅迫4，6和8 d的老芒麥幼苗材料MSAP分析所得的B型位點數(shù)分別為33、57、93，分別占總擴增條帶數(shù)的7.3%，12.8%和21.4%；干旱脅迫4，6和8 d的老芒麥幼苗材料MSAP分析所得的C型位點數(shù)分別為3、7、7，分別占總擴增條帶數(shù)的0.7%，1.6%和1.6%。相較于對照，干旱脅迫4，6和8 d的老芒麥幼苗材料總甲基化多態(tài)性分別為8%，14.4%和23%。結(jié)果表明，老芒麥幼苗基因組DNA甲基化多態(tài)性水平隨著干旱脅迫處理時間的增加而增加。其中，發(fā)生甲基化的位點數(shù)隨著干旱脅迫處理時間的增加而升高，但是干旱誘導(dǎo)的去甲基化位點數(shù)目先增加之后變化不大。玉米冷脅迫、水稻冷處理、棉花鹽脅迫均使其基因組DNA發(fā)生了去甲基化[19]。由此證明，去甲基化可能是作為受環(huán)境因子調(diào)控的許多基因的公共開關(guān)，或者去甲基化可能是通過改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而提高植物的耐逆性[19]。

表3　干旱脅迫下老芒麥DNA甲基化狀態(tài)

3討論與結(jié)論

研究表明，DNA甲基化在植物生長發(fā)育中起重要作用，其甲基化狀態(tài)異常會導(dǎo)致多種植物形態(tài)學(xué)變異或生理特性變化，可以影響植物株高、花器官發(fā)育、生育期、抗病性以及應(yīng)對環(huán)境脅迫等[29-33]。Aina 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬(Ni2+、Cd2+、Cr6+) 脅迫處理可誘導(dǎo)植物根部特定DNA 序列發(fā)生去甲基化，而小麥幼苗在受到鹽害脅迫時，葉片和根的甲基化水平均會上升。楊蓓等[28]通過MSAP 分子標(biāo)記檢測表明，節(jié)節(jié)麥幼苗期的SL-1 和T-27經(jīng)干旱處理和對照相比較，干旱處理后都能夠引起DNA甲基化的增加；SL-1 的葉片甲基化水平明顯提高，而材料T-27的根部甲基化水平增加。研究表明，老芒麥幼苗在土壤模擬干旱脅迫條件下，基因組甲基化水平與模式均發(fā)生了明顯變化，對照組老芒麥MSAP(%)平均為57.6%，略高于其他高等植物基因組中大約20%～50%胞嘧啶的甲基化狀態(tài)[34～37]；脅迫處理材料甲基化程度較對照組均增加，但增加幅度不同，以此調(diào)控某些基因的表達(dá)來響應(yīng)干旱脅迫。

通過對土壤干旱脅迫下老芒麥幼苗基因組DNA甲基化模式的分析，發(fā)現(xiàn)干旱處理和對照之間甲基化帶型的變化以甲基化帶型模式為為主。隨著干旱處理強度的增加，基因組DNA發(fā)生甲基化變化的位點的比率持續(xù)上升，這與其他逆境脅迫下的DNA甲基化模式變化趨勢一致[9]。

通過 MSAP分析發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫后幼苗期的18號與153號2個材料的總DNA甲基化狀態(tài)有一定差異，18號的DNA甲基化水平脅迫前后的增幅大于153號材料，檢測發(fā)現(xiàn)基因組CCGG位點發(fā)生的甲基化方式基本同時出現(xiàn)全增或全減的總甲基化和全甲基化。不同時間土壤脅迫下老芒麥幼苗基因組中的胞嘧啶甲基化存在差異，由此推測，DNA去甲基化是植物耐旱機制的一部分，為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。后續(xù)研究中還需要更多包含甲基化修飾的5′- CCGG- 3′序列的分離和基因功能分析，才能更深入地探討干旱脅迫下老芒麥植物基因組DNA的甲基化及逆境適應(yīng)的機制。

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MSAP analysis of epigenetic changes ofElymussibiricusunder drought stress

YAN Wei-hong1，MA Yu-bao1，CHEN Yun2，WANG Kai1，MENG Qing-wei3，ZHANG Jing-ran4

(1.InstituteofGrasslandResearchofCAAS/KeyLaboratoryofGrasslandResourcesandUtilization，MinistryofAgriculture,Hohhot010010，China；2.CollegeofLifeScience，QufuNormalUniversity，Qufu273165，China；3.InnerMongoliaBusinessandTradeVocationalCollege，Hohhot010010，China； 4.HohhotVocationalCollege，Hohhot010010，China)

Abstract：The genomes of two Elymus sibiricus materials under simulate drought stress were analyzed by using methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) technique. Results showed that 58.2% to 85.5% of cytosine methylation were in CCGG sequences in genome. The levels of DNA methylation and methylation polymorphism increased gradually along with the enhancement of drought stress. The level and pattern of DNA methylation were different among materials. It suggested that de-methylation could be a part of the resistant mechanism of plants response to drought-stress and could be used in further research work.

Key words：Elymus sibiricus;MSAP；drought-stress；DNA methylation

中圖分類號：Q 945.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5500(2016)01-0001-06

作者簡介：閆偉紅(1979-)，女，內(nèi)蒙古赤峰人，博士,副研究員，研究方向為牧草種質(zhì)資源評價利用與育種。

基金項目：國家青年自然科學(xué)基金“不同緯度黃花苜蓿表觀遺傳多樣性與低溫脅迫下DNA表觀遺傳變化分析(31302017)”，中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目“黃花苜蓿遺傳特性和低溫下轉(zhuǎn)錄組與小RNA組分析(1610332015007、1610332014014)”資助

收稿日期：2015-06-18； 修回日期：2015-12-30

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