蘇建紅，郭成，張軍高，漆永紅，曹素芳，李敏權(quán),

(1．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070； 2．甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，甘肅 蘭州　730070；

3．甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所，甘肅 蘭州　730070)

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洋蔥貯藏期青霉病病原菌的分離及鑒定

蘇建紅1,2，郭成2，張軍高1，漆永紅2，曹素芳3，李敏權(quán)1,2

(1．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州730070； 2．甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，甘肅 蘭州730070；

3．甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 明確甘肅洋蔥貯藏期青霉病青霉菌的種類及其致病性.【方法】 采用常規(guī)組織分離法對甘肅省5個縣區(qū)洋蔥貯藏期青霉病病樣進行病原物的分離、純化培養(yǎng)，同時采用形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS分子生物學(xué)方法進行鑒定.【結(jié)果】 共分離得到108株青霉菌菌株，分離頻率為46.3%，其中青霉P1、P2、P3和P4的分離頻率依次為30.5%、27.8%、22.2%和19.5%，P1為優(yōu)勢病原菌；結(jié)合形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS分子生物學(xué)方法，鑒定出P1、P2、P3和P4分別為皮落青霉(Penicillium crustosum)、波蘭青霉(Penicillium polonicum)、鮮綠青霉(Penicillium viridicatum)和光孢青霉(Penicillium glabrum).致病性測定結(jié)果表明，青霉菌P1、P2、P3和P4在有傷和無傷的條件下均能引起洋蔥青霉病.【結(jié)論】 皮落青霉(P.crustosum)、波蘭青霉(P.polonicum)、鮮綠青霉(P.viridicatum)和光孢青霉(P.glabrum)是洋蔥貯藏期青霉病的病原菌.

關(guān)鍵詞：洋蔥；青霉??； 青霉菌種類；致病性

洋蔥(Alliumcepa)又名圓蔥、蔥頭等，為百合科蔥蒜屬，是具有保健功能的蔬菜之一[1].目前中國洋蔥的種植面積位居世界第1位[2]，甘肅省是西北洋蔥的主要產(chǎn)區(qū)，2007年洋蔥的種植面積達1.2萬hm2，產(chǎn)量高達80萬t左右，經(jīng)濟效益較為顯著[3].

洋蔥青霉病是洋蔥儲運期發(fā)生比較普遍且為害嚴重的病害之一，嚴重影響洋蔥的商品價值，縮短其儲藏期.青霉病菌在自然界適應(yīng)性較強，分布極廣，寄主范圍也較廣.不僅為害蘋果和柑橘，還為害糧食、蔬菜等作物[4].由青霉菌引起的洋蔥病害，在病部可產(chǎn)生青綠霉?fàn)钗?，并且散發(fā)出強烈的霉味.洋蔥青霉病是洋蔥貯藏期的主要病害之一，目前國內(nèi)有關(guān)于洋蔥貯藏期青霉病的相關(guān)報道較少[5].明確洋蔥貯藏期青霉病病原菌的種類及其特性，對該病的防治以及洋蔥儲藏期的延長都具有重要指導(dǎo)意義.近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在微生物的分類學(xué)中常引入分子手段，特別是rDNA基因簇區(qū)域被廣泛地應(yīng)用于真菌的分類鑒定系統(tǒng)中[6].常見青霉屬病原菌有[7]：黑綠青霉(Penicilliumatramentosum)、短密青霉(P.brevicompactum)、皮落青霉(P.crustosum)、指狀青霉(P.digitatum)、擴展青霉(P.expansum)、芬尼青霉(P.fennelliae)、光孢青霉(P.glabrum)、意大利青霉(P.italicum)、波蘭青霉(P.polonicum)、鮮綠青霉(P.viridicatum)等.

本文對甘肅省不同產(chǎn)地洋蔥貯藏過程中引起采后腐爛的青霉菌進行分離與純化，篩選引起致病的青霉菌，測定其致病性，對分離到的青霉菌株進行鑒定，希望能為該病害的綜合防治提供理論依據(jù).

1材料與方法

1.1標(biāo)本采集

2013年分別于甘肅省嘉峪關(guān)市、天水市、酒泉市、平?jīng)鍪?、蘭州市采集洋蔥青霉病樣品，裝入干凈的塑料袋中，帶回實驗室.

1.2病原菌分離

病組織經(jīng)75%的酒精消毒后，取鱗莖病健交界處的組織進行分離和純化[8].將菌種上所產(chǎn)生的孢子用滅菌水洗下，適當(dāng)?shù)南♂尯?每皿中約含有30～50個孢子)，取1 mL的孢子懸浮液與已溶化的冷卻至45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基充分混勻后，倒在滅菌培養(yǎng)皿中，置于25 ℃下培養(yǎng).48 h后用打孔器將形成的單個分散的菌落切下，移到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)2～3 d，即形成小菌落[9].分別統(tǒng)計各菌株的分離頻率，編號后轉(zhuǎn)管于PDA斜面培養(yǎng)基，待鑒定.

1.3致病性測定

1.3.1孢子懸浮液的配制將培養(yǎng)7 d的菌落用含0.05% Tween20的無菌水沖洗到三角瓶中，用3層紗布過濾，配制成孢子懸浮液.將孢子懸浮液的體積濃度調(diào)整為1.0×106個/mL.

1.3.2室內(nèi)接種挑選采集地常用品種‘紅太陽’的洋蔥鱗莖，用75%的乙醇表面消毒，再用無菌水清洗干凈后晾干，進行有傷接種和無傷接種.有傷接種：采用針刺法造傷后，再用噴霧法將孢子懸浮液接種到傷口處.無傷接種：將健康的鱗莖與接菌的培養(yǎng)皿密封同放在一個干燥器內(nèi)進行培養(yǎng).置25 ℃培養(yǎng)箱中，逐日觀察鱗莖發(fā)病癥狀，并對發(fā)病鱗莖進行病原菌的再分離和純化.觀察菌落形態(tài)及孢子是否與所接病的原菌相同[10]，確定致病菌.

1.4病原菌鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)鑒定將分離到的青霉菌株分別接種到CYA、CA、G25N和WA培養(yǎng)基上，參考相關(guān)文獻[10]進行形態(tài)學(xué)鑒定.顯微鏡下分別觀察分生孢子梗及分生孢子等特征，并記錄拍照.根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，進行病原菌種的鑒定.

Czapek濃縮液：NaNO330 g，KCl 5 g，MgSO4·7H2O 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 g，H2O 100 mL；CYA培養(yǎng)基[4]：K2HPO41 g，Czapek濃縮液10 mL，酵母膏5 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，H2O 1 000 mL；CA培養(yǎng)基[11]：NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，H2O 1 000 mL；G25N培養(yǎng)基：K2HPO40.75 g，Czapek濃縮液7.5 mL，酵母膏3.7 g，甘油250 g，瓊脂15 g，H2O 750 mL；WA培養(yǎng)基：瓊脂15 g，未經(jīng)發(fā)酵的啤酒麥芽汁1 000 mL.

1.4.2rDNA-ITS序列分析

1.4.2.1病原菌的培養(yǎng)及基因組DNA提取在形態(tài)學(xué)特征鑒定的基礎(chǔ)上，將分離獲得的菌株，采用CTAB法提取DNA.分別將青霉菌菌餅在PDB(PDA不含瓊脂)培養(yǎng)液培養(yǎng)48～72 h，離心后用濾紙過濾回收菌絲體.基因組DNA的提取與純化根據(jù)修改后Paul法[12]進行,使用真菌的通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(由上海生工合成).以25 μL體系進行PCR擴增[13]，擴增后的產(chǎn)物送上海生工公司測序，將測序結(jié)果與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫中的ITS區(qū)相關(guān)序列進行同源性比較，明確其系統(tǒng)發(fā)育地位.

1.4.2.2序列分析及同源性比較將待測菌株的基因序列與GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫中的基因序列進行同源性比較，下載同源性最高的序列，并用ClustalX (1.8)軟件進行多重序列比較后，再用Mega(4.0)軟件采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2結(jié)果與分析

2.1病原菌的分離結(jié)果

從30個青霉病樣品中共分離得到233株真菌，其中108株青霉菌菌株，分離頻率為46.3%；87株鐮刀菌菌株，分離頻率為37.2%；21株灰霉菌株，分離頻率為8.9%；2株木霉菌菌株，分離頻率為0.8%；黃曲霉4株，分離頻率為1.7%；根霉12株，分離頻率為5.1%.本文除青霉屬外，其他分離物只做屬的鑒定.通過形態(tài)學(xué)觀察[14-16]，發(fā)現(xiàn)有4種青霉，編號為P1、P2、P3和P4，分別為皮落青霉、波蘭青霉、鮮綠青霉和光孢青霉，分離頻率依次為30.5%、27.8%、22.2%和19.5%，其中皮落青霉為洋蔥儲藏期青霉病的優(yōu)勢菌株.

2.2致病性測定結(jié)果

接種15 d后，在傷口接種條件下，4種青霉菌P1、P2、P3、P4均能引起發(fā)病，發(fā)病率為100%.在無傷口接種下，鱗莖的最外層表皮也會出現(xiàn)大量的青霉病斑，但內(nèi)層的鱗片健康.

表1　洋蔥鱗莖上四種青霉菌菌株分離頻率

A:有傷接種；B：無傷接種.圖1　致病性測定Fig.1　Pathogenicity test

2.3病原菌鑒定結(jié)果

2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果皮落青霉(Penicilliumcrustosum)：菌落在CYA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑35 mm，具少量的放射狀皺紋，質(zhì)地絨狀，正面呈綠色，菌絲體白色，反面呈黃褐色.菌落在CA上，25 ℃培養(yǎng)12 d，平均菌落直徑44 mm，有放射狀的皺紋，質(zhì)地絨狀，正面呈綠色，菌絲體白色，反面呈黃色.菌落在G25N上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑17 mm，平坦質(zhì)地絨狀，正面呈藍綠色，反面呈黃色.菌落在WA上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑33 mm，正面呈黃綠色，有放射狀皺紋，反面呈黃褐色.鏡檢觀察分生孢子梗直立，頂端1至多次分枝呈掃帚狀，分枝上產(chǎn)生3輪不對稱的瓶狀小梗.其頂端念珠狀著生分生孢子，球形.孢子直徑2～3 μm.

圖2　P1病原菌在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)特征和分生孢子梗(×400 )Fig.2　P1 morphological characteristic on PDA medium and it conidiophore(×400)

圖3　P1病原菌在CYA、G25N和CA培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)特征Fig.3　P1 morphological characteristic on CYA、G25N and CA medium

波蘭青霉(P.polonicum)：菌落在CYA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑50 mm，平坦，有放射狀的皺紋；質(zhì)地絨狀，正面呈暗綠色，菌絲體白色，反面呈淡黃色.菌落在CA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)12 d，平均菌落直徑41 mm，菌絲體白色，放射狀皺紋，正面呈藍綠色，反面呈黃褐色.菌落在G25N培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑11 mm，中心有臍狀的突起，質(zhì)地絨狀，正面呈翡翠綠色，反面略帶綠褐色.菌落在WA上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑48 mm，平坦，有放射狀的皺紋，質(zhì)地絨狀，正面呈綠色，反面呈微褐色.鏡檢觀察分生孢子梗無色.先端具1～3個分枝，掃帚狀，小梗頂端漸趨尖細；分生孢子呈念珠狀串生，單孢無色，近球形，大小(3.1～4.0) μm×(3.25～4.5)μm.

圖4　P2病原菌在PDA和G25N培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)特征和分生孢子梗(×400 )Fig.4　P2 morphological characteristic on G25N and PDA medium and its conidiophore(×400)

鮮綠青霉(P.viridicatum)：菌落在CYA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑34 mm，正面質(zhì)地絨狀，菌絲體白色，反面呈紅褐色.菌落在CA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)12 d，平均菌落直徑30 mm，中心突起，質(zhì)地絨狀，正面呈藍綠色，菌絲體白色，有放射狀的皺紋.菌落在WA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑38 mm，菌落反面紅黃色.菌落在G25N培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑17 mm，較厚，有放射狀的皺紋，正面呈藍綠色，絨狀；反面呈淺黃色.分生孢子梗單枝，較長，無足細胞；孢子梗頂端膨大，成帚狀，對稱，生分生孢子串；單個分生孢子為球形或橢圓形，藍色.

光孢青霉(P.glabrum)：菌落在CYA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑45 mm，質(zhì)地絨狀，分生孢子面青色，菌絲體白色，反面呈微黃色.菌落在CA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)12 d，平均菌落直徑34 mm，平坦，質(zhì)地絨狀，正面呈青色，菌絲體白色，反面呈微黃色.菌落在 G25N培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑16 mm，平坦質(zhì)地絨狀，正面呈青綠色，反面呈黃色.菌落在WA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑44 mm，正面呈青綠色，平坦，反面呈暗黃色.分生孢子梗單枝，孢子梗頂端膨大，成帚狀，較長.分生孢子大量產(chǎn)生，分生孢子面灰綠色，菌絲體白色.

圖5　P3病原菌在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)特征和分生孢子梗(×400 )Fig.5　P3 morphological characteristic on G25N and PDA medium and its conidiophore(×400)

圖6　P4病原菌在CA、G25N和PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)特征和分生孢子梗(×400 )Fig.6　P4 morphological characteristic on G25N、CA and PDA medium and its conidiophore(×400)

2.3.2rDNA-ITS序列分析利用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，在500 bp附近有一條明顯的擴增條帶(圖7).將擴增產(chǎn)物送上海生工測序，所得ITS-rDNA序列分別為549、546、544、535 bp.用ClustalX (1.8)軟件進行多重序列比較，再用Mega(4.0)軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.P1與GenBank中登記的登錄號為JN226946、JN226973的皮落青霉聚為一支；P2與登錄號為JF731260、JF731253、JF731267的波蘭青霉聚為一支；P3與登錄號為FJ623267、KC009832、AY373937的鮮綠青霉聚為一支；P4與登錄號為JN088239、HM776431、KF313078的光孢青霉聚為一支，即其親緣關(guān)系最近，同源性達到99%(圖8).結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，進一步證明P1為皮落青霉菌，P2為波蘭青霉菌，P3為鮮綠青霉菌，P4為光孢青霉菌.

圖7　TS-rDNA序列的擴增Fig.7　PCR product of ITS

圖8　青霉菌屬的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8　The phylogenetic tree of Penicillium sp.

3討論

本試驗采用組織分離法對甘肅省5個地區(qū)的洋

蔥貯藏期青霉病病原菌進行了分離，共得到108株青霉菌菌株，分離頻率為46.3%，其中皮落青霉(P.crustosum)、波蘭青霉(P.polonicum)、鮮綠青霉(P.viridicatum)和光孢青霉(P.glabrum)分離頻率分別為30.5%、27.8%、22.2%和19.5%.這4種青霉菌均可引起作物貯藏期的青霉病害，皮落青霉是引起柑橘和長棗采后貯藏期病害的病原菌之一[6,17]，波蘭青霉是引起柑橘采后青霉病的病原之一[6]，鮮綠青霉為玉米、高粱和伽師瓜采后青霉病的主要病原菌[18-20]，光孢青霉是引起藏茶貯藏期病害的病原菌[21].Duduk等[22]研究發(fā)現(xiàn)波蘭青霉菌是洋蔥貯藏期青霉病的主要病原菌，而本試驗發(fā)現(xiàn)引起甘肅省洋蔥貯藏期青霉病的病原菌優(yōu)勢種為皮落青霉，其次為波蘭青霉.引起優(yōu)勢種差異的原因可能是由于洋蔥品種以及地域、溫度和濕度等自然條件所造成.

在致病性測定中，皮落青霉、波蘭青霉、鮮綠青霉和光孢青霉在有傷和無傷的條件下均能引起洋蔥的發(fā)病，說明青霉菌可通過傷口進行侵染發(fā)病，分生孢子也可隨氣流傳播，落在洋蔥表皮上，引起洋蔥鱗莖的感染，從而發(fā)病導(dǎo)致洋蔥品質(zhì)的下降.

關(guān)于洋蔥的采后病害研究較多，很多學(xué)者分別從黑曲霉、鐮刀菌等角度入手[5].但有關(guān)洋蔥貯藏期的青霉病害國內(nèi)研究報道較少.由于青霉屬的種及相似種在菌落形狀和顏色上差別不大，因此給其鑒定帶來一定的困難[23].傳統(tǒng)方法上，可以通過孢子大小、形狀、分生孢子梗的形態(tài)和菌落形態(tài)等進行鑒定，但是這些標(biāo)準由于受到實驗經(jīng)驗、個人因素和外界的影響，且自身易變、易重疊，不好嚴格界定[24,25].隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，rDNA基因區(qū)域被廣泛運用在果蔬類采后致病真菌的分離和鑒定上[26-27].rDNA-ITS是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之間的間隔序列，在不同真菌種類之間變化較多，但在同一種真菌中非常保守[28].所以，ITS基因序列可以被廣泛運用在真菌分離，系統(tǒng)發(fā)育分析和鑒定中.因此，本研究以形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ)，基因序列分析為輔助鑒別手段，有效提高了病原菌鑒定結(jié)果的準確性.

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(責(zé)任編輯胡文忠)

Isolation and identification ofPenicilliumspecies during storage of onions

SU Jian-hong1，2,GUO Cheng2,ZHANG Jun-gao1,QI Yong-hong2,CAO Su-fang3,LI Min-quan1,2

(1.College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Institute of Plant Protection,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China;3.Institute of Fruit and Floriculture,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 In order to know Penicillium species and its pathogenicity during storage of onions in Gansu province.【Method】 Pathogens were isolated and cultivated purely by conventional tissue isolation method from 108 samples collected from 5 counties in Gansu.【Result】 The strains isolation frequency reached 46.3%,among which Penicillium P1,P2,P3 and P4 was 30.5%,27.8%,22.2% and 19.5%,respectively.P1 was the dominant pathogen of all strains.Using morphological and rDNA-ITS molecular biology method,P1,P2,P3 and P4 were identified as Penicillium crustosum,P.polonicum,P.viridicatum and P.glabrum,respectively.The pathogenicity test showed that strains P1,P2,P3 and P4 all caused Penicillium disease symptoms on the condition of wound or no wound.【Conclusion】 P.crustosum,P.polonicum,P.viridicatum and P.glabrum are the pathogens during storage of onions.

Key words：onion;Penicillium disease;Penicillium pathogen species;pathogens pathogenicity

通信作者：李敏權(quán)，男，博士，博導(dǎo)，研究員，主要從事農(nóng)作物病害研究.E-mail:lmq@gsau.edu.cn

基金項目：甘肅省嘉峪關(guān)市科技計劃項目(12-51，036-036034)；甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新專項(2014GAAS23)；國家自然科學(xué)基金項目(31000845).

收稿日期：2015-02-23；修回日期：2015-03-25

中圖分類號：S 432.1

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)01-0095-07

第一作者：蘇建紅(1987-)，男，碩士研究生，主要從事植物病害研究.E-mail:304846831@qq.com