廖 妮

(攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,四川攀枝花617000)

基于PtNFs-GOD復(fù)合材料的電致化學(xué)發(fā)光葡萄糖生物傳感器的研究

廖 妮*

(攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,四川攀枝花617000)

采用一鍋合成法制備了新型的具有大比表面積的花狀鉑納米顆粒（PtNFs），將制備好的花狀鉑納米顆粒與聚乙烯醇縮丁醛（PVB）的乙醇溶液混合，用溶膠-凝膠法使葡萄糖氧化酶（GOD）固定于玻碳電極上，構(gòu)建了一個高靈敏電致化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器用于檢測葡萄糖。基于PtNFs-GOD修飾的葡萄糖生物傳感器顯示出了良好的性能，其檢測線性范圍為1.00×10-5~3.00×10-4mol/L,檢測下限為0.33×10-6mol/L。該生物傳感器重現(xiàn)性、選擇性與穩(wěn)定性好、使用壽命較長，回收率在96.81%~100.98%之間，可應(yīng)用于實際樣品葡萄糖含量的檢測。

花狀鉑納米顆粒；電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器；葡萄糖

0 引言

葡萄糖是生命活動中不可缺少的碳水化合物，也是人體新陳代謝的重要營養(yǎng)物質(zhì)。許多的慢性疾病比如心血管疾病、高血糖、肥胖癥、糖尿病都與葡萄糖密切相關(guān)。因此，葡萄糖含量檢測對于評估人體健康狀況具有非常重要的意義！目前，測定葡萄糖的方法主要有分光光度法[1]、高效液相色譜法[2]、毛細(xì)管電泳法[3]等，然而這些方法操作復(fù)雜、分析速度慢、成本較高，且在檢測范圍和靈敏度方面很難達(dá)到低濃度檢出限。因此，發(fā)展能夠快速、簡便、靈敏地檢測低濃度葡萄糖的方法，具有十分重要的現(xiàn)實意義。

電致化學(xué)發(fā)光（ECL）是近些年發(fā)展起來的一種新型分析方法[4]。由于其簡單、快速、靈敏,可控及低背景等特點，該方法被廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域，如環(huán)境污染物監(jiān)測，藥物分析及人體相關(guān)生物分子的檢測等[5-6]。S2O82--O2體系的ECL發(fā)光現(xiàn)象由于其經(jīng)濟(jì)、簡單的優(yōu)點，該ECL體系被逐漸受到越來越多的關(guān)注[7]。

葡萄糖氧化酶對葡萄糖具有高的選擇性和靈敏度，常被用于制備各種生物傳感器，以滿足葡萄糖檢測的需要。研究表明，葡萄糖氧化酶（GOD）和辣根過氧化物酶（HRP）可以協(xié)同催化底物中的葡萄糖水解并產(chǎn)生O2，進(jìn)而實現(xiàn)S2O82--O2ECL體系信號的放大及穩(wěn)定性的提高。近年來，葡萄糖傳感器由于靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單等優(yōu)點已成為生化分析和臨床檢驗等方面的一個重要研究方向。

在該工作中，該文課題組提出一種仿雙酶協(xié)同催化原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑的策略，并成功將其應(yīng)用于S2O82--O2ECL體系，實現(xiàn)了信號的放大及穩(wěn)定性的提高。因此，在該文中該文課題組制備了具有大比表面積的花狀鉑納米顆粒，鉑納米顆粒具有模擬辣根過氧化物酶（HRP）的作用，并且與GOD酶性質(zhì)相結(jié)合，論證仿雙酶標(biāo)記可以大大增強(qiáng)過硫酸根體系的ECL信號。利用GOD和PtNFs同時作為標(biāo)記物，通過GOD的催化作用產(chǎn)生H2O2，接著被PtNFs催化原位產(chǎn)生高濃度的O2，從而克服了上述缺陷，從而實現(xiàn)葡萄糖的超靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司、中科院長春應(yīng)化所)；掃描電子顯微鏡(S-4800，日本Hitachi Instrument公司)。實驗采用的三電極體系，修飾過的玻碳電極(GCE，Φ=4 mm)為工作電極，鉑電極為輔助電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。

過硫酸鉀（K2S2O8）購于上?？颠_(dá)氨基酸廠；氯鉑酸(H2PtCl6)購于Sigma公司；葡萄糖氧化酶（GOD）購于上海生化有限公司；磷酸緩沖溶液（PBS，0.1 mol/L，pH7.4）是用0.1 mol/L KH2PO4，0.1 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L KCl混合配制而成；其他試劑均為分析純試劑，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 花狀鉑納米顆粒（PtNFs）的制備

花狀鉑納米顆粒（PtNFs）的制備是采用一鍋合成法制得的。步驟如下：首先稱取0.0421 g多巴胺（DA）作為還原劑，溶于10 mL水中形成混合均勻的溶液。向上述溶液中加入20 μL 0.5% Nafion溶液和1 mL 1%H2PtCl6溶液。持續(xù)攪拌一個小時使得H2PtCl6充分還原。這里使用Nafion是為了使DA還原生成的Pt納米顆粒聚集生成具有更大表面積的花狀鉑納米顆粒（PtNFs）。

1.3 葡萄糖傳感器的制備

在電極修飾之前，首先將玻碳電極（GCE，Φ =4 mm）分別用0.3及0.05 μm的三氧化二鋁（Al2O3）粉在麂皮上打磨、拋光，然后用蒸餾水洗凈并依次用乙醇和蒸餾水超聲清洗干凈，最后將其置于室溫下晾干備用。

取10 μL 12 mg/L的葡萄糖氧化酶 (GOD)溶液與5 mL的鉑納米顆粒溶液混勻，加入到5 mL 2%聚乙烯醇縮丁醛(PVB)的無水乙醇凝膠溶液中混合均勻，取10 μL上述混合液滴加到GCE上靜置12 h，然后真空干燥，獲得GOD-PtNFs納米粒子修飾的玻碳電極(GOD-PtNFs/GCE)，保存在4℃冰箱中備用。

1.4 檢測方法

采用MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)對所修飾電極的電致化學(xué)發(fā)光行為進(jìn)行研究，將所制得修飾電極置于測試底液為3 mL含有0.1 mol/L K2S2O8和不同濃度的葡萄糖PBS(pH7.4)緩沖溶液檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米材料的表征

對所制備納米材料的微觀形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)用掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行了表征。從圖1上可以看出PtNFs是團(tuán)簇的花狀結(jié)構(gòu)，說明加入少量的Nafion能夠使得合成的鉑納米顆粒具有更大的表面積。

圖1 PtNFs掃描電鏡表征圖Fig.1 SEM of PtNFs

2.2 GOD用量的選擇

實驗考查了酶電極GOD-PtNFs/GCE在制備過程中受不同濃度GOD用量的影響。當(dāng)GOD濃度分別為2、4、8、12、16、20 mg/L時，所制備的傳感器對3.0×10-5mol/L葡萄糖的響應(yīng)電流情況如圖2所示。由圖2可以看出，電極的ECL響應(yīng)信號強(qiáng)度隨著GOD濃度的增加而增大，在12 mg/L時達(dá)到飽和不再增大，由此可以確定GOD的最佳濃度為12 mg/L。

圖2 GOD-PtNFs受不同濃度GOD用量的影響Fig.2 Effect of the GOD concentration on the GODPtNFs/GCE biosensor

2.3 葡萄糖傳感器的響應(yīng)性能

2.3.1 傳感器的線性范圍及檢測限

實驗考查了酶電極GOD-PtNFs/GCE對不同濃度葡萄糖的響應(yīng)情況。隨著葡萄糖濃度的增加，電極響應(yīng)的峰電流值也逐漸增加，圖3為GOD-PtNFs/GCE響應(yīng)葡萄糖的校正曲線。從圖中可知，傳感器在1.00×10-5~3.00×10-4mol/L范圍內(nèi)的響應(yīng)電流與葡萄糖濃度成線性關(guān)系，其校正曲線方程可擬合為：I=28.302 c+3476.6，(c為葡萄糖濃度；I為峰電流響應(yīng)值，r2=0.99)。檢測下限為0.33×10-6mol/L。

圖3 ECL生物傳感器在不同的葡萄糖濃度下的ECL-時間曲線，插入圖為線性斜率圖Fig.3 ECL-time curves of the biosensor with different concentrations of glucose in 0.1 mol/L PBS(pH7.4) containing 0.1 mol/L K2S2O8.glucose concentration:(a)10 μmol/L,(b)30 μmol/L,(c)80 μmol/L,(d)160 μmol/L,(e) 240 μmol/L,(f)300 μmol/L.The insert is the relationship between ECL intensity and the concentration of glucose. The voltage of the photomultiplier tube was set at 800 V.Scan rate,100 mV/s

2.3.2 傳感器的重現(xiàn)性、選擇性、穩(wěn)定性和使用壽命

將按照上述方法制備好的GOD-PtNFs/GCE在1.60×10-4mol/L的葡萄糖溶液中來回進(jìn)行6次測試，表明該傳感器在兩種溶液響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.50%,說明傳感器的重現(xiàn)性較好。選擇性是傳感器能否應(yīng)用的一個重要考核指標(biāo)。實驗考察了該電極在1.60×10-4mol/L葡萄糖溶液中分別加入20倍濃度的抗壞血酸、尿酸、果糖后的電流響應(yīng)情況，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)明顯的電流增強(qiáng)響應(yīng)信號，說明抗壞血酸、尿酸、果糖等對葡萄糖傳感器無明顯的干擾。

傳感器的穩(wěn)定性是分析檢測應(yīng)用的一個重要性能指標(biāo)。 實驗考察了該電極在 1.60×10-4mol/L葡萄糖溶液中連續(xù)檢測9圈，其ECL相應(yīng)響應(yīng)過程如圖4所示，其ECL電流響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.86%，說明該傳感器具有較好的穩(wěn)定性。并且該電極經(jīng)過15 d使用后，響應(yīng)電流下降至最初值的90%，說明傳感器具有良好的穩(wěn)定性且至少可以使用12 d。

圖4 生物傳感器的穩(wěn)定性Fig.4 The stability of the proposed ECL biosensor

2.3.3 生物傳感器催化機(jī)理

PtNFs-GOD修飾到電極表面后，GOD催化底液中的葡萄糖產(chǎn)生H2O2，H2O2被仿HRP酶作用的PtNFs催化原位產(chǎn)生大量的共反應(yīng)劑O2，其涉及的反應(yīng)用公式表示如下：

從而循環(huán)往復(fù)，大大增強(qiáng)ECL光信號，進(jìn)而大大提高了反應(yīng)靈敏度?？赡艿臋C(jī)理為[8]：

2.3.4 傳感器的回收率與分析應(yīng)用

將按照上述方法制備好的GOD-PtNFs/GCE，對實驗室配制的5個葡萄糖樣品溶液的濃度進(jìn)行了加標(biāo)回收測試，結(jié)果表明其回收率在96.81% ~100.98%之間（見表1），說明GOD-PtNFs/GCE能夠較好地應(yīng)用于葡萄糖的快速檢測。

表1 傳感器的回收結(jié)果（n=5）Tab.1 The recovery of the glucose biosensor

3 結(jié)論

該文探討了一種基于花狀鉑納米顆粒修飾電極用于葡萄糖檢測的生物傳感器。提出了仿雙酶循環(huán)反應(yīng)原位產(chǎn)生共反應(yīng)劑促進(jìn)ECL反應(yīng)的有效放大策略，成功的提高了檢測靈敏度，擴(kuò)大了檢測范圍，所構(gòu)建的生物傳感器也顯示了良好的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。因此，該工作提供了一個新穎的信號放大策略并可望應(yīng)用于實際樣品葡萄糖含量的檢測。

[1]張家慶.血糖及其他體液葡萄糖測定進(jìn)展[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2003,8(19):333-335.

[2]閆家偉,黃運瑞,武江旭,等.鐵-鄰菲羅啉分光光度法測定微量葡萄糖[J].南陽師范學(xué)院學(xué)報,2004,9(12): 256-258.

[3]董曉東,侯宛玲,蘇紹哲,等.高效液相色譜法測定葡萄糖和甘露醇[J].分析化學(xué),2000,28(5):656-657.

[4]Wang H J,Yuan R,Chai Y Q,et al.An ultrasensitive peroxydisulfate electrochemiluminescence immunosensor for Streptococcus suis serotype 2 based on L-cysteine combined with mimicking bi-enzyme synergetic catalysis to in situ generate coreactant[J].Biosens.Bioelectron., 2013,43:63-68.

[5]Wu Y,Shi H,Yuan L.A novel electrochemiluminescence immunosensor via polymerization-assisted amplification [J].Chem.Commun.,2010,46:7763-7765.

[6]Zanarini S,Rampazzo E,Ciana L D.Ru(bpy)3covalently doped silica nanoparticles as multicenter tunable struc-tures for electrochemiluminescence amplification[J].J. Am.Chem.Soc.,2009,131:2260-2267.

[7]Wang H J,Yuan R,Chai Y Q,et al.Bi-enzyme synergetic catalysis to in situ generate coreactant of peroxydisulfate solution for ultrasensitive electrochemiluminescence immunoassay[J].Biosens.Bioelectron.,2012,37: 6-10.

[8]Reshetnyak O V,Koval`chuk E P,Skurski P,et al.The origin of luminescence accompanying electrochemical reduction or chemical decomposition of peroxydisulfates [J].J.Lumin.,2003,105:27-34.

Electrochemiluminescence biosensor based on PtNFs-GOD composite materials for the determination of glucose

Liao Ni*
(College of Biological and Chemical Engineering,Panzhihua University,Panzhihua 617000,China)

In this paper,a novel electrochemiluminescence biosensor for the detection of glucose was proposed based on flower-like platinum nanoparticles(PtNFs)via an one-pot chemical synthesis method.Glucose biosensors were formed in optimal conditions with glucose oxidase (GOD)immobilized glassy carbon electrode,which was composed of platinum nanoparticles and polyvinyl butyral(PVB)with sol-gel method.The present glucose biosensor showed a wide linear range of 1.00×10-5mol/L to 3.00×10-4mol/L,with a low detection limit of 0.33×10-6mol/L for detecting glucose.The glucose biosensor possessed nice reproducibility,selectivity,stability and long lifetime with a recovery of 96.81%~100.98%,which can be well applied to determination of glucose in actual samples.

flower-like structures platinum nanoparticles；electrochemiluminescence biosensor；glucose

*通信聯(lián)系人