裴彥宇, 孫井江, 趙顯莉, 賀銀麗, 魏若堯, 高虹

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京　100021)

?

研究報告

利用心臟特異性CYP2E1基因修飾小鼠評價藥物心臟毒性的初步探索

裴彥宇, 孫井江, 趙顯莉, 賀銀麗, 魏若堯, 高虹*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京100021)

【摘要】目的使用兩種心臟特異性CYP2E1基因修飾小鼠來評價藥物西布曲明(sibutramine)的心臟毒性作用，選擇出在評價藥物的心臟毒性中具有更高敏感性的動物模型。方法8周齡雄性Tg(+)型小鼠、sTg(+)型小鼠、野生型C57BL/6小鼠(WT)，各50只，分別隨機分成5組，每組10只，溶媒對照組(灌胃給予純凈飲用水)及4個實驗組(50、100、150、300 mg/kg西布曲明)。給藥過程中進行一般癥狀觀察以及存活率的測定；給藥15 d 后取血并解剖取心臟，測定各組實驗小鼠血生化心臟損傷指標：乳酸脫氫酶(LDH)，肌酸激酶(CK)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)。并進行病理組織學(xué)檢查，免疫組織化學(xué)方法觀察心臟組織縫隙蛋白43(connexin 43，CX43)的表達情況。結(jié)果(1)血生化指標顯示，在給藥劑量50 mg/kg和100 mg/kg時，Tg(+)型小鼠均顯著高于WT型小鼠(P<0.05 或P<0.01)；在給藥劑量50、100和150 mg/kg時，Tg(+)型小鼠均顯著高于sTg(+)型小鼠(P<0.05 或P<0.01)；而在給藥劑量300 mg/kg時，Tg(+)型小鼠均顯著低于WT和sTg(+)型小鼠(P<0.05 或P<0.01)，且sTg(+)型小鼠減小的程度最小。(2)病理組織學(xué)結(jié)果顯示，Tg(+)和WT型小鼠各個給藥組均表現(xiàn)出心臟損傷的跡象。(3)免疫組織化學(xué)染色顯示，隨著給藥劑量的加大，Tg(+)、sTg(+)和WT型三種小鼠CX43在心肌細胞閏盤處的表達數(shù)量均逐漸下降，且染色顏色逐漸變淺；而CX43在心肌細胞閏盤處的表達數(shù)量下降程度和染色顏色變淺程度由高到低分別為，Tg(+)型小鼠，其次是WT型小鼠，sTg(+)型小鼠。結(jié)論Tg(+)型小鼠在評價藥物潛在心臟毒性試驗中可能比WT型小鼠具有更高的敏感性，而sTg(+)型小鼠則是很好的心臟毒性保護模型。

【關(guān)鍵詞】細胞色素P450 2E1；基因修飾；西布曲明；藥物毒性

細胞色素P450 2E1(cytochrome P2E1，CYP2E1)是細胞色素P450混合功能氧化酶系的重要成員之一，參與機體內(nèi)許多內(nèi)外源性物質(zhì)的代謝與活化[1]。CYP2E1主要分布于肝臟，同時在肝外組織如心臟、腎臟等處也有高表達[2]。一直以來，心臟毒性都是藥物臨床前和藥物臨床檢驗和防治的重點，選擇一種理想的藥物評價模型是決定藥物安全性評價效果的關(guān)鍵因素之一[3]。本實驗選用的兩種心臟特異性CYP2E1基因修飾小鼠[(心臟特異性CYP2E1轉(zhuǎn)基因小鼠，α-MHCCYP2E1 transgenic mice，Tg(+)和心臟特異性CYP2E1基因沉默小鼠，α-MHCCYP2E1 silence mice，sTg(+)]，來進行藥物西布曲明心臟毒性評價的初步探索，以期選擇一種敏感性更高的基因修飾動物模型，為評價具有潛在心臟毒性藥物的臨床前安全性尋找一種更加快速、靈敏、準確的動物模型。

1材料與方法

1.1實驗動物

SPF級雄性Tg(+)和sTg(+)各50只，8周齡，20～25 g左右，均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所遺傳中心構(gòu)建；雄性WT 50只，8周齡，SPF級，20～25 g左右，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK (京) 2012-0001】。動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所SPF級環(huán)境中【SYXK(京)2014-002】，溫度范圍22～26℃，相對濕度40%～70%，換氣次數(shù)15次/h，照明>200 lx，12/12h明暗交替，自由進食、飲水。

1.2儀器和試劑

全自動生化分析儀(日本日立公司，7100型)；光學(xué)顯微鏡(Olympus，BX50)；西布曲明(分析純，阿拉丁試劑公司)；兔抗小鼠CX43抗體(Affinity，AF0137)；PV-9001 辣根酶標記抗兔IgG聚合物(中杉金橋，K152708B)；進口羊血清工作液(中杉金橋，15A92605)。

1.3動物分組及給藥方案

8周齡Tg(+)、sTg(+)和WT型小鼠分別隨機分為溶媒對照組、給藥組1、給藥組2、給藥組3、給藥組4，每組10只，ig給藥。各組小鼠給藥組給予西布曲明的劑量分別為給藥組1(50 mg/kg)、給藥組2(100 mg/kg)、給藥組3(150 mg/kg)、給藥組4(300 mg/kg)；溶媒對照組給予等劑量的純凈水，連續(xù)15 d，每日一次，給藥時間為每日9:00～11:00。西布曲明用純凈水溶解，每只動物灌胃體積為0.2 mL/10( g·bw)。

1.4大體觀察和生存率測定

每日定時觀察小鼠的外觀和行為(包括小鼠的精神狀態(tài)、皮膚毛發(fā)、眼睛和黏膜的變化、活動情況、呼吸狀況、死亡情況及其他異常表現(xiàn))、分泌物和排泄物等。末次給藥結(jié)束后，記錄各組小鼠的死亡數(shù)，并計算死亡率。

1.5血液生化學(xué)指標檢測

實驗小鼠末次給藥后，禁食不禁水12～18 h，0.3 %戊巴比妥鈉麻醉后取全血300～500 μL，靜置30～60 min后，離心10 min，取上層血清于日立7100生化自動分析儀上檢測心臟的血液生化學(xué)指標。

1.6心臟組織病理學(xué)檢查

小鼠心臟組織分別經(jīng)4 % 中性甲醛固定、修塊、梯度酒精脫水、石蠟包埋切片(5 μm)，HE染色，封片后光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.7免疫組織化學(xué)檢測

脫蠟、水化組織切片后依次進行抗原修復(fù)、3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶活性、正常羊血清封閉、CX43一抗 (1∶100)、二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、自來水充分沖洗、脫水、透明、封片。2 h 后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1大體觀察和生存率測定

整個實驗過程中各給藥組有不同程度的死亡現(xiàn)象發(fā)生，同時Tg(+)型小鼠在給藥組4(300 mg/kg)時有個別小鼠出現(xiàn)精神萎靡等異?，F(xiàn)象。

在相同飼養(yǎng)條件下，Tg(+)、sTg(+)和WT型小鼠的溶媒對照組、給藥組1(50 mg/kg)、給藥組2(100 mg/kg)、給藥組3(150 mg/kg)均無死亡現(xiàn)象；而給藥組4(300 mg/kg)至給藥結(jié)束時，死亡率分別達到70%、60%、30%(見圖1)。

圖1　300 mg/kg劑量時WT、Tg(+)、sTg(+)型小鼠的生存情況Fig. 1　The survival curves of WT, Tg(+) and sTg(+) mice treated with 300 mg/kg sibutramine

2.2血液生化學(xué)指標檢測

Tg(+)、sTg(+)和WT型小鼠在給藥劑量50 mg/kg和100 mg/kg時，Tg(+)型小鼠的CK、LDH、CK-MB均顯著高于WT型小鼠(P<0.05 或P<0.01，n=10)；在給藥劑量50、100 和150 mg/kg時，Tg(+)型小鼠的各指標均顯著高于sTg(+)型小鼠(P<0.05 或P<0.01，n=10)(表1)。在給藥劑量為300 mg/kg時，Tg(+)型小鼠的CK、LDH、CK-MB均十分顯著低于其自身溶媒對照組(P<0.01，n=3)；并均低于WT和sTg(+)型小鼠(P<0.05或P<0.01，n=3)(表1)。同時結(jié)合三種小鼠的生存率，分析Tg(+)和WT型小鼠在給藥劑量為300 mg/kg時可能發(fā)生了惡病質(zhì)，且Tg(+)型小鼠更為嚴重，而sTg(+)型小鼠尚未完全發(fā)生這種現(xiàn)象，提示Tg(+)型小鼠比WT型小鼠對藥物的心臟毒性作用更為敏感，且sTg(+)型小鼠可能是一個心臟保護模型。

2.3心臟組織病理學(xué)檢測

當給藥劑量為50、100、150 mg/kg時，HE染色可見部分Tg(+)型小鼠出現(xiàn)少數(shù)心肌細胞顆粒變性、空泡變性及嗜酸性變性(見圖2 B1、B2、B3)；當給藥劑量為100、150 mg/kg時，HE染色可見部分WT型小鼠出現(xiàn)少數(shù)心肌細胞顆粒變性或空泡變性(見圖2 A2、A3)；當給藥劑量為300 mg/kg時，HE染色可見幾乎全部WT和Tg(+)型小鼠出現(xiàn)心肌細胞顆粒變性或空泡變性(見圖2 A4、B4)。而溶媒對照組以及sTg(+)型小鼠各個給藥組的心內(nèi)外膜、心肌膜結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維著色均勻，胞界清楚，間質(zhì)未見異常。

2.4免疫組織化學(xué)檢測

Tg(+)、sTg(+)和WT型三種小鼠的溶媒對照組的CX43蛋白在心肌細胞閏盤處的表達均清晰有序，表達數(shù)量多，且染色顏色深；隨著給藥劑量的加大，三種小鼠的CX43抗體在心肌細胞閏盤處的表達數(shù)量均有不同程度的下降，且染色顏色變淺。同時，在相同的給藥劑量下，CX43抗體在心肌細胞閏盤處的表達數(shù)量下降程度和染色顏色變淺程度依次是：Tg(+)型>WT型>sTg(+)型小鼠(見圖3)。

表1　各組小鼠血生化心臟損傷指標±s)

注：相同基因型小鼠與各自溶媒對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；相同給藥劑量時Tg(+)和 sTg(+)分別與WT小鼠比較，#P<0.05,##P<0.01；相同給藥劑量時Tg(+)與sTg(+)比較，▲P<0.05,▲▲P<0.01。

Note.*P<0.05,**P<0.01, compared with the solvent control group in the same genotype of mice.#P<0.05,##P<0.01, the Tg(+) and sTg+ mice compared with the WT mice treated with the same dose of sibutramine.▲P<0.05,▲▲P<0.01, the Tg(+) mice compared with the sTg(+) mice treated with the same dose of sibutramine.

3討論

在新藥研究開發(fā)中，臨床前藥物安全性評價是決定新藥能否進入臨床試驗的關(guān)鍵因素之一。藥物的毒性反應(yīng)是臨床前安全性評價的主要研究內(nèi)容，其中高達26%的毒性反應(yīng)是心血管毒性[4]。目前，外源性藥物導(dǎo)致心臟毒性的作用機制主要有氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和免疫炎癥反應(yīng)等。

CYP2E1是機體參與內(nèi)外源性物質(zhì)催化作用的一類重要的氧化代謝酶，同時產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等過程，進而對機體產(chǎn)生毒性[5]。國內(nèi)外許多研究已將其應(yīng)用于CYP2E11的代謝機制以及與CYP2E11基因有關(guān)的疾病如脂肪性肝病的病理機制研究中[6]，但目前卻鮮見將CYP2E1基因修飾小鼠應(yīng)用于藥物毒性評價中的報道。

西布曲明于1997年上市，主要是通過抑制中樞神經(jīng)細胞對去甲腎上腺素和5-羥色胺的再攝取來降低食欲，達到減肥的效果[7]，因西布曲明具有潛在的心血管系統(tǒng)毒性，而且減肥治療的風險遠大于效益[8]，并于2010年在世界各國相繼撤市。有研究表明，西布曲明灌胃給藥對小鼠的半數(shù)致死量LD50為98.8～125.1 mg/kg[9]，故本實驗采用50、100、150及300 mg/kg 4個給藥劑量來進行探索。

心臟生化損傷指標(LDH、CK、CK-MB)作為心臟特異酶類標志物，其在血清中的活性變化可以反映心臟功能的好壞和心肌細胞結(jié)構(gòu)的完好程度。從本實驗心臟損傷血生化指標結(jié)果來看，在給藥劑量為50 mg/kg和100 mg/kg時，Tg(+)型小鼠的心臟損傷指標最高，而在給藥劑量為300 mg/kg時，Tg(+)型小鼠的心臟損傷指標最低，且均有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，Tg(+)、sTg(+)和WT型三種小鼠在給藥劑量為300 mg/kg時死亡率分別達到70%、60%、30%，提示在給藥劑量為300 mg/kg時，Tg(+)型小鼠的心臟組織已出現(xiàn)嚴重毒性。說明Tg(+)型小鼠能夠更敏感地從血生化指標來反映心臟結(jié)構(gòu)和功能，提示Tg(+)型小鼠比WT型小鼠及sTg(+)型小鼠對藥物的心臟毒性作用更為敏感，且sTg(+)型小鼠可能是一個心臟保護模型。

注：A1-A4：WT型給藥組1、給藥組2、給藥組3、給藥組4；B1-B4：TG(+)型小鼠給藥組1、給藥組2、給藥組3、給藥組4；↑：心肌細胞發(fā)生顆粒變性、空泡變性和嗜酸性變形等病理變化(A2、A3：×200，A1、B1、B2、B3、A4、B4：×100)。圖2　各組小鼠的心臟組織病理學(xué)變化(HE染色)Note. A1-A4: Treatment groups 1, 2, 3 and 4 of WT mice; B1-B4: Treatment groups 1, 2, 3, 4 of TG(+) mice. ↑: Granular degeneration, vacuolization and acidophilic degeneration of cardiomyocytes (A2, A3: ×200，A1, B1, B2, B3, A4, B4: ×100).Fig. 2　Pathological changes of the heart tissue of mice in each group(HE staining)

注：A1-A5：WT型溶媒對照組、給藥組1、給藥組2、給藥組3、給藥組4；B1-B5：TG(+)型溶媒對照組、給藥組1、給藥組2、給藥組3、給藥組4；C1-C5：sTG(+)型溶媒對照組、給藥組1、給藥組2、給藥組3、給藥組4。圖3　各組小鼠心臟組織中CX43的表達(×400)Note. A1-A5: Solvent control group and treatment groups 1, 2, 3, and 4 of the WT mice; B1-B4: Solvent control group and treatment groups 1, 2, 3, and 4 of the TG(+) mice;C1-C5: Solvent control group and treatment groups 1, 2, 3, and 4 of the sTG(+) mice.Fig. 3　Expression of connexin 43 in the mouse heart tissue of each group (×400)

心臟組織HE染色可見Tg(+)和WT型小鼠只有部分的少數(shù)心肌細胞存在病理改變，且sTg(+)型小鼠的心肌結(jié)構(gòu)未見異常。CX43是一種主要存在于心臟組織心室肌的閏盤上的縫隙連接蛋白，其正常表達與分布決定了心臟縫隙連接通道的正常電活動以及心肌的正常舒縮[10]。本實驗選用CX43抗體對各組小鼠的心臟進行免疫組織化學(xué)染色，驗證CX43是否在心臟中表達異常。CX43表達數(shù)量和染色程度的差異證實了CX43在心臟組織中表達數(shù)量的異常與西布曲明引起的心臟毒性有密切關(guān)系，三種小鼠的死亡與心臟系統(tǒng)傳導(dǎo)阻滯引起的心律失常等有關(guān)，且Tg(+)型小鼠對藥物引起的心臟毒性比WT型小鼠更為敏感，而sTg(+)型小鼠則是一個很好的心臟保護模型。

基因修飾動物模型是國內(nèi)外實驗室研究的熱點，本實驗中Tg(+)型小鼠不僅可以更真實地評價藥物的毒性作用，而且相對于WT型小鼠，在具有潛在心臟毒性作用的藥物毒性評價中靈敏性更高，有望在心血管系統(tǒng)的藥物安全性評價中廣泛應(yīng)用，提高藥物臨床前評價結(jié)果與臨床的相關(guān)性，減少臨床用藥風險。

參考文獻

[1]Knockaert L, Descatoire V,Vadrot N, et al. Mitochondrial CYP2E1 is sufficient to mediate oxidative stress and cytotoxicity induced by ethanol and acetaminophen [J]. Toxicol in Vitro, 2011, 25(2): 475-484.

[2]Neafsey P, Ginsberg G, Hattis D, et al. Genetic polymorphism in CYP2E1: population distribution of CYP2E1 activity [J]. Toxicol Environ Health B Crit Rev, 2009, 12(5-6): 362-388.

[3]Pugsley MK, Gallacher DJ, Towart R, et al. Methods in safety pharmacology in focus [J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 2008, 58(2): 69-71.

[4]Foster WR, Chen SJ, He A, et al. A retrospective analysis of toxicogenomics in the safety assessment of drug candidates [J]. Toxicol Pathol, 2007, 35(5): 621-635.

[5]O’Shea D, Davis SN, Kim RB, et al. Effect of fasting and obesity in humans on the 6-hydroxylation of chlorzoxazone: a putative probe of CYP2E1 activity [J]. Clin Pharmacol Ther, 1994, 56(4): 359-367.

[6]Kathirvel E, Chen P, Morgan K, et al. Oxidative stress and regulation of anti-oxidant enzymes in cytochrome P4502E1 transgenic mouse model of non-alcoholic fatty liver [J]. Gastroenterol Hepatol, 2010, 25(6): 1136-1143.

[7]Scheen AJ. Controversy about the cardiovascular safety of sibutramine [J]. Drug Safety, 2010, 33(7): 615-618.

[8]Scheen AJ. Sibutramine on cardiovascular outcome [J]. Diabetes Care, 2011, 34(Suppl 2): S114-119.

[9]Chen GL, Li L, Yan SX, et al. Anti-obesity effect of sibutramine hydrochloride in alimentary obesity rats [J]. Chin J Clin Pharmacol Ther, 2003, 8(1): 55-58.

[10]Kieken F, Mutsaers N, Dolmatova E, et al. Structural and molecular mechanisms of gap junction remodeling in epicardial border zone myocytes following myocardial infarction [J]. Circ Res, 2009, 104(9): 1104-1112.

Exploration of the use of heart-specificCYP2E1 genetically modified mice in evaluation of drug-induced cardiotoxicity

PEI Yan-yu, SUN Jing-jiang, ZHAO Xian-li, HE Yin-li, WEI Ruo-yao, GAO Hong*

(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences ( CAMS) &Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College ( PUMC), Beijing 100021, China)

【Abstract】ObjectiveTo select more sensitive animal model to evaluate the cardiotoxicity of drugs, we used the heart-specific CYP2E1 genetically modified mice (α-MHC CYP2E1 transgenic mice [Tg(+) mice] and α-MHC CYP2E1 silencing transgenic mice [sTg(+) mice] ) to evaluate the drug sibutramine-induced cardiotoxicity. Methods The 8-week old male Tg(+), sTg(+), and C57BL/6 mice (wild type, WT), 50 mice in each group, were randomly divided into 5 groups: the solvent control group (intragastric gavage of pure drinking water), and the four sibutramine (50 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg and 300 mg/kg) treatment groups, respectively. The general condition of the mice was observed and the survival rate was determined during the drug treatment period. At 15 days after the sibutramine administration, the blood biochemical indicators of cardiotoxicity lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), and creatine kinase isoenzyme (CK-MB) were assessed, and then the mice were sacrificed and heart tissue samples were taken for pathological examination and immunohistochemical observation of the expression of connexin 43 (CX43). Results(1) The blood biochemical indicators in the sibutramine 50 mg/kg and 100 mg/kg Tg(+) treated mice were significantly higher than those in the WT mice (P<0.05 or P<0.01), and significantly higher in the 50 mg/kg, 100 mg/kg and 150 mg/kg sibutramine treated Tg(+) mice than in the sTg(+) mice (P<0.05 or P<0.01). However, when the sibutramine was given at a dose of 300 mg/kg, the values of those indicators in the Tg(+) mice were significantly lower than that in the WT and sTg(+) mice (P<0.05 or P<0.01), with the lowest level in the sTg(+) mice. (2) The pathological examination revealed cardiotoxic changes in the Tg(+) and WT mice. (3) The immunohistochemical analysis showed that alongside with the increasing drug dose, the expression of CX43 was decreased in the intercalated disks of cardiomyocytes in the Tg(+), sTg(+) and WT mice, and the color staining intensity was mostly decreased in an order of Tg(+)>WT>sTg(+) mice. Conclusions Tg(+) mice may have a higher sensitivity in the evaluation of potential cardiotoxicity than WT mice, and sTg(+) mouse is a good model of protection against cardiotoxicity.

【Key words】Cytochrome P450 2E1; Gene modification; Sibutramine; Drug toxicity

[收稿日期]2015-09-09

Corresponding author:GAO Hong, E-mail: gaoh@cnilas.org

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2016.01.010

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847(2016) 01-0053-07

[作者簡介]裴彥宇(1990-)，女，碩士研究生，主要從事藥物臨床前安全性評價研究。[通訊作者]高虹 (1968-)，女，碩士生導(dǎo)師，從事藥物臨床前安全性評價研究。E-mail： gaoh@cnilas.org

[基金項目]十二五重大新藥創(chuàng)制科技項目(編號:2013ZX09302302)。