廖宗甄， 孫彩云， 王曉愛， 楊國坤， 潘曉賦， 楊君興*， 李文笙*

(1. 有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)深圳研究院，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州510275； 2. 遺傳資源與進(jìn)化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院昆明動物研究所，昆明650223)

撫仙金線鲃kisspeptin基因的克隆及組織表達(dá)特性

廖宗甄1， 孫彩云1， 王曉愛2， 楊國坤1， 潘曉賦2， 楊君興2*， 李文笙1*

(1. 有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)深圳研究院，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州510275； 2. 遺傳資源與進(jìn)化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院昆明動物研究所，昆明650223)

撫仙金線鲃Sinocyclocheilustingi是云南撫仙湖的特有種，雖已突破其人工繁殖技術(shù)，但在塘養(yǎng)環(huán)境下不能自然繁衍。kiss1基因編碼的神經(jīng)多肽kisspeptin被認(rèn)為是下丘腦-垂體-性腺軸的重要調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)控促性腺激素釋放激素、促性腺激素等激素的分泌參與到生殖調(diào)控中。本研究采用反轉(zhuǎn)錄PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)在撫仙金線鲃中克隆出編碼kisspeptin的2個基因kiss1和kiss2的cDNA，其中kiss1的開放閱讀框長度為351 bp，編碼116個氨基酸；kiss2的開放閱讀框長度為369 bp，編碼122個氨基酸。反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示，kiss1在撫仙金線鲃雌雄個體中均是腸道的表達(dá)量最高；kiss2表達(dá)量最高的組織在雄性和雌性中不同，雄性為腸道，雌性則是下丘腦和全腦。為進(jìn)一步探究kiss1和kiss2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及垂體中的分布，本研究中將撫仙金線鲃的腦部分為8個部分進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，結(jié)果顯示，雄性脊髓和垂體中的kiss1表達(dá)量較高，雌性垂體中的kiss1表達(dá)量最高，其次是視頂蓋；kiss2在雌性和雄性中均在下丘腦的表達(dá)量最高。本研究的結(jié)果為撫仙金線鲃人工繁殖提供了更多探索的方向。

撫仙金線鲃；kisspeptin；kiss1；kiss2；克??；組織表達(dá)特性

Kisspeptin是由KISS1/kiss1基因編碼的神經(jīng)多肽，最初是在人類黑色素瘤細(xì)胞中作為黑色素瘤轉(zhuǎn)移抑制因子而被發(fā)現(xiàn)(Leeetal.，1996)。研究發(fā)現(xiàn)，kisspeptin不僅參與生殖調(diào)控(de Rouxetal.，2003；Gottschetal.，2004；Lapattoetal.，2007；Colledgeetal.，2009)，并且對機(jī)體的代謝也有重要作用。Kisspeptin包括kisspeptin-145、kisspeptin-54、kisspeptin-14、kisspeptin-13、kisspeptin-10。熱帶爪蟾Xenopus(Silurana)tropicalis中主要為kisspeptin-14、kisspeptin-12、kisspeptin-10，硬骨魚類中主要是kisspeptin-10(Akazomeetal.，2010)。哺乳動物中編碼kisspeptin的kiss基因只有1種——kiss1，熱帶爪蟾有3種kiss基因，分別為kiss1a、kiss1b和kiss2，硬骨魚類有kiss1和kiss2 兩種基因，但并非所有硬骨魚類都同時含有kiss1和kiss2，黑斑鲀Tetraodonnigroviridis和三棘魚Gasterosteusaculeatus就只含有kiss2(Akazomeetal.，2010)。

哺乳動物中，kisspeptin的合成神經(jīng)元主要分布在腹側(cè)腦室旁核(the anteroventral periventricular nucleus， AVPV)和弓狀核(the arcuate nucleus， ARC)(Lehmanetal.，2010)。硬骨魚類中，kisspeptin主要分布在2個區(qū)域：松果體韁(habenula)和視前葉-下丘腦區(qū)(preoptic-hypothalamic)。與哺乳動物kisspeptin的作用相似，硬骨魚類kisspeptin也與促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)的活動相關(guān)。成熟青鳉OryziaslatipesGnRH3神經(jīng)元末端可能可以接收來自下丘腦或松果體韁的kiss1神經(jīng)元突出的信號，從而調(diào)節(jié)自身的電活動(Zhaoetal.，2013)。在斑馬魚Daniorerio中發(fā)現(xiàn)kiss2-免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維和視前葉的GnRH3神經(jīng)元有緊密聯(lián)系(Servilietal.，2011)。kiss2在腦區(qū)廣泛分布，表示kiss2可能存在調(diào)節(jié)GnRH以外的功能。金魚Carassiusauratus的kiss1除了在腦區(qū)中表達(dá)外，在腸道、腎臟、脂肪、鰓中都有表達(dá)，其中在腸道中表達(dá)量最高(Yangetal.，2010)。

撫仙金線鲃Sinocyclocheilustingi隸屬于鯉形目Cypriniformes鯉科Cyprinidae金線鲃屬Sinocyclocheilus，是僅分布在云南省撫仙湖的一種季節(jié)性洞穴魚類(楊君興，陳銀瑞，1995)。由于外來物種入侵和過度捕撈，其種群衰退嚴(yán)重，目前，湖體種群數(shù)量稀少，僅有少量個體存活在沿湖的龍?zhí)吨?楊君興，陳銀瑞，1995；潘曉賦等，2009；王偉營等，2011)。為保護(hù)這一珍稀物種，恢復(fù)其野生種群，探索其人工繁殖技術(shù)至關(guān)重要。至2009年，撫仙金線鲃人工繁殖取得成功，并獲得了較高的苗種存活率(潘曉賦等，2009)。但撫仙金線鲃在塘養(yǎng)環(huán)境下仍不能實(shí)現(xiàn)自然繁衍，類似的現(xiàn)象也常見于其他魚類，可能是其生殖功能紊亂所致。因此，本研究擬通過研究撫仙金線鲃生殖調(diào)控相關(guān)因子kisspeptin基因的克隆及表達(dá)特性，為進(jìn)一步探索塘養(yǎng)環(huán)境對撫仙金線鲃生殖功能的影響及為撫仙金線鲃人工繁殖技術(shù)提供更多的研究思路。

1 材料和方法

1.1 材料

撫仙金線鲃由中國科學(xué)院昆明動物研究所珍稀魚類保育研究基地提供。取樣時間為7月。實(shí)驗(yàn)用魚在光照、黑暗各12 h的循環(huán)水中馴養(yǎng)1周，健康且性成熟的雄魚和雌魚各6尾，體長12～15 cm，分為2組。實(shí)驗(yàn)時，撫仙金線鲃經(jīng)丁香酚麻醉后斷頭處死，迅速取出相應(yīng)組織，放入裝有1.5 mL RNase free(Invitrogen)的EP管中，立即放入液氮，然后轉(zhuǎn)至-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.2kiss1和kiss2基因的cDNA克隆 使用Trizol法(Invitrogen， Life Technologies)提取撫仙金線鲃的全腦總RNA，再使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen， Life Technologies)進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成，分別用設(shè)計(jì)好的兼并引物擴(kuò)增kiss1和kiss2的中間片段，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。根據(jù)中間片段克隆的結(jié)果，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增3’端和5’端片段的特異性引物，并結(jié)合做cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)所需的接頭引物AP和AAP，進(jìn)行kiss1和kiss2的3’-RACE和5’-RACE的擴(kuò)增。用E.Z.N.A膠回收試劑盒(OMEGA， Bio-Tek)將產(chǎn)物回收后純化。在Ligation High連接酶(TOYOBO)的作用下，把純化得到的DNA片段連接到PCR2.1質(zhì)粒(Invitrogen， Life Technologies)上進(jìn)行測序分析。

表1 撫仙金線鲃kiss1和kiss2基因cDNA克隆和反轉(zhuǎn)錄PCR引物Table 1 Primers for Sinocyclocheilus tingi kiss1 and kiss2 cloning and reverse transcription PCR

1.2.3 RT-PCR法檢測kiss1和kiss2基因的組織表達(dá)特性 表達(dá)特性分析包括組織分布和腦八分組織分布兩部分，其中組織分布包括15個組織，分別為垂體、下丘腦、腦(不含垂體和下丘腦)、脊髓、鰓、心臟、肝、胃、腸道、脂肪、肌肉、腎、頭腎、脾臟和性腺(雄性為精巢，雌性為卵巢)；腦八分組織分布包括8個組織，分別為嗅球、端腦、視頂蓋、小腦、延髓、脊髓、下丘、垂體。使用Trizol法提取各組織的RNA， M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA第一條鏈合成后，以 kiss1-QT-F和kiss1-QT-R，kiss2-QT-F和kiss2-QT-R為引物，各組織的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，β-actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR，PCR的程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。在每個PCR循環(huán)延伸階段收集一次熒光，結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，并根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，使用比較Ct法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 通過測序拼接得到kiss1和kiss2序列，再通過NCBI上的ORF finder確定開放閱讀框(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)，使用Clustal W2對不同物種的kiss1和kiss2的氨基酸序列作同源性分析(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。使用SignalP 4.1Server分析2種類型kisspeptin的信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。

2 結(jié)果

2.1kiss1和kiss2基因cDNA全長及氨基酸序列

將撫仙金線鲃kiss1和kiss2的序列提交至GenBank，登錄號分別為KU500628和KU500629。kiss1基因cDNA全長466 bp，其中開放閱讀框長度為351 bp，編碼116個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中第1～15位氨基酸組成的多肽為信號肽，而第89～98位氨基酸序列為預(yù)測的核心序列YNLNSFGLRY-NH2。撫仙金線鲃kiss2基因cDNA全長528 bp，其中開放閱讀框長度為369 bp，編碼122個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中第1～19位的氨基酸組成的多肽為信號肽，第83～92位氨基酸序列為預(yù)測的核心序列FNYNPFGLRF-NH2。

表2 撫仙金線鲃kiss1氨基酸序列和其他物種的同源性比較Table 2 kiss1 amino acid sequences comparison ofSinocyclocheilus tingi with different species

2.2kiss1和kiss2基因表達(dá)特性

基因的組織表達(dá)分析結(jié)果顯示，kiss1和kiss2基因主要在胃、腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。kiss1 基因在雄性和雌性腸道中的表達(dá)量最高，其次是胃。在撫仙金線鲃15個組織中，下丘腦、腦、脊髓、脾臟、脂肪中的kiss1基因表達(dá)量雌性高于雄性，在心臟、胃、腸道中雌性的表達(dá)量低于雄性，在其他組織中的表達(dá)量雌、雄差異不大(圖1)。kiss1基因在腦區(qū)的表達(dá)水平普遍較高，雄性中最高的是脊髓，其次是垂體，而雌性中最高的是垂體，其次是視頂蓋。除在嗅球、端腦和脊髓中kiss1基因的表達(dá)量雄性高于雌性外，其他腦組織中均是雌性高于雄性(圖2)。

撫仙金線鲃15個組織中kiss2基因的表達(dá)分布結(jié)果顯示，雄性中表達(dá)量最高的為腸道，其次為下丘腦；雌性中表達(dá)量較高的為下丘腦和腦，其次是脊髓和性腺。在腦、脊髓和性腺中kiss2基因的表達(dá)量雌性高于雄性，而在下丘腦、肝臟、脾臟、腸道和脂肪組織中，kiss2基因的表達(dá)量雌性均低于雄性，在其他組織中，雌、雄相差不大(圖3)。在撫仙金線鲃腦八分組織中，kiss2基因的表達(dá)量均為雌性高于雄性(圖4)。

總體來看，在性腺中kiss1基因的表達(dá)量較低，而kiss2基因的表達(dá)量相對較高，而這2個基因在鰓、頭腎和腎中的表達(dá)水平都很低。

3 分析與討論

kiss1和kiss2的氨基酸序列同源性分析顯示，2個基因與鯉科魚類的同源性較高，而與其他物種的同源性較低。kiss1和kiss2的核心序列在不同物種中都非常保守，青鳉和斑馬魚中kiss1編碼的蛋白核心序列為YNLNSFGLRY-NH2，kiss2編碼的蛋白核心序列為FNYNPFGLRF-NH2，它們共同的部分為-N-N-FGLR-。撫仙金線鲃的kiss1和kiss2基因預(yù)測的核心序列分別是YNLNSFGLRY-NH2和FNYNPFGLRF-NH2，從序列比對的結(jié)果可知，2個基因的核心序列都與斑馬魚的一致。kiss1編碼的kisspeptin-10中的第3位氨基酸在哺乳動物和兩棲動物中為W，而在魚類中為L。目前只在魚類和兩棲動物中發(fā)現(xiàn)kiss2基因，序列比對可見kiss2的核心序列同樣非常保守，在不同的魚類和兩棲動物中，只有第3位和第7位氨基酸略有不同，而同屬鯉科的幾種魚類中，核心序列完全一致。從以上可知，kiss1和kiss2基因都比較保守。

Kisspeptin作為神經(jīng)多肽多在腦區(qū)表達(dá)，硬骨魚類的kisspeptin主要在松果體和視前葉-下丘腦中表達(dá)(Ogawaetal.，2013)。在本實(shí)驗(yàn)中，從RT-PCR結(jié)果來看，撫仙金線鲃kiss1和kiss2 mRNA在下丘腦、垂體、腦、脊髓這幾個組織中的表達(dá)量都較高，而且在腦部各個分區(qū)都有一定程度的表達(dá)。作為被認(rèn)為和生殖相關(guān)的kisspeptin，在撫仙金線鲃性腺中，kiss1相對表達(dá)量并不高，這與斑馬魚的結(jié)果一致。撫仙金線鲃精巢kiss1的表達(dá)量高于卵巢，這與在金魚和斑馬魚中的結(jié)果一致(Yangetal.， 2010)。除腦區(qū)的表達(dá)外，kiss1和kiss2都有一個非常明顯的分布趨勢，即這2個基因在腸道中的相對表達(dá)量非常高，在金魚和斑馬魚中也發(fā)現(xiàn)kiss1在腸道中表達(dá)量最高，除腸道外，金魚kiss1在腎和肝臟也有較高的表達(dá)量(Yangetal.，2010)。在本實(shí)驗(yàn)中使用的魚正值繁殖期，其性腺成熟系數(shù)(GSI)>0.1%。而在金魚的研究中使用GSI≤0.1%的魚，如前所述，呈現(xiàn)相似的分布趨勢。而且，在南亞野鯪Labeorohita中的研究顯示，kiss1和kiss2在腦、垂體和性腺中的表達(dá)量可能與其性腺發(fā)展周期相關(guān)：在預(yù)備期、排卵前、排卵期和排卵后4個時期中，在雄性性腺中kiss1在減數(shù)分裂時期的表達(dá)量最高，而kiss2則是產(chǎn)卵后表達(dá)量最高。而雌性性腺中，kiss1在排卵期表達(dá)量最高，排卵后表達(dá)量下降，kiss2則沒有出現(xiàn)明顯的下降(Saha & Pradhan，2016)。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能反映kisspeptin在撫仙金線鲃繁殖期的表達(dá)水平。由kisspeptin在腦區(qū)和性腺分布的差異來看，可以推測kisspeptin主要在腦區(qū)起作用，而非直接在性腺起作用。目前關(guān)于kisspeptin的功能研究主要集中在生殖調(diào)控方面，但從kiss1和kiss2在腸道等組織的分布來看，kisspeptin還可能與消化系統(tǒng)的功能相關(guān)。

圖1 撫仙金線鲃kiss1在不同組織中的表達(dá)情況Fig. 1 Tissue distribution analysis of Sinocyclocheilus tingi kiss1 by RT-PCR

圖2 撫仙金線鲃kiss1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及垂體中的表達(dá)情況 (Mean±SE, n=3)Fig. 2 Central nervous system distribution analysis of Sinocyclocheilus tingi kiss1 by RT-PCR (Mean±SE, n=3)

圖3 撫仙金線鲃kiss2在不同組織中的表達(dá)情況 (Mean±SE， n=3)Fig. 3 Tissue distribution analysis of Sinocyclocheilus tingi kiss2 by RT-PCR (Mean±SE， n=3)

圖4 撫仙金線鲃kiss2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及垂體中的表達(dá)情況 (Mean±SE， n=3)Fig. 4 Central nervous system distribution analysis of Sinocyclocheilus tingi kiss2 by RT-PCR (Mean±SE， n=3)

此外，kiss1和kiss2在肝臟和肌肉中都有分布，尤其在雄性的肝臟中。由此推測kisspeptin還可能調(diào)節(jié)撫仙金線鲃的代謝活動。但在魚類中，對kisspeptin的研究主要圍繞其對生殖活動的作用進(jìn)行，對其他功能的關(guān)注較少。在哺乳類中的研究發(fā)現(xiàn)，kiss1r不僅可以調(diào)控生殖活動，還可以影響體質(zhì)量、能量消耗和葡萄糖的平衡(Tolsonetal.，2014)，并且在代謝和生長方面也有一定作用，KISS1-10可以通過cAMP/PKA/PKC以及Ca2+離子信號通路調(diào)節(jié)垂體SLα的釋放(Jiangetal.， 2014)。對青春期大鼠短期禁食可以使下丘腦中kiss1基因的表達(dá)降低，在leptin缺陷的ob/ob小鼠中，下丘腦的kiss1基因表達(dá)水平顯著降低，并且用Leptin對leptin缺陷的小鼠處理，可以使kiss1在下丘腦中表達(dá)水平恢復(fù)到正常水平(Smithetal.，2006)。最近的研究表明，Ⅱ型糖尿病人和糖尿病小鼠的肝臟和血液中kisspeptin1含量都會增加，在肝臟和胰腺對血糖調(diào)節(jié)的回路中，肝臟kisspeptin1可削弱胰島素分泌(Songetal.，2014)。

對撫仙金線鲃kisspeptin基因的克隆發(fā)現(xiàn)，撫仙金線鲃的生殖關(guān)鍵基因kiss存在2種不同形式的基因序列，且在腸道中的表達(dá)量較高，在腦區(qū)的垂體和下丘腦中的表達(dá)量較高，這些結(jié)果為以后開展撫仙金線鲃kisspeptin對生殖和其他生理功能相關(guān)的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Molecular Cloning and Tissue Distribution of Kisspeptin fromSinocyclocheilustingi

LIAO Zongzhen1， SUN Caiyun1， WANG Xiaoai2， YANG Guokun1， PAN Xiaofu2， YANG Junxing2*， LI Wensheng1*

(1. State Key Laboratory of Biocontrol， Institute of Aquatic Economic Animals and Guangdong Province Key Laboratory for Aquatic Economic Animals， Research Institute of Sun Yat-Sen University in Shenzhen， School of Life Sciences，Sun Yat-Sen University， Guangzhou 510275， China; 2. State Key Laboratory of Genetic Resources and Evolution，Kunming Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650223， China)

Sinocyclocheilustingiis an endemic species of Fuxian Lake in Yunnan province. Even though its artificial reproduction is available right now， they can’t reproduce in fishponds. Kisspeptin encoded bykiss1 was considered as an important regulator of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis and took part in reproduction by controlling the releasing of gonadotropin-releasing hormone， gonadotropin， and etc. In the present research we cloned the cDNA ofkiss1 andkiss2 ofS.tingiwith reverse transcription PCR and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The open reading frame ofkiss1 was 351 bp and encoded a polypeptide of 116 amino acid and that ofkiss2 was 369 bp and encoded a 122-amino-acid polypeptide. Reverse transcription PCR analysis showed that the mRNA expression quantity ofkiss1 was the highest in intestine. Likely， the mRNA expression ofkiss2 was the highest in intestine in male and hypothalamus and brain in female. To explore the distribution ofkiss1 andkiss2 in brain， the brain was divided into eight parts for reverse transcription PCR analysis. The result showed that the highest expression ofkiss1 in male was observed in both the spinal cord and the pituitary， which in female was only in the pituitary and followed by the optic tectum. Meanwhile， thekiss2 mRNA got its highest expression in the hypothalamus.

Sinocyclocheilustingi; kisspeptin;kiss1;kiss2; clone; characteristics of tissue distribution

2015-09-08 接受日期：2016-05-11

中山大學(xué)高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目； 深圳市戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目(NYSW20140401010064)； 云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(2012FB183)； 中國科學(xué)院昆明動物研究所“一三五”重大專項(xiàng)(Y206B51181)； 云南省生物多樣性保護(hù)專項(xiàng)資金項(xiàng)目

廖宗甄(1993—)， 碩士研究生， 研究方向：水生生物學(xué)， E-mail:237688797@qq.com

*通信作者Corresponding author， E-mail:yangjx@mail.kiz.ac.cn; lsslws@mail.sysu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20150273

Q959.4;Q78

A

1000-7083(2016)04-0496-07