陳榕　曹竹君　王云　項(xiàng)曉剛　安寶燕　謝青　王暉　郭清

200025　上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科

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·論著·

血清M30抗原水平對(duì)HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭的預(yù)后評(píng)估價(jià)值

陳榕曹竹君王云項(xiàng)曉剛安寶燕謝青王暉郭清

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科

【摘要】目的探索HBV感染后不同疾病階段的肝細(xì)胞凋亡水平及其對(duì)HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。方法前瞻性納入40例慢性乙型肝炎(CHB)、40例乙型肝炎肝硬化(HBV-LC)以及54例HBV-ACLF患者，同時(shí)設(shè)立40例健康對(duì)照(HC)。針對(duì)HBV-ACLF患者隨訪3個(gè)月，根據(jù)隨訪結(jié)果分為存活組及死亡組。檢測(cè)所有研究對(duì)象血清角蛋白18凋亡特異性裂解片段M30抗原水平作為反映肝細(xì)胞凋亡水平的間接指標(biāo)。結(jié)果CHB、HBV-LC及HBV-ACLF組血清M30抗原水平分別為145.24(IQR 86.31，206.39)U/L，213.42(IQR 147.30，391.28)U/L及762.67(IQR 492.45，1395.24)U/L，均顯著高于HC組[60.34(IQR 50.58，67.64)U/L](P<0.01)。隨著疾病嚴(yán)重程度升高，血清M30抗原呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，尤以HBV-ACLF組最高，顯著高于CHB(P<0.01)及HBV-LC組(P<0.01)。M30抗原與ALT、AST、TBil、PT、INR以及HBV DNA呈顯著正相關(guān)(均P<0.01)，與Alb呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。HBV-ACLF 隨訪3個(gè)月死亡組患者血清M30抗原水平[1175.18(IQR 756.57，3224.94)U/L]顯著高于存活組患者[491.39(IQR 264.23，657.17)U/L](P<0.01)。血清M30抗原能夠良好地預(yù)測(cè)HBV-ACLF患者3個(gè)月預(yù)后情況，曲線下面積為0.86(95% CI 0.75～0.96，P<0.01)。結(jié)論肝細(xì)胞凋亡水平與HBV感染后的疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，血清M30抗原可能成為HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭早期預(yù)后的候選指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】慢加急性肝衰竭；乙型肝炎病毒；細(xì)胞凋亡；預(yù)后

乙型肝炎的重癥化演變是乙型肝炎相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)最終發(fā)生的原因所在，是一個(gè)累及多因素、多器官、多階段的復(fù)雜過(guò)程，其中肝細(xì)胞的大量死亡是HBV-ACLF發(fā)展過(guò)程的核心事件，貫穿整個(gè)疾病進(jìn)程[1]。越來(lái)越多的研究表明，肝細(xì)胞凋亡在慢加急性肝衰竭疾病進(jìn)展過(guò)程中扮演重要角色，但其具體作用尚不明確。角蛋白18(Keratin-18, K-18)是肝細(xì)胞最主要的中間纖維蛋白，作為骨架結(jié)構(gòu)支撐并維持肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞正常的形態(tài)[2]。肝細(xì)胞凋亡過(guò)程中，K-18經(jīng)由凋亡蛋白酶家族一系列CASPASE蛋白切割后，形成擁有凋亡特異性抗原點(diǎn)位的裂解片段(M30抗原)并釋放入循環(huán)血，循環(huán)血M30抗原的水平可反映肝細(xì)胞凋亡水平[3]。本研究旨在探討HBV-ACLF患者的循環(huán)血肝細(xì)胞凋亡水平特點(diǎn)及其臨床意義。

資料和方法

一、病例來(lái)源

研究對(duì)象為瑞金醫(yī)院2013年2月至2014年8月就診的134例患者，男性109例，女性25例，年齡19～70歲，平均年齡為(45.6±1.0)歲。其中CHB患者40例，HBV-LC患者40例，HBV-ACLF患者54例。同時(shí)納入健康志愿者40名作為健康對(duì)照。CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2010年慢性乙型肝炎防治指南[4]，HBV-ACLF診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2009年亞太肝病學(xué)會(huì)慢加急性肝衰竭(ACLF)共識(shí)[5]。排除合并HCV、HDV、HEV或HIV感染、明確的脂肪性肝病、威爾森氏癥、自身免疫性肝病及酒精性肝病等。

二、方法

1. 血清樣本及臨床數(shù)據(jù)采集：入組HBV-ACLF患者血清均為入院當(dāng)日留取，CHB患者、HBV-LC及健康志愿者在入組當(dāng)日采集血清。所有血清樣本于-20 ℃凍存?zhèn)溆?。?duì)應(yīng)錄入所有入組對(duì)象基線人口學(xué)、外周血生物化學(xué)指標(biāo)、血常規(guī)、凝血功能、病毒學(xué)指標(biāo)以及影像學(xué)檢查結(jié)果等。

2. 血清M30抗原的測(cè)定：血清M30抗原定量采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方法，試劑盒為M30-Apoptosenses ELISA kit (PEVIVA AB, Bromma, Sweden)。所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3. 肝衰竭患者預(yù)后評(píng)估：計(jì)算CTP評(píng)分[6]、MELD評(píng)分[7]及MELD-NA評(píng)分[8]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SAS 9.0及Sigmaplot 12.5軟件。血清M30抗原水平以中位數(shù)(上下四分位數(shù))表示，其余計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用曼惠特尼U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)。各類(lèi)指標(biāo)對(duì)HBV-ACLF患者的短期預(yù)后評(píng)估的診斷效能用受試者工作特征曲線下面積(ROC)來(lái)評(píng)價(jià)。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、研究對(duì)象基本資料

本研究共納入134例患者及40例健康志愿者，患者分3組，分別為CHB、HBV-LC以及HBV-ACLF組。所有研究對(duì)象入組時(shí)各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。54例HBV-ACLF患者隨訪3個(gè)月后，存活22例，死亡32例。

二、各組血清M30抗原水平

健康對(duì)照組血清M30抗原水平為60.34 U/L(50.58 U/L, 67.64 U/L)，顯著低于患者組水平302.52 U/L(151.07 U/L, 695.62 U/L；P<0.01)。見(jiàn)圖1A?；颊呓M中，隨著疾病嚴(yán)重程度升高，血清M30抗原呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，尤以HBV-ACLF組最高，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1B。

三、患者血清M30抗原與肝功能評(píng)估指標(biāo)及病毒載量的相關(guān)性

患者血清M30抗原與肝功能指標(biāo)(ALT、AST、GGT、TBil、Alb)、凝血功能指標(biāo)(PT、INR)以及病毒載量HBV DNA的相關(guān)性見(jiàn)表2。

四、基線血清M30抗原水平在HBV-ACLF患者中的預(yù)后價(jià)值

隨訪3個(gè)月死亡組基線M30抗原水平明顯高于存活組，見(jiàn)圖2A。ROC曲線結(jié)果顯示，血清M30抗原水平具有預(yù)測(cè)HBV-ACLF患者短期預(yù)后的能力，且AUC大于傳統(tǒng)的肝衰竭預(yù)后評(píng)估模型CTP評(píng)分、MELD評(píng)分以及MELD-NA評(píng)分，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2B。血清M30抗原Cut-off值定為>750.47 U/L時(shí)，預(yù)判HBV-ACLF患者死亡的靈敏度和特異度最好，特異度為86.36%，靈敏度為78.13%，陰性預(yù)測(cè)值為73.08%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為89.29%。

表1　各組患者基線特征

注：1A. 血清M30抗原在患者組水平明顯高于健康人群。1B. 血清M30抗原水平在疾病組中隨著疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行性升高，在HBV-ACLF患者組水平最高，顯著高于CHB及HBV-LC組

圖1血清M30抗原水平在健康人群及患者中的水平

注：2A為存活組與死亡組患者M(jìn)30抗原水平比較；2B為血清M30與其他肝衰竭預(yù)后評(píng)估模型的ROC曲線

變量相關(guān)系數(shù)P值A(chǔ)LT0.53<0.01AST0.72<0.01GGT0.160.06TBil0.69<0.01Alb-0.42<0.01PT0.64<0.01INR0.64<0.01HBVDNA0.270.002

討論

HBV-ACLF病程進(jìn)展較快，目前治療措施有限，療效不能令人滿意，病死率仍較高，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命健康。根據(jù)HBV-ACLF內(nèi)在的機(jī)制特點(diǎn)，建立行之有效的病情評(píng)價(jià)及預(yù)后評(píng)估體系，繼而指導(dǎo)臨床治療決策是降低病死率的關(guān)鍵所在。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)針對(duì)HBV-ACLF的預(yù)后評(píng)估系統(tǒng)，臨床主要以傳統(tǒng)的終末期肝病模型MELD及CTP評(píng)分作為替代，對(duì)HBV-ACLF患者進(jìn)行早期預(yù)后評(píng)估，同時(shí)針對(duì)病情制定不同治療策略。然而由于各評(píng)分系統(tǒng)都存在著各自的不足，直接將其應(yīng)用于HBV-ACLF仍有一些問(wèn)題存在[9]。國(guó)外Jalan等[10]針對(duì)ACLF構(gòu)建的CLIF-C ACLF評(píng)分在預(yù)測(cè)ACLF患者短期及長(zhǎng)期預(yù)后方面的準(zhǔn)確率明顯高于傳統(tǒng)的MELD評(píng)分、MELD-NA評(píng)分以及CTP評(píng)分，但其研究對(duì)象以酒精性肝硬化導(dǎo)致的ACLF為主。雖然不同病因?qū)е碌腁CLF主要臨床特點(diǎn)類(lèi)似，但這一系統(tǒng)能否直接應(yīng)用到我國(guó)HBV-ACLF群體仍需多中心研究的驗(yàn)證。

本研究通過(guò)檢測(cè)血清中K-18凋亡特異性裂解片段M30抗原的表達(dá)情況，以探究肝細(xì)胞凋亡水平在HBV-ACLF患者中的特點(diǎn)。同時(shí)對(duì)比分析其水平在健康人群、慢性乙型肝炎以及乙型肝炎肝硬化患者中的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清M30抗原水平在HBV-ACLF患者中顯著高于健康人群以及其他疾病階段的患者，并與ALT、AST、TBil、PT、INR、HBV DNA等呈正相關(guān)性，與白蛋白呈負(fù)相關(guān)性，表明升高的M30抗原與病情程度緊密相關(guān)。此外，血清M30抗原水平能夠有效區(qū)分HBV-ACLF存活組和死亡組患者，死亡組患者的M30抗原水平顯著高于存活組患者。ROC曲線分析表明血清M30抗原對(duì)HBV-ACLF患者3個(gè)月預(yù)后具有良好的評(píng)估作用，曲線下面積達(dá)0.86，大于傳統(tǒng)的CTP、MELD以及MELD-NA評(píng)分，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明血清M30抗原水平在一定程度上能夠評(píng)價(jià)病情嚴(yán)重程度以及評(píng)估疾病預(yù)后情況。目前，少有研究針對(duì)性分析HBV-ACLF病程中特定肝細(xì)胞死亡模式，比如肝細(xì)胞凋亡、壞死甚至是凋亡性壞死的作用。慢性HBV感染所引起持續(xù)的宿主免疫損傷、肝內(nèi)微循環(huán)障礙以及腸源性內(nèi)毒素血癥等均可造成大量肝細(xì)胞死亡[11]。死亡肝細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞內(nèi)容物作為炎性刺激因子，上調(diào)各類(lèi)促炎因子促使原本較為穩(wěn)定的慢性乙型肝炎、肝硬化狀態(tài)暴發(fā)急性肝功能失代償進(jìn)而發(fā)展為肝衰竭[5]。

本研究進(jìn)一步闡明了HBV-ACLF患者血清肝細(xì)胞凋亡水平在反映病情嚴(yán)重程度以及預(yù)后評(píng)估方面的重要作用。但尚不能得出HBV-ACLF患者中顯著升高的肝細(xì)胞凋亡水平對(duì)疾病本身的作用，今后將進(jìn)一步針對(duì)HBV-ACLF開(kāi)展動(dòng)態(tài)研究，以期探討高水平的肝細(xì)胞凋亡在HBV-ACLF疾病進(jìn)展中的作用，并同時(shí)建立多中心、前瞻性、大樣本量臨床隊(duì)列驗(yàn)證血清M30抗原作為HBV-ACLF病情及預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)的作用。

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(本文編輯：錢(qián)燕)

The prognostic value of serum M30-antigen levels in patients with HBV-related acute-on-chronic liver failureCHENRong,CAOZhu-jun,WANGYun,XIANGXiao-gang,ANBao-yan,XIEQing,WANGHui,GUOQing.DepartmentofInfectiousDiseases,RuijinHospital,Shanghai200025,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the apoptotic level of hepatocytes in patients with chronic hepatitis B virus (HBV) infection at different stages, and to evaluate its prognostic value on HBV-related acute-on-chronic liver failure (HBV-ACLF). MethodsA prospective study was carried out in 174 patients including 40 chronic hepatitis B (CHB), 40 HBV-related liver cirrhosis (HBV-LC), 54 HBV-ACLF patients and 40 healthy controls (HC). HBV-ACLF group were followed up for 3 months and classified into survival and death group. Apoptotic levels of hepatocytes were measured by detecting keratin-18 associated caspase-cleaved fragment, M30-antigen. ResultsSerum M30-antigen levels in CHB, HBV-LC and HBV-ACLF were 145.24 [interquartile range (IQR 86.31-206.39) U/L, 213.42 (IQR 147.30-391.28) U/L and 762.67 (IQR 492.45-1395.24) U/L respectively, which were significantly (P<0.01) higher than those in HC group [60.34 (IQR 50.58-67.64)U/L]. Moreover, serum M30-antigen levels were gradually elevated as disease severity increased, reaching to peek in HBV-ACLF group, which was significantly higher (P<0.01) than those in CHB and HBV-LC group. M30-antigen level was significantly positively correlated with alanine aminotransferase (ALT), aspartate transaminase (AST), total bilirubin (TBil), prothrombin time (PT), international normalized ratio (INR) and HBV-DNA (all P<0.01), while reversely correlated with albumin (P<0.01). More importantly, serum levels of M30-antigen in the death group [1175.18 (IQR 756.57-3224.94) U/L] were significantly (P<0.01) higher than those in the survival group [491.39 (IQR 264.23-657.17) U/L]. Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis demonstrated that serum M30-antigen could well predict 3-month outcome of HBV-ACLF patients, as the area under the curve (AUROC) was 0.86 (95% CI 0.75-0.96, P<0.01). ConclusionHepatocyte apoptosis is closely associated with the disease severity of chronic HBV infection and markedly elevated in patients with HBV-ACLF. Hepatocytes apoptosis biomarker, M30-antigen, might be a potential indicator for the early prognosis of HBV-ACLF.

【Key words】Acute-on-chronic liver failure; Hepatitis B virus; Apoptosis; Prognosis

(收稿日期：2015-11-05)

Corresponding author:GUO Qing，Email：13901922856@163.com

通信作者：郭清，Email：13901922856@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81570560)；“十二五”重大專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目(2012ZX10005004-002)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科技支撐項(xiàng)目(13401902903)；上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)重點(diǎn)項(xiàng)目(20134004)；國(guó)家臨床重點(diǎn)專(zhuān)科建設(shè)項(xiàng)目(2012ZX09303-001-001)；蘇州市醫(yī)療器械與新藥專(zhuān)項(xiàng)(ZXY2013003)