倪麗菊，趙麗亞，趙立虎，趙瑩，高誠(chéng)*

(1.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心， 上?！?01203; 2.上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司， 上?！?01203;3.上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司， 上?！?01615)

?

研究報(bào)告

利用多重?zé)晒釹TR技術(shù)分析上海地區(qū)7品系常用近交系小鼠核心群的遺傳特性

倪麗菊1，趙麗亞2，趙立虎3，趙瑩2，高誠(chéng)1*

(1.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心， 上海201203; 2.上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司， 上海201203;3.上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司， 上海201615)

【摘要】目的 比較上海地區(qū)7品系常用近交系小鼠核心群的遺傳特性。 方法 將篩選到的48對(duì)多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星引物組合優(yōu)化，形成11組多重?zé)晒釶CR引物混合體系，對(duì)來(lái)自上海地區(qū)兩大實(shí)驗(yàn)小鼠供應(yīng)商的7品系近交系小鼠核心群的DNA樣進(jìn)行分型檢測(cè)。利用遺傳分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果來(lái)自?xún)纱蠊?yīng)商的7品系近交系小鼠在48個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上都為純合子。同一種群內(nèi)小鼠的STR位點(diǎn)結(jié)果均一致；不同種群小鼠無(wú)論品系是否相同，相互間均存在STR位點(diǎn)差異。但相同品系不同種群近交系小鼠間的遺傳距離與不同品系小鼠種群間的遺傳距離相比均較近。在UPGMA聚類(lèi)樹(shù)中，相同品系的不同種群均首先兩兩聚成一類(lèi)。C57BL/6小鼠與其他6品系小鼠的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。結(jié)論上海地區(qū)不同供應(yīng)商的7品系近交系小鼠核心群間均存在STR位點(diǎn)差異。

【關(guān)鍵詞】近交系小鼠；微衛(wèi)星；多重PCR；遺傳特性

近交系小鼠作為一種重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因具有高度的遺傳同一性，被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中，其遺傳質(zhì)量直接影響到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和科學(xué)性。定期對(duì)其進(jìn)行遺傳監(jiān)測(cè)是保證其遺傳質(zhì)量的重要措施。利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)小鼠進(jìn)行遺傳檢測(cè)近年來(lái)國(guó)內(nèi)有較多報(bào)道[1-7]，但各位學(xué)者所選微衛(wèi)星位點(diǎn)的位置和數(shù)量各不相同，檢測(cè)方法也有所不同，尚處于摸索階段。對(duì)微衛(wèi)星的有效篩選和高效利用是微衛(wèi)星檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵。本研究將高通量的多重?zé)晒釶CR方法應(yīng)用到小鼠微衛(wèi)星檢測(cè)技術(shù)中，利用篩選到的48個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)上海地區(qū)兩大實(shí)驗(yàn)小鼠供應(yīng)商的7品系常用近交系小鼠核心群進(jìn)行比較分析，以了解目前上海地區(qū)近交系小鼠種質(zhì)資源的遺傳特性。

1材料與方法

1.1DNA樣本

選擇常用的7品系近交系小鼠，DBA/2Slac、BALB/cAnSlac、C3H/HeJSlac、C57BL/6JSlac、CBA/JSlac、FVB/NJSlac、129/S3Slac的DNA樣由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2012-0002】提供，DBA/2Bkl、BALB/cBkl、C3H/HeBkl、 C57BL/6Bkl、CBA/CaBkl、FVB/NJBkl、129/SvEvBrd/Bkl的DNA樣由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2013-0016】提供。將各DNA樣濃度稀釋至25～50 ng/μL，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。所用近交系小鼠均為核心群?dòng)物，SPF級(jí)。每單位每品系各選6～8只，雌雄各半。

1.2微衛(wèi)星位點(diǎn)的選取

參考MMDBJ數(shù)據(jù)庫(kù) (Mouse Microsatellite Data Base of Japan)(http://www.shigen.nig.ac.jp/mouse/mmdbj/top.jsp)及文獻(xiàn)[8，9]，選取在不同小鼠品系間多態(tài)信息豐富的位點(diǎn)，均勻分布于19條常染色體和X染色體，每條染色體選2～3位點(diǎn)。

1.3試劑

微衛(wèi)星擴(kuò)增試劑Type-itTMMicrosatellite PCR Kit購(gòu)自Qiagen公司。各微衛(wèi)星位點(diǎn)上游PCR引物的5’端用FAM或HEX熒光染料標(biāo)記，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成與標(biāo)記，具體引物信息見(jiàn)表1。

1.4基因組STR的PCR分型

將篩選的48個(gè)STR位點(diǎn)根據(jù)產(chǎn)物大小、引物擴(kuò)增效率和熒光標(biāo)記的不同，組合成11組3-5重?zé)晒釶CR分型方案對(duì)兩家單位的7品系小鼠DNA共計(jì)111份樣品(必凱56份，斯萊克55份)進(jìn)行分型。PCR反應(yīng)體系為10 μL: 2× Type-it Multiplex PCR Master Mix 5 μL,多重引物混合液適量,5× Q-Solution 2 μL, 模板DNA 75 ng，RNase-free water補(bǔ)足10 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 熱激活5 min，95℃變性30 s，60℃復(fù)性90 s，72℃延伸30 s，循環(huán)28次，最后60℃延伸30 min。

表1　48個(gè)小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的熒光標(biāo)記引物信息

1.5PCR產(chǎn)物檢測(cè)

將多重?zé)晒釶CR產(chǎn)物通過(guò)ABI3730測(cè)序儀的毛細(xì)管凝膠電泳進(jìn)行掃描檢測(cè)，ROX標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)分子量片段[10]為內(nèi)參，用Gene Scan 3.1軟件收集測(cè)序儀毛細(xì)管凝膠電泳的數(shù)據(jù)，用Gene Mapper軟件分析各位點(diǎn)的片段大小。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)Nei的公式計(jì)算各品系小鼠間的遺傳距離。

其中:r：微衛(wèi)星座位數(shù)目；mj：第j微衛(wèi)星座位所具有的等位基因數(shù)目；xij、yij：分別為x群體、y群體第j微衛(wèi)星座位第i等位基因的基因頻率。最后，用MEGA軟件中的非加權(quán)組平均法(unweighted pair group method with arithmetic means，UPMGA)進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建聚類(lèi)關(guān)系樹(shù)。

2結(jié)果

2.1微衛(wèi)星多重?zé)晒釶CR產(chǎn)物的毛細(xì)管凝膠電泳

將48個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)組合成11組多重?zé)晒釶CR分型方案對(duì)7品系111只近交系小鼠DNA樣進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管凝膠電泳掃描檢測(cè)。圖1為1只C3H/HeBkl小鼠在D18Mit31、D16Mit38、D11Mit4、D5Mit20、D8Mit11等5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的多重PCR產(chǎn)物的掃描結(jié)果。

2.248個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR分型結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)選取的兩家單位7品系近交系小鼠在48個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果(見(jiàn)表2)顯示都為純合子。不同品系的近交系小鼠在各位點(diǎn)上表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，等位基因數(shù)為2-7個(gè)。同一單位的同品系小鼠在48個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的擴(kuò)增結(jié)果均一致，在種群內(nèi)表現(xiàn)為單態(tài)性。同品系小鼠在不同單位種群間存在差異，其中差異最大的是CBA/CaBkl和CBA/JSlac，兩種群CBA小鼠在16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上存在差異；其次是C57BL/6Bkl和C57BL/6JSlac，兩種群C57BL/6小鼠在10個(gè)位點(diǎn)上存在差異；差異最小的是FVB/NJBkl和FVB/NJSlac，兩種群FVB小鼠只在1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上有差異。

表2　48個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在各品系小鼠種群中的分型結(jié)果(bp)

圖1　C3H/HeBkl小鼠的一個(gè)5重?zé)晒釶CR產(chǎn)物的電泳掃描結(jié)果Fig.1　The electrophoresis results of C3H/HeBkl mouse prouducts in a 5-plex fluorescent-PCR

2.3各種群近交系小鼠間的遺傳距離分析

基于等位基因頻率計(jì)算出來(lái)自?xún)蓡挝坏?品系近交系小鼠共計(jì)14個(gè)種群間的Nei遺傳距離，如表3所示。不同單位種群的同品系小鼠間的遺傳距離均較近，最近的是FVB/NJBkl與FVB/NJSlac之間，遺傳距離為0.0208；最遠(yuǎn)的是CBA/CaBkl和CBA/JSlac之間，遺傳距離為0.3333。不同品系小鼠種群間的遺傳距離均較遠(yuǎn)，最遠(yuǎn)的是C57BL/6JSlac與BALB/cBkl之間和C57BL/6JSlac與BALB/cAnSlac之間，遺傳距離均為0.9583。

表3　14個(gè)近交系小鼠種群間的遺傳距離及等位基因有差異的微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)目

2.4各種群近交系小鼠的聚類(lèi)分析

根據(jù)Nei遺傳距離，用UPGMA法構(gòu)建的聚類(lèi)樹(shù)結(jié)果如圖2所示，不同單位種群的同品系近交系小鼠均因親緣關(guān)系最近，首先聚成一類(lèi)。不同品系的近交系小鼠間，F(xiàn)VB與129首先聚在一起，再與BALB/c聚成一分支；C3H與CBA聚在一起后，再與DNA/2聚成一分支；兩組分支聚在一起后，最后與C57BL/6聚類(lèi)，由此可見(jiàn)，C57BL/6小鼠與其他6品系小鼠的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

圖2　基于Nei遺傳距離構(gòu)建的14個(gè)近交系小鼠種群的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)Fig. 2　The UPGMA clustering tree based on Nei’s genetic distance for 14 populations of the inbred mice

3討論

近年來(lái)，微衛(wèi)星標(biāo)記因具有分布廣、數(shù)量多、多態(tài)性高、具共顯性等優(yōu)點(diǎn)，被作為一種重要、成熟的遺傳工具廣泛應(yīng)用于各類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳檢測(cè)研究中。

目前，微衛(wèi)星DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分型方法有瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺電泳、毛細(xì)管凝膠電泳等。瓊脂糖電泳操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但由于STR擴(kuò)增產(chǎn)物多數(shù)集中在100～200 bp 之間而且某些等位基因大小比較接近，隨著電泳時(shí)間的增加，一些小片段擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶易模糊，瓊脂糖凝膠的分辨率低，不能準(zhǔn)確區(qū)分不同大小的等位基因。聚丙烯酰胺電泳是應(yīng)用較多的微衛(wèi)星產(chǎn)物分型檢測(cè)方法，分辨率高，可以分辨出長(zhǎng)度差為l～2 bp的DNA片段，但制膠和染色操作步驟繁瑣，耗時(shí)、耗力、非自動(dòng)化，在大規(guī)模多批次的數(shù)據(jù)收集和分析時(shí)存在相當(dāng)大的難度，而且經(jīng)常會(huì)有影子帶的產(chǎn)生干擾結(jié)果的判斷。DNA全自動(dòng)測(cè)序儀的毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)是近年來(lái)快速發(fā)展和具有廣泛應(yīng)用前景的新技術(shù)，該技術(shù)將熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)分子量樣品(內(nèi)參)在同一毛細(xì)管中進(jìn)行電泳，DNA分析儀將結(jié)果自動(dòng)記錄在計(jì)算機(jī)上，利用片段分析軟件進(jìn)行圖像收集和分析，精確計(jì)算出微衛(wèi)星等位基因片段的大小。毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物具有微量、高度自動(dòng)化、結(jié)果更加準(zhǔn)確等明顯優(yōu)勢(shì)，是今后微衛(wèi)星檢測(cè)的發(fā)展方向。本研究將多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法和毛細(xì)管凝膠電泳應(yīng)用了到微衛(wèi)星的分型檢測(cè)中，將篩選到的48個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)組合成11組多重PCR分型方案。該方案是在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中對(duì)同一樣本采用3-5種引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，將實(shí)驗(yàn)成本降低至近四分之一，同時(shí)減少了操作時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。微衛(wèi)星的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)技術(shù)可以有效降低成本、提高通量，使小鼠微衛(wèi)星遺傳檢測(cè)更為簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效和準(zhǔn)確，可滿(mǎn)足規(guī)?；瘷z測(cè)的需要。

本研究建立的微衛(wèi)星多重?zé)晒釶CR分型方案含48個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，覆蓋了小鼠1-19號(hào)常染色體和X染色體，能夠較全面地從分子水平反映各品系獨(dú)特的遺傳概貌，可用于常用近交系小鼠種群的遺傳特性分析、日常遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)、品系鑒定等。如用于品系鑒定，一組含5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多重PCR 反應(yīng)(如圖1)即可將這7品系區(qū)分開(kāi)。

對(duì)上海地區(qū)兩大實(shí)驗(yàn)小鼠供應(yīng)商的7品系近交系小鼠核心群的微衛(wèi)星分析發(fā)現(xiàn)，兩家單位各自的7品系小鼠種群在48個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基因純合度都為100%，說(shuō)明這些品系的核心群動(dòng)物保持著良好的遺傳穩(wěn)定性。比較兩家單位的7品系近交系小鼠共計(jì)14個(gè)核心群在48個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各種群之間都有部分位點(diǎn)的結(jié)果存在差異，具有差異的位點(diǎn)數(shù)在2-46個(gè)之間。同品系近交系小鼠的不同單位種群間有差異的位點(diǎn)數(shù)均較少、遺傳距離均較近，其中差異最大的是CBA/CaBkl和CBA/JSlac，其次是C57BL/6Bkl和C57BL/6JSlac，這與本課題組其他研究人員用51個(gè)SNP位點(diǎn)分析相同DNA樣本的結(jié)果(另文發(fā)表)一致。作者認(rèn)為，同品系不同單位種群近交系小鼠間STR位點(diǎn)存在差異的原因，一是由亞系不同導(dǎo)致，如CBA/CaBkl和CBA/JSlac；二是由兩家單位同一品系小鼠的引種單位不同引起，兩個(gè)引種單位的小鼠在長(zhǎng)期的培育過(guò)程中出現(xiàn)了遺傳分化。不同品系的近交系小鼠種群在這48個(gè)位點(diǎn)上有著豐富的多態(tài)性，等位基因數(shù)為2-7個(gè)，以含3-4個(gè)等位基因的位點(diǎn)居多，達(dá)三分之二以上。不同品系的近交系小鼠中， C57BL/6JSlac與BALB/cBkl、BALB/cSlac間差異最大，均有46個(gè)位點(diǎn)存在差異，遺傳距離亦最遠(yuǎn)，表明C57BL/6小鼠與BALB/c小鼠間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這與韓喜彬等[1]用10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)遼寧省BALB/c、C57BL/6、C57BL/10、DBA/2、FVB/N、129等6品系常用近交系小鼠進(jìn)行遺傳質(zhì)量分析時(shí)發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。C3H/HeBkl與CBA/CaBkl、CBA/JSlac間差異最小，遺傳距離最近。

研究表明，上海地區(qū)兩大供應(yīng)商的DBA/2、BALB/c、C3H/He、C57BL/6、CBA、FVB/NJ、129等7品系小鼠核心群的遺傳特性是有差異的，本研究為相關(guān)小鼠品系積累了遺傳背景資料，建立的多重?zé)晒釹TR技術(shù)可以從DNA水平對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行快速高通量的遺傳監(jiān)測(cè)。

(致謝: 感謝上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司、上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司為本研究提供近交系小鼠DNA樣品。)

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Genetic characteristics of seven inbred mouse strains in core colonies from Shanghai analyzed using fluorescent multiplex STR

NI Li-ju1, ZHAO Li-ya2, ZHAO Li-hu3, ZHAO Ying2, GAO Cheng1*

(1. Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203, China; 2. Sino-British SIPPR/BK Laboratory Animal Ltd. Co., Shanghai 201203; 3. Shanghai SLAC Laboratory Animal Ltd. Co., Shanghai 201615)

【Abstract】ObjectiveTo analyze the genetic characteristics of seven frequently-used inbred mouse strains in core colonies from Shanghai suppliers. Methods 48 pairs of microsatellite primers with high polymorphism were screened out and combined into 11 sets of multiplex PCR primer mix labelled with two dyes (FAM and HEX). By these primer mix, the DNA samples of the seven strains were genotyped. The genotyping data were analyzed using statistical software. Results All the 48 microsatellite loci were homozygous for all inbred mice of the seven strains. On each microsatellite locus, the PCR results of the mice in the same population showed monomorphism, and that of the mice in different populations showed polymorphism, whether the populations were of the same strain or not. But the genetic distances between the populations of the same strain were all closer than that of different strains. The phylogenic tree showed that the populations of the same strain were first get into one cluster. The genetic relationship between the strains of C57BL/6 and other six strains were all far. Conclusions Genetic differences exist on 48 microsatellite loci between the core colonies of seven inbred mouse strains from two suppliers in Shanghai.

【Key words】Inbred mice; Microsatellite; Multiplex PCR; Genetic characteristics

[收稿日期]2015-07-24

Corresponding author:GAO Cheng, E-mail: gaochengdgb@126.com

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2016.01.013

【中圖分類(lèi)號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847(2016) 01-0072-08

[作者簡(jiǎn)介]倪麗菊，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳學(xué)。E-mail: niliju@163.com[通訊作者]高誠(chéng)，研究員，E-mail: gaochengdgb@126.com

[基金項(xiàng)目]上海市科委基金項(xiàng)目(No.12140900402)。