鄧 煒，雷燕梅，徐 暢，祁 樂，茍?zhí)壹?明*

（1.重慶市三峽庫區(qū)農(nóng)業(yè)面源污染控制工程技術(shù)研究中心，西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶400715)

(2.重慶市建設(shè)用地事務(wù)中心，重慶400015)

(3.重慶市納米材料及傳感技術(shù)工程實驗室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715)

(4.重慶市煙草專賣局，重慶400023）

基于聚乙烯亞胺還原的金納米顆粒為基底構(gòu)建的“signal on”型高靈敏ECL傳感器鉛離子檢測

鄧 煒1,2，雷燕梅3，徐 暢4，祁 樂1，茍?zhí)壹?，高 明1*

（1.重慶市三峽庫區(qū)農(nóng)業(yè)面源污染控制工程技術(shù)研究中心，西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶400715)

(2.重慶市建設(shè)用地事務(wù)中心，重慶400015)

(3.重慶市納米材料及傳感技術(shù)工程實驗室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715)

(4.重慶市煙草專賣局，重慶400023）

該實驗結(jié)合目標物循環(huán)與雜交鏈式反應(yīng)（HCR）信號放大策略，構(gòu)建了用于檢測Pb2+的“signal on”型ECL生物傳感器。該傳感器可以通過Pb2+和脫氧核酶的特異識別作用，循環(huán)剪切固載在電極表面的發(fā)卡型底物鏈H0，在實現(xiàn)目標物循環(huán)的同時使得電極表面越多的H0被剪切為DNA殘鏈，獲得的DNA殘鏈繼而作為引物打開發(fā)夾探針H1和H2引發(fā)HCR反應(yīng)，形成由H1和H2交替雜交形成的長雙鏈聚合物。這些雙鏈聚合物可以通過靜電吸附作用固載大量的鄰菲羅啉釕配合物（Ru(phen)32+）。利用固載在電極基底的PEIAu復(fù)合納米材料對發(fā)光試劑的共反應(yīng)作用顯著放大檢測信號，構(gòu)建了對Pb2+的“signal on”模式ECL檢測新方法。實驗結(jié)果表明，在Pb2+濃度范圍為1×10-12mol/L~1×10-8mol/L之間，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其檢出限為3.33×10-13mol/L。

鄰菲羅啉釕配合物；“signal on”；PEI-Au復(fù)合納米材料；共反應(yīng)試劑

0 引言

通常，生物識別探針（如蛋白，酶，抗體，適體）含有或較容易修飾上氨基或巰基，這使得金納米顆粒往往可以用來標記生物識別探針[1-3]。以氯金酸（HAuCl4）為前驅(qū)體，在還原劑的作用下得到金納米顆粒。其還原劑不僅可以將AuCl4-還原為Au(0)，同時還能作為穩(wěn)定劑結(jié)合在金納米顆粒表面。聚乙烯亞胺（PEI）是一種水溶性的高分子聚合物，其單體中含有2個碳原子和1個氮原子，分支狀的PEI分子中含有伯胺、仲胺和叔胺，且每個氨基都能質(zhì)子化[4]，因此PEI既具有還原性同時又是ECL釕配合物的有效共反應(yīng)試劑[5]。以PEI為還原劑制備金納米顆粒復(fù)合材料（PEI-Au），PEI不僅可以修飾到金納米顆粒表面通過共價作用來固載適體探針[6]，而且可以作為釕配合物的共反應(yīng)試劑[7]，增強ECL響應(yīng)信號。

納米金剛石作為碳納米材料的一員，其具有極大的比表面能和較高的比表面積，且其透光優(yōu)異[8]。但是，納米金剛石在介質(zhì)中分散穩(wěn)定性差，容易發(fā)生團聚，使得納米金剛石的應(yīng)用必須要解決其在介質(zhì)中的分散性及穩(wěn)定性問題。其中，高分子陽離子交換劑Nafion良好的成膜性質(zhì)和較大的黏度可以使得納米金剛石均勻的分散到其中，由于其具有良好的穩(wěn)定性，因此可用于電極表面修飾，且Nafion-納米金剛石復(fù)合膜表面呈負電荷，可以通過靜電吸附作用進一步固載PEIAu納米復(fù)合物[9]?；诖耍搶嶒灷媚繕宋镅h(huán)和雜交鏈式反應(yīng)（HCR）信號放大策略，構(gòu)建用于檢測Pb2+的“signal on”型ECL生物傳感器。選擇鄰菲羅啉釕配合物（Ru(phen)32+）為ECL發(fā)光試劑，使其嵌入雙鏈DNA聚合物中，再在PEI-Au的共反應(yīng)作用下，顯著放大檢測信號，從而實現(xiàn)對Pb2+的靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

聚乙烯亞胺 (PEI)、Nafion(w=5%)、氯金酸（HAuCl4）和 6-巰基己醇 （MCH）購于美國Sigma-Aldrich公司；納米金剛石（ND）購于百靈威科技有限公司；鄰菲羅啉釕（Ru(phen)32+）購于蘇州鈉凱科技有限公司；磷酸緩沖溶液（PBS，0.1 mol/L，pH7.4）是由0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L KH2PO4和0.1 mol/L KCl混合配制而成；50 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH7.4）用于配制適體溶液；所用其它試劑均為分析純或優(yōu)級純，實驗用水均為二次去離子水。DNA單鏈由大連寶生物合成，對應(yīng)的序列為：

MPI-A型電致化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁電子科學(xué)技術(shù)有限公司，中國）用于ECL檢測；利用CHI600E型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司，中國）用于電化學(xué)相關(guān)表征；檢測過程中使用三電極體系，即用修飾了的玻碳電極（GCE,Φ=4 mm）作為工作電極，鉑電極作為對電極及Ag/AgCl（飽和KCl）電極作為參比電極。BRANSONIC 200超聲清洗儀 （德國BRANSON ULTRASCHALL公司）；MP230酸度計 （瑞士Metter Toledo公司）用于調(diào)節(jié)pH；SCZL-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(上海KANG-YI儀器有限公司，中國)用于加熱和攪拌；TGL-20M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。AB204-S電子天平(瑞士Metter Toledo公司)用于稱量。納米材料的形貌用掃描電子顯微鏡（SEM,S-4800，日本Hitachi Instrument公司）表征，加速電壓為15~20 kV。

1.2 PEI還原的納米金顆粒（PEI-AuNPs）的制備

用PEI作為還原劑制備金納米顆粒 （PEIAuNPs）的步驟如下：首先，50 μL PEI（5%）溶于100 mL去離子水中，再加入100 μL HAuCl4溶液（1%），混合攪拌過夜，利用靜電吸附作用將AuCl4-吸附在帶正電的聚乙烯亞胺樹枝上。然后，將混合溶液加熱到50℃，可以觀察溶液的顏色由淡黃色變?yōu)樗{色，說明納米金顆粒的生成。最后，停止加熱，室溫下靜置冷卻，離心洗滌（16000 r/min，20 min），得到帶正電荷的PEI-AuNPs。并將得到的沉淀分散在10 mL去離子水中，保存于冰箱備用。

1.3 核酸適配體傳感器的制備

核酸適配體傳感器的制備過程如圖1所示：在修飾電極之前，將GCE（Ф=4 mm）分別用0.3、0.05 μm的Al2O3粉打磨拋光，再分別用乙醇和蒸餾水超聲洗滌，室溫下晾干備用。然后，將1 mg金剛石粉末超聲分散在1 mL Nafion（1%）乙醇溶液中，取10 μL的分散液滴加到預(yù)處理好的GCE表面，室溫下晾干形成一層Nf-金剛石膜，使電極表面帶上負電荷。隨后，將制備好的10 μL的PEI-AuNPs膠體溶液滴于電極之上。在室溫下孵育4 h以后，通過靜電吸附作用將帶正電的PEIAuNPs固載于電極表面。接下來，10 μL的H0（2.5 μmol/L）滴于上述修飾電極表面，在37℃下反應(yīng)孵育12 h，通過形成Au-S鍵將Pb2+識別的底物鏈 （H0）固載于電極表面。接下來，15 μL MCH （1 mmol/L）滴于電極表面并在室溫下反應(yīng)40 min，用于封閉非特異性吸附位點。將其置于4℃冰箱中存儲，備用。

圖1 ECL生物傳感器制備過程的原理圖和可能的ECL發(fā)光機理Fig.1 Illustration of the stepwise ECL biosensor fabrication and the possible mechanism of ECL process

1.4 測試方法

該實驗中電致化學(xué)發(fā)光采用MPI-A型分析儀測試。測試前將制備好的傳感器，滴加10 μL Pb2+識別的酶鏈（LC，2.5 μmol/L）和5 μL不同濃度的Pb2+溶液，室溫孵育2.5 h，Pb2+識別的底物鏈H0被切斷，釋放酶鏈進行下一個循環(huán)剪切，同時電極表面生成單鏈的DNA產(chǎn)物。接下來，滴加5 μL H1（2.5 μmol/L）和5 μL H2（2.5 μmol/L）（實驗前，在水浴條件下將稀釋的H0、H1、H2加熱至90℃維持5 min再自然冷卻，使得DNA鏈發(fā)卡式結(jié)構(gòu)形成），室溫孵育2 h，通過單鏈DNA產(chǎn)物誘發(fā)雜交鏈式反應(yīng)放大 （HCR）,生成長的雙鏈DNA分子。然后,10 μL Ru(phen)32+（5.0 μmol/L）孵育3 h,帶正電的Ru(phen)32+發(fā)光分子通過靜電吸附作用鑲嵌在帶負電的雙鏈DNA中。傳感器測試過程中每一步反應(yīng)后都用PBS緩沖溶液洗滌。最后，將電極置于3 mL 0.1 mol/L的PBS（pH= 7.4）溶液中檢測。光電倍增管高壓設(shè)置為800 V，電壓掃描范圍為0.2~1.25 V。所構(gòu)建的傳感器在檢測過程中，目標物Pb2+的濃度越大，修飾在電極表面的Ru(phen)32+發(fā)光分子越多，ECL信號越高?；诖耍苽涞膫鞲衅鲗崿F(xiàn)了對Pb2+的靈敏檢測。

1.5 土壤樣品預(yù)處理

土壤樣品的采集及處理采用以下方法。首先樣品采用混合采樣的方法,每個土壤采樣點（10 m×10 m）先去掉約1 cm的表層土壤，再采集4處0～20 cm厚的新鮮巖土，混合后按四分法取得1kg樣品。所有樣品置于樣品袋內(nèi)帶回實驗室登記編號，在實驗室自然風(fēng)干，去除樣品中雜草、沙石等雜物,通過2 mm尼龍篩（除去2 mm以上的砂礫），再用瑪瑙研缽研磨后，過100目尼龍篩，混勻后保存于干燥潔凈的玻璃瓶中，備用。

采用Tessier連續(xù)提取程序[10]對土壤樣品進行處理。準確稱取2.000 g土壤樣品于100 mL的聚丙烯塑料離心管中，加入對應(yīng)的提取劑，置于恒溫水浴振蕩器振蕩提取，提取條件總結(jié)于表1。

表1 Tessier連續(xù)提取程序Tab.1 Tessier sequential extraction procedures

第1～4步提取完成后，經(jīng)3000 r/min離心15 min，過濾，收集各步驟的提取液于100 mL容量瓶中，并滴加一滴濃HNO3，混勻，置于4℃冰箱中保存，備用。每次測定前用NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH在7.0～8.0之間，并定容到100 mL。每次的殘余物用10 mL去離子水洗滌3次、離心、除去上層清液，殘余土壤用于下一步提取。經(jīng)過1～4步的連續(xù)提取，土壤中殘留的重金屬已經(jīng)進入土壤晶體物質(zhì)的晶格中，一般的土壤環(huán)境改變難以將此部分重金屬從土壤中釋放出來，因此殘渣態(tài)也稱之為穩(wěn)定態(tài)，故該實驗對Pb2+的測定不包括殘渣態(tài)中的Pb2+。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米材料的表征

如圖2所示,利用SEM對Nf-金剛石和PEI-Au的形貌進行了表征。圖2（A）為Nf-金剛石的SEM圖，可以看出金剛石的形貌特征，其基本顆粒為直徑5～15 nm的微球，為不規(guī)則的聚集體；圖2（B）為PEI-Au納米復(fù)合物的SEM圖，可以看到制得的納米金的形貌是按照聚乙烯亞胺的樹枝狀形貌生長，其表面比較模糊是由于PEI分子吸附在金納米顆粒表面所致，表明了PEIAu納米復(fù)合物被成功制備。

圖2 SEM表征:（A）Nf-金剛石和（B）PEI-Au納米復(fù)合物Fig.2 SEM images of(A)Nf-diamond and(B)PEI-Au nanocomposites

2.2 傳感器制備過程的循環(huán)伏安表征

用循環(huán)伏安法（CV）對電極逐步修飾過程中電極界面的電化學(xué)行為的變化進行了表征。不同修飾電極在 0.1 mol/L KCl的[Fe(CN)6]3-/4-（5 mmol/L，pH7.4）檢測底液中進行CV掃描，如圖3所示。曲線a是裸電極的CV表征曲線，可以觀察到鐵氰化鉀良好的氧化還原峰，說明電活性探針[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面呈準氧化還原反應(yīng)。當Nf-金剛石修飾在裸電極表面時，電流明顯減弱（曲線b），氧化還原峰電流幾乎觀察不到，其原因在于電極表面形成一層帶負電的Nf-金剛石膜，由于Nf的阻抗作用，使得電子傳遞速度降低。接下來，當PEI-Au納米復(fù)合物修飾到電極表面，電流增強（曲線c），這是由于金納米顆粒可以起到電子導(dǎo)線的作用，促進了電子傳輸。然后，當在電極表面孵育H0之后，可以看到電流值減?。ㄇ€d）,這是因為DNA是生物大分子對電子傳遞有阻礙作用?；谝陨想姌O修飾過程的CV曲線的變化可以很好地證明傳感器的成功制備。

圖3 傳感器制備過程的CV表征Fig.3 CVs profiles of(a）bare GCE,(b)Nf-diamond/GCE, (c)PEI-AuNPs/Nf-diamond/GCE and(d)H0/PEI-AuNPs/ Nf-diamond/GCE in 5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-containing 0.1 mol/L KCl

2.3 傳感器的分析性能

利用所制得的傳感器按照1.4中所示的方法對目標物Pb2+進行定量檢測，圖4（A）是反應(yīng)后的傳感器在0.1 mol/L PBS（pH7.4）的檢測底液中，在0.2~1.25 V范圍內(nèi)進行ECL測定得到的ECL強度vs.時間的曲線。圖4（A）可以看出ECL強度隨Pb2+濃度的增加而逐漸增加（曲線a～f）。且由圖4（B）可知，該傳感器與Pb2+濃度的對數(shù)存在明顯的線性關(guān)系，線性方程為I=754.9 lgc+10152（I為電致化學(xué)發(fā)光強度，c為Pb2+的濃度），相關(guān)系數(shù)（r）為0.995。從上述線性關(guān)系可見該傳感器可以很好地用于Pb2+的檢測，線性范圍為 1×10-12mol/L~1×10-7mol/L，檢測限為3.33×10-13mol/L（由LOD=3SB/m估算而得，其中m表示標準曲線的斜率，SB表示多次空白測定的標準偏差）。結(jié)果表明，制備的該傳感器具有較好的靈敏度，對Pb2+檢測具有一定的潛力。

圖4 （A）不同濃度的Pb2+的ECL響應(yīng)信號和（B）不同濃度Pb2+的線性曲線Fig.4 (A)The ECL profiles of the prepared biosensor in the presence of different concentrations of Pb2+:(a～f): 1×10-12,1×10-11,1×10-10,1×10-9,1×10-8,and 1×10-7mol/L(from bottom to top)and(B)The corresponding calibration plot of the ECL intensity vs.the logarithm of Pb2+concentration

2.4 傳感器的穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是評價傳感器性能的一個重要指標。為了測試該傳感器的穩(wěn)定性能，將孵育1.0×10-10mol/L Pb2+樣品溶液的傳感器在檢測液中連續(xù)循環(huán)掃描一段時間，觀察傳感器的ECL信號變化情況。從圖5中可以看到，該傳感器在磷酸緩沖溶液中連續(xù)循環(huán)掃描15圈得到的電致化學(xué)發(fā)光信號相對穩(wěn)定，其相對標準偏差（RSD）為9.31%。這一結(jié)果說明所構(gòu)建的傳感器對Pb2+的檢測具有良好的穩(wěn)定性。

圖5 ECL信號穩(wěn)定性曲線Fig.5 ECL signal stability curve

2.5 ECL傳感器的選擇性

為評價該傳感器的選擇性，選擇Ni2+，Mg2+，Ca2+，K+，Ag+，Co2+，Cd2+作為干擾離子。分別檢測了孵育有1.0×10-5mol/L干擾離子的傳感器和1.0×10-8mol/L Pb2+的傳感器的ECL信號并進行對比（干擾離子的濃度高于Pb2+濃度1000倍）。如圖6所示，相對于空白樣品和干擾離子而言，傳感器孵育有Pb2+的溶液時，其ECL響應(yīng)明顯高于孵育其它離子的傳感器ECL響應(yīng)。同時，考慮到干擾離子濃度是目標物Pb2+濃度的100倍，該結(jié)果說明制備的傳感器對Pb2+有良好的選擇性。

圖6 Pb2+與干擾離子ECL信號對比Fig.6 The ECL signal of Pb2+comparison with the ECL signal of interferingion

2.6 傳感器用于土壤樣品的檢測

為進一步研究該傳感器的實際應(yīng)用價值，用標準加入法對傳感器回收率進行了考察。將用Tessier連續(xù)提取法獲得的金屬離子提取液稀釋50倍，然后加入不同濃度的Pb2+標準樣品，并用所制得的傳感器進行檢測，再根據(jù)標準曲線計算濃度，所得濃度與標準濃度的比值則為回收率。如表2所示，所得回收率介于92.6%~107%之間，說明傳感器對Pb2+的檢測表現(xiàn)出良好的準確度，也體現(xiàn)了該傳感器具有良好的實際應(yīng)用價值。

表2 實際土壤樣品的加標回收率實驗Tab.2 Determination of Pb2+added in soil extraction solution with the proposed biosensor

3 結(jié)論

該實驗結(jié)合目標物循環(huán)與雜交鏈式反應(yīng)（HCR）信號放大策略，構(gòu)建了用于檢測Pb2+的“signal on”型ECL生物傳感器。在目標物Pb2+存在條件下，利用目標物循環(huán)反應(yīng)生成短鏈的DNA作為引發(fā)鏈，打開發(fā)夾探針H1和H2引發(fā)HCR形成雙鏈DNA，雙鏈DNA可以固載大量的發(fā)光試劑Ru(phen)32+，實現(xiàn)信號放大的目的。PEI-Au納米復(fù)合材料不僅可以作為載體固載DNA鏈，還可以作為發(fā)光試劑釕的共反應(yīng)試劑，增強ECL響應(yīng)強度。實驗結(jié)果表明，在Pb2+濃度范圍為1×10-12mol/L~1×10-8mol/L之間，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。該ECL生物傳感器制備方法簡單，能夠?qū)b2+實現(xiàn)高靈敏度，高選擇性的檢測，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，能夠更方便更快速地檢測低濃度的Pb2+，有望在環(huán)境監(jiān)測中具有一定的應(yīng)用價值。

[1]Tiwari P M,Vig K,Dennis V A,et al.Functionalized gold nanoparticles and their biomedical applications[J]. Nanomaterials,2011,1:31-63.

[2]Zhou W,Huang P J J,Ding J,et al.Aptamer-based biosensors for biomedical diagnostics[J].Analyst,2014, 139:2627-2640.

[3]Zhou J,Rossi J J.Cell-type-specific,aptamer-functionalized agents for targeted disease therapy[J].Molecular Therapy—Nucleic Acids,2014,3:e169.

[4]Godbey W T,Wu K K,Mikos A G.Poly(ethylenimine) and its role in gene delivery[J].Journal of Controlled Release,1999,60:149-160.

[5]Yang Y,Oh J W,Kim Y R,et al.Enhanced electrogenerated chemiluminescence of a ruthenium tris (2,2′) bipyridyl/tripropylamine system on a boron-doped diamond nanograss array[J].Chemical Communications, 2010,46:5793-5795.

[6]Zhang G.Functional gold nanoparticles for sensing applications[J].Nanotechnology Reviews,2013,2:269-288.

[7]Liao N,Zhuo Y,Chai Y,et al.Amplified electrochemiluminescent immunosensing using apoferritin-templated poly (ethylenimine)nanoparticles as co-reactant[J]. Chemical Communications,2012,48:7610-7612.

[8]Yang W,Auciello O,Butler J E,et al.DNA-modified nanocrystalline diamond thin-films as stable,biologically active substrates[J].Nature materials,2002,1:253-257.

[9]Mauritz K A,Moore R B.State of understanding of Nafion [J].Chemical reviews,2004,104:4535-4586.

[10]Tessier A,Campbell P G C,Bisson M.Sequential extraction procedure for the speciation of particulate trace metals[J].Anal chem,1979,51:844-851.

A sensitive“signal-on”electrochemiluminescence sensor for Pb2+based on polyethyleneimine reduced gold nanoparticles as matrix

Deng Wei1,2，Lei Yan-mei3，Xu Chang4，Qi Le1，Gou Tao-ji1，Gao Ming1*
（1.Center for Agricultural Non-point Source Pollution Control in the Three Gorges Reservoir Area,College of Resources and Environment,Southwest University,Chongqing 400715,China)
（2.Chongqing Construction Land Affairs Center,YuZhong District,Chongqing 400015,China)
（3.Chongqing Nanomaterials and Sensing Technology Engineering Laboratory,College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)
(4.Chongqing Tobacco Monopoly Bureau,JiangBei District,Chongqing 400023,China)

In this work,combining the target cycle with the hybridization chain reaction(HCR)signal amplification, the “signal-on”electrochemiluminescence (ECL)biosensor was successfully prepared for Pb2+detection.In the presence of Pb2+,the hairpin substrate chain H0 immoblized on the electrode,which was cleaved at the RNA site owing to the the oxidative cleavage to release a DNA fragments as the primer for repetitive cycling.The DNA fragments could open hairpin structure H1,and exposes a new terminus of H1 to further react with H2 to form a long dsDNA polymer.This long dsDNA polymer can immobilize a large amount of phenanthroline ruthenium complexes (Ru(phen)32+)via electrostatic adsorption interaction.Thus,a new“signal on”ECL test method for Pb2+was developed by using PEI-Au composite nanomaterial as a new co-reactant reagent for ECL intensity enhancement. The results showed that the prepared ECL biosensor was successfully applied for the determination of Pb2+with a linear detection range of 1×10-12mol/L to 1×10-8mol/L,the detection limit was 3.33×10-13mol/L.

phenanthroline ruthenium complexes(Ru(phen)32+)；“signal on”；PEI-Au composite nanomaterial；co-reaction reagent

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD14B18）；中央高?；緲I(yè)務(wù)費專項（XDJK2015D020）

*通信聯(lián)系人,E-mail:gaoming@swu.edu.cn