高紅方，王玉鳳，漆紅蘭

（陜西省生命分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，陜西西安710062）

基于Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修飾電極的電化學(xué)發(fā)光分析法測定脯氨酸

高紅方，王玉鳳，漆紅蘭*

（陜西省生命分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，陜西西安710062）

利用滴涂法和靜電吸附作用制備了Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion修飾的玻碳電極，基于脯氨酸對Ru(bpy)32+電化學(xué)發(fā)光的信號增強(qiáng)作用，建立了測定脯氨酸的電化學(xué)發(fā)光分析新方法。實(shí)驗結(jié)果表明，在pH9.5的碳酸鹽介質(zhì)中，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與脯氨酸濃度在2.0×10－10～1.0×10－8mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為3.7×10－11mol/L(S/N=3)。

電化學(xué)發(fā)光；脯氨酸；Ru(bpy)32+；修飾電極

0 引言

脯氨酸 (proline，Pro)是一種氨基酸類藥物，研究表明人體體液中Pro含量變化與多種疾病如骨病[1]、癌癥[2－3]、慢性尿毒癥[4]等有關(guān)。建立靈敏、快速檢測脯氨酸的分析方法具有重要意義。文獻(xiàn)報道的測定Pro的方法有質(zhì)譜法[5]、液相色譜法[6]、化學(xué)發(fā)光法[7]等。這些方法有些操作復(fù)雜，有些靈敏度不高。電化學(xué)發(fā)光分析方法具有操作簡單，靈敏度高，檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)[8]。在前期工作[9]的基礎(chǔ)上，以玻碳電極作為基底電極，利用滴涂法和靜電吸附作用制備了Ru(bpy)32+/ AuNPs/Nafion/GCE修飾電極?；赑ro對Ru(bpy)32+電化學(xué)發(fā)光行為的增強(qiáng)作用，建立簡單、靈敏的檢測脯氨酸的電化學(xué)發(fā)光分析方法。

1 實(shí)驗部分

1.1 試劑和儀器

氯化三(2,2'－聯(lián)吡啶)釕(II)六水合物（Ru(bpy)3Cl2，Ru(bpy)32+）、Nafion（perfluoinated ionexchange resin）和脯氨酸 （Pro）均購自Sigma-Aldrich；氯金酸、檸檬酸鈉、鐵氰化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉和氯化鉀均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。 實(shí)驗所用溶液均用Millipore Milli Q water (＜18 M/cm)水配制。

CHI 600B電化學(xué)工作站 （上海辰華儀器公司，上海，中國）；發(fā)光測量系統(tǒng)為MPI－E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安邁瑞分析儀器有限公司,中國)，超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。三電極系統(tǒng)包括玻碳電極（Φ=2 mm）或者修飾電極為工作電極，鉑片電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極。

1.2 修飾電極的制備和電化學(xué)發(fā)光測量脯氨酸

Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修飾電極制備參考文獻(xiàn)[9]。在1 mL含不同濃度脯氨酸的0.1 mol/L碳酸鹽緩沖溶液(pH=9.5)中，利用線性單掃描伏安法，以掃描速率0.05 V/s在0~1.4 V電位范圍內(nèi)掃描，記錄電化學(xué)發(fā)光-電位曲線；或者利用階躍脈沖技術(shù)，初始電壓為0 V，最高電壓為1.10 V，脈沖時間為30 s，記錄電化學(xué)發(fā)光-時間曲線。 光電倍增管（PMT）負(fù)高壓設(shè)置為600 V。以電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為分析信號，進(jìn)行脯氨酸的檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 Pro增強(qiáng)Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修飾電極的電化學(xué)發(fā)光行為

根據(jù)文獻(xiàn)[9]，利用滴涂法和靜電吸附作用制備了Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion修飾的玻碳電極。制備的金納米粒子的透射電鏡圖如圖1所示。從電鏡可以觀察到，金納米粒子表面光滑，分布均勻，粒徑在12 nm左右。

圖1 金納米粒子的電鏡圖Fig.1 TEM image of AuNPs

圖2為Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修飾電極在含有 8.0×10-10mol/L Pro的0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液中的電化學(xué)發(fā)光-電位曲線圖。從圖2可以看出，在沒有Pro的緩沖溶液中，Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修飾電極在 1.1 V左右產(chǎn)生弱的電化學(xué)發(fā)光信號（1241）；加入8.0×10-10mol/L Pro后，在1.1 V處的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加到4263。說明 Pro在堿性介質(zhì)中能夠增強(qiáng)Ru(bpy)32+的電化學(xué)發(fā)光，可用于測定Pro。

圖2 Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修飾電極在0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH=9.5）溶液(a)和含8.0×10-10mol/L Pro的0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH=9.5)中的電化學(xué)發(fā)光-電位曲線圖(b)Fig.2 ECL intensity-potential profiles obtained at Ru (bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE electrode in 0.1 mol/L carbonate buffer(pH9.5)(a)and 0.1 mol/L carbonate buffer (pH9.5)containing 8.0×10-10mol/L Pro

2.2 條件優(yōu)化

實(shí)驗中首先考察電位和溶液pH對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3和4所示。從圖3可以看出，在1.0 V～1.1V之間增加施加電壓，電化學(xué)發(fā)光信號隨之增強(qiáng)；當(dāng)電壓大于1.1 V后，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度趨于平穩(wěn)，實(shí)驗選擇施加電位為1.1 V。

圖3 施加電壓對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響曲線Fig.3 The dependence of ECL intensity of Ru(bpy)32+/ AuNPs/Nafion/GCE on applied potential for the detection of 5×10-9mol/L Pro

圖4 pH對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響曲線Fig.4 The dependence of ECL intensity of Ru(bpy)32+/ AuNPs/Nafion/GCE on pH.I0is the ECL peak in the absence of Pro(a),ISis the ECL peak in the presence of 1×10-9mol/L Pro(b),(c)ΔI=IS-I0

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報道[10]，緩沖溶液的pH對電化學(xué)發(fā)光檢測過程有著重要影響。為獲得最佳檢測效果，該研究也對pH進(jìn)行優(yōu)化。在pH6.9~ pH10.1范圍內(nèi)，在選定的電位下，考察介質(zhì)pH對5×10-9mol/L脯氨酸-Ru(bpy)32+電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，在pH6.9~pH9.4范圍內(nèi)脯氨酸-Ru(bpy)32+的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨pH增大而增大，在pH9.4~pH10.1范圍內(nèi)脯氨酸Ru(bpy)32+的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度基本不隨pH的變化而變化。因此，實(shí)驗選擇pH=9.5的0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液為測定的緩沖條件。

2.3 工作曲線與檢出限

在優(yōu)化的實(shí)驗條件下，采用階躍脈沖技術(shù)對脯氨酸進(jìn)行測定。圖5為修飾電極在不同濃度Pro中的電化學(xué)發(fā)光-時間曲線。從圖5可以看出，隨著加入Pro濃度的增加，修飾電極的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨之增加；電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化值ΔI與脯氨酸的濃度在2.0×10-10~1.0×10-8mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（如圖5內(nèi)插圖）。線性回歸方程為ΔI=1247c+2779（c的單位為nmol/L，相關(guān)系數(shù)r=0.9939）。脯氨酸的檢出限為3.7×10-11mol/L(S/N=3)。該Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修飾電極可以通過電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對脯氨酸的靈敏檢測。

圖5 Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修飾電極在不同濃度Pro中的電化學(xué)發(fā)光-時間曲線內(nèi)插圖：脯氨酸的校準(zhǔn)曲線Fig.5 ECL intensity vs time profiles of the Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE for different concentrations of Pro.Insert, the calibration curve of Pro.Concentrations of Pro:2.0×10-10mol/L(a),5.0×10-10mol/L(b),1.0×10-9mol/L(c), 2.0×10-9mol/L(d),5.0×10-9mol/L(e),7.0×10-9mol/L(f),9.0×10-9mol/L(g)and 1.0×10-8mol/L(h)

3 結(jié)論

基于脯氨酸對Ru(bpy)32+電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的增強(qiáng)作用，利用Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修飾電極，建立了一種高靈敏檢測脯氨酸的電化學(xué)發(fā)光分析新方法。實(shí)驗結(jié)果表明，該方法測定脯氨酸具有較高的靈敏度和較低的檢出限。

[1]Smith R.Collagen and disorders of bone[J].Clin.Sci., 1980,59:215-223.

[2]Powles T J,Rosset G,Leese C L,et al.Early morning hydroxyproline excretion in patients with breast cancer[J]. Cancer,1976,38:2564-2566.

[3]Gasser A B,Depierre D,Courvoisier B,et al.Total urinary and free serum hydroxyproline in metastatic bone disease[J].Br.J.Cancer,1979,39:280-283.

[4]Inoue H,Kohashi K,Tsuruta Y,et al.Simultaneous determination of serum and urinary hydroxyproline and proline by liquid chromatography using two fluorescent labeling reagents[J].Analytica Chimica Acta,1998, 365:219-226.

[5]Goshe M B,Anderson V E.Determination of amino acid isotope ratios by electrospray ionization-mass spectrometry[J].Anal.Biochem.,1995,231(2):387-392.

[6]Harada M.High performance liquid chromatographic determination of peptidase activity toward proline-containing peptides[J].Anal.Chim.Acta,1997,352 (1-3): 179-185.

[7]Costin J W,Barnett N W,Lewis SW,et al.Determination of proline in wine using flow injection analysis with tris (2,2-bipyridyl)ruthenium(II)chemiluminescence detection[J].Talanta,2004,64:894-898.

[8]Miao W J.Electrogenerated chemiluminescence and its biorelated applications[J].Chem.Rev.,2008,108: 2506-2553.

[9]Qi H L,Li M,Dong M M,et al.Electrogenerated chemiluminescence peptide-based biosensor for the determination of prostate-specific antigen based on target induced cleavage of peptide[J].Anal.Chem.,2014,86: 1372-1379.

[10]Rubinstein I,Bard A J.Electrogenerated chemiluminescence.37.aqueous ecl systems based on Ru(2,2’-bipyridine)32+and oxalate or organic acids[J].J.Am. Chem.Soc.,1981,103:512-516.

Electrogenerated chemiluminescence determination of proline using Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion modified electrode

Gao Hong-fang,Wang Yu-feng,Qi Hong-lan*
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China)

The Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE modified electrode was fabricated and applied to detect proline by electrogenerated chemiluminescence (ECL)method.A sensitive ECL method was developed for determination of proline in the linear range of 2.0×10－10～1.0×10－8mol/L in pH9.5 carbonate buffer solution.The detection limit was 3.7×10－11mol/L.

ECL;proline;Ru(bpy)32+;modified electrode

國家自然科學(xué)基金資助（No 21375084）

*通信聯(lián)系人,E－mail:honglanqi＠snnu.edu.cn