陳旺，李陳成，李森，馮東亮，洪有建,南偉，江龍，黃顯凱,伍亞民

(1. 第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷外科， 重慶　400042；2. 第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所第三研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室， 重慶　400042；3. 蘭州大學第二臨床醫(yī)學院骨科， 蘭州　730030)

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研究報告

復合刺激創(chuàng)傷后應激障礙模型大鼠重要腦區(qū)的病理變化

陳旺1,2，李陳成1,2，李森2，馮東亮3，洪有建1,2,南偉3，江龍1,2，黃顯凱1*,伍亞民2

(1. 第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷外科， 重慶400042；2. 第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所第三研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室， 重慶400042；3. 蘭州大學第二臨床醫(yī)學院骨科， 蘭州730030)

【摘要】目的研究復合刺激創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)模型大鼠重要腦區(qū)的病理變化。方法成年SD雌性大鼠20只，隨機分為正常組、模型組，每組10只。模型組按復合刺激方法建立PTSD大鼠模型，4 周后對兩組大鼠行高架十字迷宮和Morris水迷宮檢測；行為檢測結(jié)束后對大鼠大腦皮層和海馬CA1、CA2、CA3區(qū)和齒狀回進行HE染色和Nissl染色，觀察其病理變化特點。結(jié)果正常組大腦皮層和海馬各區(qū)細胞形態(tài)規(guī)則、分布均勻，核仁及邊界清晰，胞質(zhì)尼氏體豐富，無明顯神經(jīng)元變性壞死；模型組大腦皮層細胞形態(tài)較規(guī)則、分布均勻，無明顯病理改變；海馬CA1、CA3區(qū)細胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，細胞間隙增大，細胞數(shù)量減少，有較多空泡樣細胞病變，CA3區(qū)更為明顯；CA2區(qū)細胞排列較規(guī)則，分布較均勻；齒狀回可見部分細胞排列疏松、細胞間隙增大、尼氏體數(shù)量減少。結(jié)論PTSD模型大鼠海馬CA1、CA3區(qū)和齒狀回均有不同程度的病理改變，為探討PTSD患者的病理機制提供了實驗依據(jù)。

【關鍵詞】創(chuàng)傷后應激障礙；大腦皮層；海馬；病理學；大鼠

復合刺激(combined stress，CS)模型是一種新的創(chuàng)傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)動物模型，與經(jīng)典的連續(xù)單一應激模型(single-prolonged stress，SPS)比較：前者在禁錮時給予不可逃避的電刺激，能更好的模擬現(xiàn)實環(huán)境中多種應激因素的作用，且在強迫游泳后省去了乙醚麻醉的步驟，避免了乙醚對大腦的直接影響。因此，CS模型在造模方法上能更好模擬人類發(fā)生PTSD的狀況。目前有報道PTSD患者可能存在重要腦區(qū)的實質(zhì)性損害，但尚存爭議，并沒有PTSD患者大腦的直接病理學證據(jù)。但這種模型大鼠重要腦區(qū)是否存在病理改變也不確定，相關研究的報道很少。為此,本實驗重點觀察CS模型大鼠重要腦區(qū)的病理變化特點，為研究PTSD的病理機制提供實驗證據(jù)。

1材料與方法

1.1材料及試劑

1.1.1實驗動物

SPF級SD雌性大鼠20只，體重190～200 g，購于第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心【SCXK(渝)2012-0005】。實驗在第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所【SYXK(軍)2012-0037】進行，環(huán)境為室溫(20±2)℃，濕度(55～60)%，動物分籠飼養(yǎng)，自由進食水。將20只大鼠隨機分為正常組和模型組，每組10只，適應性喂養(yǎng)一周后開始實驗。本研究得到第三軍醫(yī)大學動物管理委員會批準(SYXK-PLA-20120031)，實驗設計和操作均按減少動物使用數(shù)量和減輕動物受傷害的原則進行。

1.1.2主要儀器及試劑

高架十字迷宮(垂直方向為開臂× 50 cm，水平方向為閉臂× 50 cm，中央為10 cm × 10 cm正方形區(qū)域)，水迷宮(直徑135 cm，高80 cm的圓柱形水池)，Smart行為軌跡分析系統(tǒng)(San Diego Instrument，美國)，DCR-TRV318紅外攝像機(Sony公司，日本)，大鼠玻璃禁錮器，HE染色試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，尼氏染液(南京建成生物工程研究所有限公司)。

1.2PTSD動物模型的建立

采用趙中興[1]所用的復合刺激(CS)模型，方法如下：用玻璃禁錮器將大鼠禁錮2 h，期間給予大鼠足部電擊(4 mA，60 V)持續(xù)2 s，電擊間隔時間為30～120 s，禁錮結(jié)束后將大鼠取出進行力竭式游泳(大鼠放棄掙扎沉入水底10 s視為力竭)，造模結(jié)束后將大鼠放回原籠內(nèi)喂養(yǎng)，喂養(yǎng)條件不變。

1.3行為學檢測

1.3.1高架十字迷宮

將大鼠放入迷宮中央使其頭正對其中一個開臂，同時Smart軟件記錄大鼠在5 min內(nèi)進入開臂和閉臂次數(shù)總和以及在閉臂停留時間百分比，以此來反映大鼠的焦慮性。每只大鼠實驗完畢后均需清理迷宮內(nèi)的糞便和尿液，并用75%酒精擦拭迷宮，防止對下一只大鼠行為檢測產(chǎn)生影響。

1.3.2水迷宮

將水迷宮的四個象限定義為東(E)、南(S)、西(W)、北(N)四個象限，于各自象限的池臂上放置四種不同顏色的標記物，作為大鼠的視覺參照。將平臺(40 cm高)放入水迷宮的西南象限，水池內(nèi)注入自來水至水深超過平臺2 cm，為防止大鼠看見水下平臺將墨汁倒入水池內(nèi)，調(diào)節(jié)水溫在22～25℃之間。

1.3.3定位航行實驗

歷時4 d，每只大鼠每天訓練4次，第1天按E→S→W→N的順序?qū)⒋笫笱爻乇陬^朝上輕輕放入水中，同時Smart軟件記錄大鼠的行為軌跡，若大鼠找到水下平臺則記錄自動終止，若大鼠在1 min內(nèi)仍未找到水下平臺，則人為誘導其找到平臺并在平臺上休息20 s。每只大鼠訓練完后均需清理水池內(nèi)的糞便。第2天按S→W→N→E的順序開始訓練，以此類推。

1.3.4空間探索實驗

訓練結(jié)束后的第2天，取走水下平臺，將大鼠沿原平臺所在象限的對側(cè)象限放入水池內(nèi)，同時Smart軟件記錄大鼠在1 min內(nèi)的行為軌跡，每只大鼠實驗完后均需清理水池內(nèi)的糞便。通過分析大鼠在1 min內(nèi)穿越平臺次數(shù)和在靶象限停留時間來反映大鼠的空間記憶能力。

1.4HE染色和Nissl染色

大鼠行為檢測結(jié)束后，用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉兩組大鼠。麻醉起效后，仰臥固定，立即剖開胸腔暴露心臟，剪開右心耳，在左心室剪開一個小口，僅容灌注針頭進入，針頭經(jīng)切口進入左心室到達升主動脈，灌注生理鹽水直至右心耳流出無色液體，然后以4%多聚甲醛灌注定直至灌注液進入大鼠大腦，抽動完全停止，全身組織變硬后方可取腦。將取出的腦組織在4%多聚甲醛中固定2 d，隨后沖洗、脫水、透明、侵蠟、包埋、切片(HE染色5 μm，尼氏染色10 μm)、染色。 分別對兩組大鼠的大腦皮層和海馬CA1、CA2、CA3區(qū)和齒狀回進行HE染色和Nissl染色，顯微鏡在200倍下觀察其病理變化特點。

1.5統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1高架十字迷宮

與正常組比較，模型組大鼠進入開臂和閉臂次數(shù)，閉臂停留時間百分比均增多，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示模型組大鼠活動性減少，焦慮性增加(見表1、圖1)。

2.2水迷宮

與正常組比較，模型組大鼠穿越平臺次數(shù)和靶象限停留時間百分比均減少，差異有顯著性(P<0.01)，提示模型組大鼠空間記憶能力受損(見表2、圖2)。

表1　高架十字迷宮的比較

注：與正常組相比，*P<0.01。

Note.*P<0.01, vs.the control group.

表2　Morris水迷宮空間探索實驗的比較(x± s，n=10)

Tab. 2　Comparison of space exploration test in the Morris water maze

表2　Morris水迷宮空間探索實驗的比較(x± s，n=10)

組別Groups穿越平臺次數(shù)Numbersofplatformcrossing靶象限停留時間百分比Percentageofresidencetimeintargetzone正常組Controlgroup3.10±1.1936.33±3.25模型組Modelgroup1.50±0.85*28.46±3.69*

注：與正常組相比，*：P<0.01。

Note.*P<0.01, vs. the control group.

圖1　大鼠高架十字迷宮5 min 的行為軌跡Fig.1　The behavior trace of rats tested by elevated plus maze for 5 minutes

圖2　大鼠空間探索實驗 1 min 的行為軌跡Fig.2　The behavior trace of rats on space exploration test for one minute.

2.3重要腦區(qū)病理染色

兩組大鼠大腦皮層，海馬CA1、CA2、CA3區(qū)和齒狀回HE染色和Nissl染色結(jié)果如下：正常組大腦皮層和海馬各區(qū)細胞形態(tài)規(guī)則、分布均勻、排列緊密，核仁及邊界清晰，胞質(zhì)尼氏體豐富，無明顯神經(jīng)元變性壞死；模型組大腦皮層細胞形態(tài)較規(guī)則、分布均勻，無明顯病理改變；但模型組大鼠海馬細胞結(jié)構(gòu)層變薄，CA1、CA3區(qū)椎體細胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，細胞間隙增大，細胞數(shù)量減少，有較多空泡樣細胞病變，CA3區(qū)更為明顯；CA2區(qū)細胞排列較規(guī)則，分布較均勻；齒狀回可見部分細胞排列疏松、細胞間隙增大、尼氏體數(shù)量減少(見圖3)。

3討論

PTSD是延遲出現(xiàn)和長期存在的精神障礙，其核心癥狀表現(xiàn)為再體驗、高警覺和回避[2]。當今社會，自然災害、戰(zhàn)爭、恐怖襲擊、重大交通事故等頻繁發(fā)生，使PTSD的患病率持續(xù)升高。研究發(fā)現(xiàn)，8%～9%的人在一生中的某些時候會遭遇比較強烈的應激事件，最終有可能發(fā)展成PTSD[3,4]。PTSD由于其病程長、治療困難、預后不佳，已成為社會的沉重負擔，受到越來越多的重視。

目前國內(nèi)外對PTSD發(fā)生機制的研究已引起廣泛關注，fMRI等影像學檢測提示PTSD患者可能有重要腦區(qū)的損害，但尚存爭議。因此，通過動物實驗來模擬、探索PTSD發(fā)生的特點、機制十分必要。在本模型中，CS大鼠能很好復制出PTSD樣行為表現(xiàn)，通過對其重要腦區(qū)的病理進行直接觀察，發(fā)現(xiàn)CS模型大鼠HE染色后海馬CA1和CA3區(qū)呈現(xiàn)出一定的病理改變，可見細胞排列紊亂，部分細胞核碎裂、溶解，空泡細胞形成。尼氏小體與神經(jīng)元的功能密切相關，當神經(jīng)元變性時，尼氏小體會變小甚至消失，尼氏小體的數(shù)量直接反映了神經(jīng)元內(nèi)的蛋白合成功能[11]。CS模型大鼠Nissl染色后可見CA1和CA3區(qū)的尼氏小體排列紊亂、數(shù)量明顯減少、顏色變淺，CA3區(qū)更為明顯。另外，齒狀回的某些區(qū)域也出現(xiàn)了尼氏小體排列疏松、數(shù)量減少的現(xiàn)象。

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的一部分，其最顯著的特點是神經(jīng)元緊密排列，使其結(jié)構(gòu)層次分明、邊界清晰，因此在PTSD腦結(jié)構(gòu)的研究中得到了最多的關注。海馬的主要結(jié)構(gòu)有三層，即多形層、椎體層和分子層，齒狀回則主要分為多形層、顆粒層和分子層。海馬各個區(qū)域的細胞類型也是不同的：CA1區(qū)的椎體細胞比較小，CA3區(qū)的椎體細胞較大，A2區(qū)界于CA1區(qū)和CA3區(qū)之間，由大小不等的椎體細胞組成。

海馬有很多重要的生理功能，它影響著軀體活動和行為、內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)、自主神經(jīng)功能以及學習記憶。海馬在動物的學習和記憶中發(fā)揮著重要作用，尤其是CA3區(qū)，對空間記憶的辨別至關重要[5]。研究發(fā)現(xiàn)，當海馬受到損傷后將影響短時記憶向長時記憶的轉(zhuǎn)化[6]。海馬對應激非常敏感，極易受到應激的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，適當?shù)膽び欣趯W習記憶的改善，對大腦退化有積極的防治作用[7]；而強烈的應激事件則會損害其學習記憶功能[8]。海馬長時程增強(LTP)是學習記憶的神經(jīng)學基礎，Sousa等[9]認為應激能抑制CA1區(qū)和齒狀回誘發(fā)LTP，而Kadar等[10]則認為應激能抑制CA3區(qū)和齒狀回誘發(fā)LTP。

綜上所述，CS模型大鼠海馬的不同區(qū)域均發(fā)生了不同程度的病理改變，海馬CA1、CA3、齒狀回等區(qū)受損明顯，導致較多神經(jīng)元的變性壞死，這在一定程度上可以解釋其在進行高架十字迷宮和水迷宮時的行為表現(xiàn)。本實驗結(jié)果提示：PTSD模型大鼠同樣存在重要腦區(qū)的病理性損害，為探討PTSD患者的發(fā)病機制提供了重要的實驗依據(jù)。但此模型對大腦產(chǎn)生的應激損傷可能不僅僅在于海馬，PTSD影響的另外一個重要腦區(qū)是杏仁核，但由于其體積太小、位置隱匿，在研究中有一定的困難，本次實驗尚未對其觀察，CS模型大鼠杏仁核是否存在病理損害有待以后深入研究。

圖3　大鼠重要腦區(qū)的組織學改變(HE與Nissl染色，×200)Fig.3　Histological changes in the brain areas of rats. HE and Nissl staining. ×200

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Pathological changes in some important brain areas of rats with post-traumatic stress disorder induced by combined stress

CHEN Wang1，LI Chen-cheng1，LI Sen2，F(xiàn)ENG Dong-liang2，HONG You-jian1， NAN Wei2，JIANG Long1，HUANG Xian-kai1*，WU Ya-min1

(1. Department of Traumatology, Research Institute of Surgery/Daping Hospital,2. Third Department of Research Institute of Surgery/Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China；3. Department of Orthopedics, the Second Clinical Medical College of Lanzhou University, Lanzhou 730030)

【Abstract】ObjectiveTo study the pathological changes in some important brain areas of rats with post-traumatic stress disorder (PTSD) induced by combined stress.MethodsTwenty healthy adult female SD rats were randomly divided into normal group and model group, with 10 rats in each group. The PTSD model was established by combined stress. After 4 weeks, the rat behaviors of the two groups were tested by elevated plus maze and Morris water maze. After the test, samples of the cerebral cortex, areas of CA1, CA2, CA3 and hippocampal dentate gyrus were taken for pathological examination using HE and Nissl staining. ResultsIn the normal group, the cell morphology and distribution were regular and the cell nucleoli were clear in the cerebral cortex and hippocampus, cytoplasmic Nissl bodies were abundant, and there were no obvious neuronal degeneration and necrosis. In the model group, the cell morphology and distribution in the CA1 and CA3 areas were irregular, with increased cell gaps, and in addition, there were some pathological changes of physaliferous cells, especially in the CA3 area. The cell morphology and distribution in the CA2 area were regular. In the dentate gyrus, some cells arranged loosely, the cell gap was widened, and the amount of Nissl bodies was decreased. Conclusions There are some pathological changes in the hypocampal CA1, CA3 and dentate gyrus in rat models of post-traumatic stress disorder, and they will provide an experimental basis for studying the pathological mechanism of PTSD patients.

【Key words】Post-traumatic stress disorder; Cerebral cortex; Hippocampus; Pathology; Rats

[收稿日期]2015-08-06

Corresponding author:HUANG Xian-kai, E-mail：hxkai123@sina.com

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2016.01.016

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847(2016) 01-0087-05

[作者簡介]陳旺(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：PTSD的防治。E-mail: 453777442@qq.com[通訊作者]黃顯凱，主任醫(yī)師、教授、博士、碩士生導師，研究方向：嚴重創(chuàng)傷救治。E-mail: hxkai123@sina.com

[基金項目]全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金(08G096)。