琚淑明，朱偉玲，王偉亮，高 云，馬濤

(1.徐州工程學(xué)院，江蘇 徐州　221000，2.徐州珍稀植物快速繁育工程技術(shù)中心，江蘇 徐州　221000)

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鐵皮石斛莖段離體培養(yǎng)一次成苗技術(shù)研究

琚淑明1,2，朱偉玲1，王偉亮1，高 云2，馬濤2

(1.徐州工程學(xué)院，江蘇 徐州221000，2.徐州珍稀植物快速繁育工程技術(shù)中心，江蘇 徐州221000)

摘要：【目的】 簡化鐵皮石斛繁育流程，縮短育苗周期.【方法】 以鐵皮石斛莖段為外植體，研究了鐵皮石斛莖段組織培養(yǎng)一次成苗技術(shù).【結(jié)果】 70%的乙醇30 s+1‰升汞10 min消毒效果較好,外殖體污染率為43%,誘導(dǎo)率達(dá)97%；一次成苗培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 3 mg/L+香蕉泥100 g/L+瓊脂7‰+蔗糖25 g/L增殖及生長情況最好；在該組培系統(tǒng)中鐵皮石斛適宜的繼代周期為50 d，成苗率100%，平均根數(shù)5.4，繁殖系數(shù)5.6；鐵皮石斛叢生芽移栽以腐葉土和腐葉土∶河沙(1∶1)兩種基質(zhì)的成活率高，且生長健壯.【結(jié)論】 本技術(shù)簡化了鐵皮石斛組培工藝流程，縮短了育苗周期，降低了生產(chǎn)成本，適用于規(guī)模化生產(chǎn).

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；莖段；組織培養(yǎng)；一次成苗

鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是一種名貴珍稀中藥材，同時(shí)具有極高的觀賞價(jià)值[1].鐵皮石斛野生資源由于過度采挖及生境惡化已瀕臨滅絕[2].近年來，為了滿足市場需求，鐵皮石斛實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化生產(chǎn)，種苗主要通過組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖獲得[3].組織培養(yǎng)一次性成苗技術(shù)是用一種培養(yǎng)基完成整個(gè)成苗過程，得到符合出甁標(biāo)準(zhǔn)的小苗，避免了誘導(dǎo)、增殖、生根3個(gè)階段中使用不同的培養(yǎng)基，從而極大地簡化了組織培養(yǎng)流程.鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究中，以種子為外植體的一次成苗研究較多[4-5]，而以莖段為外植體的一次成苗技術(shù)研究鮮有報(bào)道.但鐵皮石斛適宜作外植體的種子可獲得量少，難以滿足生產(chǎn)需求.本研究以莖段為外植體材料，進(jìn)行一次成苗技術(shù)研究，旨在簡化工藝流程，縮短育苗時(shí)間，降低育苗成本,篩選出鐵皮石斛一次成苗的適宜培養(yǎng)基，以推進(jìn)鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程.

1材料與方法

1.1材料

鐵皮石斛為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院贈送.選取健康鐵皮石斛植株，以莖段為外植體.

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1無菌苗的獲得鐵皮石斛植株流水沖洗1 h，取長0.5～0.8 cm帶節(jié)莖段，去除葉片保留葉鞘.采用常規(guī)消毒技術(shù)，設(shè)70%乙醇30 s+1‰ 升汞80 min，70%乙醇30 s+1‰升汞10 min和70% 乙醇+1‰ 升汞15 min 3個(gè)消毒處理(表1).蒸餾水沖洗4～5次，接種30 d，統(tǒng)計(jì)污染率，誘導(dǎo)及生長情況.

1.2.2一次成苗培養(yǎng)基激素篩選以1/2MS為基本培養(yǎng)基，以無菌苗為材料，截取0.5～0.8 cm的帶節(jié)莖段，接種在不同的培養(yǎng)基上，共6個(gè)處理，接種外植體培養(yǎng)45 d，統(tǒng)計(jì)不定芽增殖及生根情況，篩選適宜的激素種類及濃度(表2).

1.2.3一次成苗基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選以無菌苗為材料，截取0.5～0.8 cm的帶節(jié)莖段，以MS和1/2MS為培養(yǎng)基分別添加NAA 0.5 mg/L和6-BA 3 mg/L，共2個(gè)處理，接種外植體培養(yǎng)45 d，統(tǒng)計(jì)不定芽增殖及生根情況，篩選適宜的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(表3).

1.2.4組培苗培養(yǎng)條件溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度2000 lx，瓊脂7‰，香蕉泥100 g/L，蔗糖25 g/L，pH 5.8.

1.2.5組培苗馴化盆栽試驗(yàn)，清水洗去組培苗芽叢基部培養(yǎng)基，栽植于河沙、腐葉土及河沙∶腐葉土1∶1的基質(zhì)中，設(shè)根系全入土和根系部分入土兩種埋根方式，共6個(gè)處理，馴化栽培30 d，統(tǒng)計(jì)成活率,觀察組培苗生長情況，空氣濕度保持在70%以上，溫度20～25 ℃(表4).

1.3測定指標(biāo)與方法

每個(gè)處理接種30瓶，每瓶接種5個(gè)外植體.污染率、誘導(dǎo)率、芽增殖系數(shù)、生根率、愈傷率計(jì)算公式如下.

污染率(%)=未污染瓶數(shù)/30(接種瓶數(shù))

誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出芽苗數(shù)/未污染的接種數(shù)

芽增殖系數(shù)(%)=統(tǒng)計(jì)時(shí)芽苗數(shù)/150(接種外植體數(shù))

生根率(%)=生根株數(shù)/150(接種外植體數(shù))

愈傷率(%)=形成愈傷數(shù)/150(接種外植體數(shù))

1.4數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒方法對外植體存活率的影響

研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛莖段外植體對消毒劑非常敏感(表1).在3個(gè)處理中，70%的乙醇30 s +1‰升汞15 min消毒，污染率明顯下降，但是誘導(dǎo)率也相應(yīng)降低.該處理20%莖段變白，死亡，誘導(dǎo)的不定芽后期生長緩慢，葉綠素降低.而70%的乙醇30 s +1‰升汞80 min處理，污染率高達(dá)77%，但誘導(dǎo)率高，死亡率低.70%的乙醇30 s +1‰升汞10 min效果最好，污染率43%，誘導(dǎo)率為97%，誘導(dǎo)的不定芽生長健壯，葉色由起初的黃綠色變?yōu)榫G色.

表1　不同消毒方法對外植體存活率的影響(30 d)

2.2不同培養(yǎng)基對于成苗效應(yīng)的影響

2.2.1不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對成苗的影響取無菌苗為材料，以帶節(jié)的莖段為外植體誘導(dǎo)成苗，接種45 d統(tǒng)計(jì)成苗情況.結(jié)果表明，莖段接種后10 d左右有不定芽萌動，一般在莖節(jié)形成不定芽，而17 d左右形成不定根.但不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導(dǎo)、增殖及生根效應(yīng)不同.試驗(yàn)表明(表2)，生長素NAA為0.5 mg/L，細(xì)胞分裂素6-BA在1.5～3 mg/L區(qū)間，芽及根的誘導(dǎo)率及生長隨著6-BA質(zhì)量濃度增加明顯改善，尤其是苗高、莖粗、根長及根數(shù)達(dá)到極顯著水平；但當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度增加到4.5 mg/L時(shí)，對鐵皮石斛不定芽誘導(dǎo)及生長有明顯的抑制作用，而對根的生長沒有明顯影響.6-BA為3 mg/L，NAA在0.3～0.5 mg/L區(qū)間，芽及根的生長隨著NAA質(zhì)量濃度增加明顯改善，尤其是不定芽誘導(dǎo)率、苗高、莖粗、根長達(dá)到極顯著水平;當(dāng)NAA質(zhì)量濃度增加到0.7 mg/L時(shí)，對鐵皮石斛不定芽誘導(dǎo)及生長有明顯的抑制作用，而對根的生長具有很好的促進(jìn)作用，根長及根數(shù)達(dá)到極顯著水平.總體指標(biāo)統(tǒng)計(jì)及觀察表明，1/2MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 3 mg/L+香蕉泥100 g/L增殖率明顯高于其他處理，苗平均高度及粗度較其他處理高.觀察發(fā)現(xiàn)此處理獲得的培養(yǎng)苗生長健壯，葉色嫩綠，整齊度高.1/2 MS+NAA 0.7 mg/L+6-BA 3 mg/L+香蕉泥100 g/L，根系明顯伸長，1/2 MS+ NAA 0.3 mg/L+6-BA 3mg/L+香蕉泥100 g/L，根系明顯伸長，不定芽及不定根生長緩慢，植株細(xì)弱.

2.2.2不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對成苗的影響以MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 3 mg/L+香蕉泥100 g/L為培養(yǎng)基，組培苗生長正常，顏色嫩綠，但是苗高、莖粗、平均根數(shù)和根長都顯著低于1/2 MS+ NAA 0.5 mg/L+6-BA 3 mg/L+香蕉泥100 g/L培養(yǎng)基，不定芽不定根生長緩慢，增殖率降低，不定根誘導(dǎo)時(shí)間較長.

表2　不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對成苗的影響(45 d)

同列肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.05).

表3　不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對成苗的影響(45 d)

同列肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

2.3栽培基質(zhì)對組培苗成活率的影響

由表4可知，鐵皮石斛組培苗栽植根系全部入土成活率明顯低于根系部分入土的情況，而以通氣性較好的腐葉土和腐葉土∶河沙(1∶1)兩種栽培基質(zhì)為佳，組培苗移栽成活率均達(dá)100%.

3討論

有關(guān)鐵皮石斛組織培養(yǎng)的研究報(bào)道較多[6-9]，涉及外植體選擇、培養(yǎng)基篩選、馴化栽培技術(shù)等.但現(xiàn)存組織培養(yǎng)技術(shù)工藝流程繁雜[5,10-12],鐵皮石斛以莖段為外植體組織培養(yǎng)程序一般包括不定芽誘導(dǎo)、增殖、生根和移栽馴化，培養(yǎng)時(shí)間長，僅在瓶中就需要120 d左右，誘導(dǎo)后增殖與生根也需要80 d左右.程序繁雜，耗費(fèi)人力物力，增加了組培苗的成本[13-15].本試驗(yàn)是在前人研究的基礎(chǔ)上對鐵皮石斛快繁技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，合并不定芽誘導(dǎo)、增殖、生根培養(yǎng)3部操作為一步，僅需要50 d，優(yōu)化了鐵皮石斛的快繁程序，獲得組織培養(yǎng)苗健壯，可用于大規(guī)模生產(chǎn).

表4　不同栽培基質(zhì)對組培苗的影響(30 d)

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Direct regeneration of seedling from stem fragments of dendrobium candidum

JU Shu-ming1,2,ZHU Wei-ling1,WANG Wei-liang1，GAO Yun2，MA Tao2

(1.Xuzhou Engineering College,Xuzhou 221008,China;2.Engineering Research Centre of Plant for the Fast Propagation Technology,Xuzhou 221008,China)

Abstract：【Objective】 This study aim was to simplify the fast-propagation procedure and short the seedling culture time.【Method】 The stem section of Dendrobium candidum was used as experiment material,the technology on direct regeneration seedlings was studied by fast-propagation.【Result】 The optimum disinfection method was surface sterilization seedlings with 70% ethanol for 30 s,and 1‰ mercuric chloride for 10 min.Optimum seedling cultivation medium was 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 3 mg/L+banana puree 100 g/L+agar 7‰+sugar 25 g/L.Meanwhile,the suitable cycle of subculture in fixed was 50 days.The rooting rate reached 100%,the mean number of roots reached 5.2,and the effective propagation coefficient reached 5.6 after 45 days.Peat and peat river sand (1∶1) were the good transplantion matrix.【Conclusion】 It is suggested that the method shorts the cycle of seedling cultivation,lows the production cost.

Key words：Dendrobium candidum；stem section；tissue culture;direct regeneration seedlings

基金項(xiàng)目：國家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2013GA690441)；徐州科技計(jì)劃項(xiàng)目(XM13B124).

收稿日期：2014-12-23；修回日期：2015-01-09

中圖分類號：S 567.23+9；Q 813.1+3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)01-0045-04

第一作者：琚淑明(1974-)，女，副教授，博士研究生，主要研究方向?yàn)橹参锷砑胺治錾飳W(xué).E-mail：1239038921@qq.com