雷 明，王加賓，叢漢卿，李志英，徐 立

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所／農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實驗室，海南儋州571737）

蜻蜓鳳梨AfWIN1基因的克隆及表達(dá)特性

雷 明，王加賓，叢漢卿，李志英，徐 立＊

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所／農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實驗室，海南儋州571737）

為利用基因工程手段調(diào)控鳳梨科植物生長發(fā)育奠定基礎(chǔ)，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)從蜻蜓鳳梨中克隆APETALA2／Ethylene Response Element Binding Protein（AP2／EREBP）家族的1個轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AfWIN1，并通過在線軟件預(yù)測其亞細(xì)胞定位，利用實時熒光定量PCR（qRT－PCR）方法分析其轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量，且利用染色體步移方法分離其啟動子序列。結(jié)果表明：AfWIN1cDNA全長995bp，含有1個501bp的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼166個氨基酸殘基；AfWIN1定位于細(xì)胞核的堿性親水蛋白；AfWIN1的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量隨著植株年齡的增長逐漸上調(diào)，但在花器官中表達(dá)量很低甚至檢測不到；AfWIN1基因5′端上游的調(diào)控序列中包含較多響應(yīng)激素的順式元件；AfWIN1在幼株和成株心葉中對乙烯響應(yīng)的方式不盡相同，可能參與蜻蜓鳳梨營養(yǎng)生長過程，但不調(diào)控花器官發(fā)育。

蜻蜓鳳梨；熱帶花卉；AfWIN1；轉(zhuǎn)錄因子；乙烯

鳳梨科植物（Bromeliaceae）原產(chǎn)于南美，包含58個屬，3 000多個種，是廣泛分布于新熱帶區(qū)的形態(tài)最為多樣的一類植物［1－2］。人工栽培種中，除食用鳳梨（菠蘿，Ananas comosus）外，還有觀賞鳳梨。觀賞鳳梨又統(tǒng)稱菠蘿花，品種繁多，株型優(yōu)美，花型奇特，花期長達(dá)2～6個月，已成為國內(nèi)外市場上十分暢銷的熱帶花卉之一［3－4］。

AP2／EREBP（APETALA2／Ethylene Responsive Element Binding Protein）轉(zhuǎn)錄因子是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［5］。AP2／EREBP轉(zhuǎn)錄因子首次報道發(fā)現(xiàn)于擬南芥，其中1個AP2基因參與了花器官和種子的發(fā)育［6］，后來在煙草中也發(fā)現(xiàn)ethylene－responsive element－binding proteins 1－4（EREBP1－4，又分別重命名為ERF1－4）均具有保守的ERF結(jié)構(gòu)域，結(jié)合共有的一類順式元件［7］。以前認(rèn)為AP2／EREBP為植物所特有，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其也存在于原生生物、藍(lán)藻和真菌中［8－9］。AP2／EREBP轉(zhuǎn)錄因子均具有至少1個由約60個氨基酸組成的AP2／ERF結(jié)構(gòu)域［10－11］。根據(jù)所含AP2／ERF結(jié)構(gòu)域數(shù)目以及其他一些結(jié)構(gòu)上的不同，AP2／EREBP轉(zhuǎn)錄因子可以分為AP2、ERF和RAV 3個亞族。其中，AP2亞族含有2個AP2結(jié)構(gòu)域，RAV亞族含有1個AP2結(jié)構(gòu)域和1個B3結(jié)構(gòu)域，而ERF亞族則只含有1個AP2結(jié)構(gòu)域［11］。AP2／EREBP轉(zhuǎn)錄因子在生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控中扮演重要角色［12］，而作為AP2／EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族中成員最多的一個亞族，ERF響應(yīng)茉莉酸（jasmonate acid，JA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）等激素以及干旱、高鹽、冷、疾病、洪澇等多種生物和非生物脅迫的調(diào)控［5，12］。

根據(jù)結(jié)合DNA序列的不同，ERF亞族又被分為ERF和CBF／DREB 2類［11］。ERF類主要結(jié)合AGCCGCC（GCC box）順式元件調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)，CBF／DREB類主要結(jié)合靶標(biāo)基因啟動子區(qū)的A／GCCGAC（DRE／CRT／LTRE）核心順式元件［11］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，一些ERF類轉(zhuǎn)錄因子也可以識別DRE／CRT元件響應(yīng)非生物脅迫［13］，另一些ERFs則可同時結(jié)合GCC box和DRE／CRT元件，調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)［14］。為了更準(zhǔn)確地預(yù)測鑒定ERF亞族成員的功能，Nakano等［15］根據(jù)結(jié)構(gòu)和進(jìn)化樹分析結(jié)果將擬南芥和水稻中所有的ERFs分別分成了12大類和15大類，一些大類中又進(jìn)一步分出了小類。目前，關(guān)于觀賞鳳梨AP2／EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子功能的研究較少。本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)，從觀賞鳳梨的蜻蜓鳳梨（Aechemia fasciata）中克隆到ERF亞族的編碼基因AfWIN1，實時熒光定量PCR（qRTPCR）鑒定AfWIN1在蜻蜓鳳梨營養(yǎng)生長過程中的基本功能，以豐富鳳梨科植物AP2／EREBP轉(zhuǎn)錄因子，為基因工程手段調(diào)控鳳梨科植物生長發(fā)育奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1．1材料

蜻蜓鳳梨幼株為試管苗移栽后株齡6個月植株，成株為試管苗移栽成活后株齡11～14個月植株，繁于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所離體保存與繁育研究室大棚（30～32℃）。

1．2乙烯利灌心

取10mL濃度為400μL／L的乙烯利灌心分別處理1h、6h、24h，以清水灌心的材料為對照。處理后的材料迅速取下置于液氮中冷凍，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3總RNA提取及cDNA第1條鏈的合成

采用改良CTAB法提取蜻蜓鳳梨總RNA［16］。cDNA第1條鏈的合成采用試劑盒（TranScript－Uni One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit，Transgene）。

1．4 5′和3′RACE擴(kuò)增

采用試劑盒（SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit，Takara）進(jìn)行目的基因的5′和3′RACE擴(kuò)增，具體步驟參照說明書。所用引物見表1。采用OMEGA（Omega）的膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增得到的特異性條帶。純化后的特異條帶連接到pEASY－blunt（Transgene）克隆載體上，測序。

1．5啟動子克隆及qRT－PCR

1．5．1啟動子克隆 在cDNA序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)ORF首尾序列設(shè)計引物從基因組中擴(kuò)增Af－WIN1基因全序列，在此基礎(chǔ)上，采用試劑盒（Genome walking kit，Takara）進(jìn)行啟動子克隆。所用引物見表1。

1．5．2qRT－PCR運(yùn)用Primer premier 5．0設(shè)計用于qRT－PCR的各基因特異引物。選用試劑盒（TransStart Tip Green qPCR SuperMix，Transgene）進(jìn)行PCR反應(yīng)，在Therma PikoReal 96TM熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific）上進(jìn)行。反應(yīng)體系（10μL）：qRT－PCR混合反應(yīng)液SuperMix 5μL，模板1μL，正反向引物各0．3μL，滅菌去離子水補(bǔ)齊至10μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性7min，然后在95℃變性5s、60℃退火30s的條件下擴(kuò)增40個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后65℃延伸30s，20℃停止。每個樣品2個生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)分析采用雙delta法，綜合分析后選取蜻蜓鳳梨的β－actin （AfACTB）為內(nèi)參。通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。所用引物見表1。

表1 啟動子克隆及qRT－PCR各步驟所用的引物Table 1 Primers used in promoter cloning and qRT－PCR

1．6生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 6．0軟件進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對，利用MEGA 6．0軟件和鄰接法進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建［17］，其他生物信息學(xué)分析軟件見表2。

表2 試驗所用的生物在線軟件Table 2 Online software used in this study

2結(jié)果與分析

2．1 AfWIN1cDNA全長的克隆與序列

經(jīng)cDNA末端快速擴(kuò)增結(jié)合PCR技術(shù)獲得1條長度為995bp的cDNA序列。該cDNA序列有1個501bp的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼166個氨基酸殘基。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，cDNA編碼的氨基酸序列具有1個典型的AP2結(jié)構(gòu)域（圖1），BLAST發(fā)現(xiàn)其與很多植物中AP2／EREBP家族ERF亞族的WIN或WIN－like蛋白具有很高的相似性，故將其命名為AfWIN1。

對AfWIN1基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，AfWIN1基因組的第1個外顯子編碼序列與擬南芥（Arabidopsis thaliana）的WIN1、大豆（Glycine max）的SHN3和SHN4相同，均為80bp（圖2）。此外，與水稻（Oryza sativaJaponica Group）、擬南芥等物種中較多WIN同源基因只含有1個內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)不同，AfWIN1的基因含有2個內(nèi)含子，類似于大豆中的SHN3和SHN4（圖2），暗示AfWIN1功能上可能有變異。

圖1 AfWIN1的同源性比對Fig．1 Comparison of AfWIN1homology

圖2 AfWIN1基因序列的結(jié)構(gòu)示意圖Fig．2 The schematic diagram of AfWIN1gene sequence

2．2 AfWIN1屬于ERF亞族的Va類

序列同源性比對結(jié)果表明，AfWIN1與水稻的WIN同源性最高，達(dá)60．98%，與小米（Setaria italica，Si）的WIN1同源性相對最低，為55．87%（圖1），表明AfWIN1在進(jìn)化上比較保守。此外，將水稻ERF全部15類中代表性的蛋白與AfWIN1構(gòu)建進(jìn)化樹，AfWIN1聚類于水稻的Va類蛋白家族（圖3）。

圖3 AfWIN1的進(jìn)化樹Fig．3 The cladogram of AfWIN1

2．3AfWIN1的組織表達(dá)特異性

由圖4可見，蜻蜓鳳梨成株和幼株各組織中AfWIN1的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量存在差異。隨著植株年齡的增長，外葉、心葉、莖和根中AfWIN1的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量均逐漸上升（圖4A）。檢測開花39d后的蜻蜓鳳梨花器官表明，除總苞外，AfWIN1在其他花器官中的相對表達(dá)量均較低，在雄蕊和雌蕊中未檢測到（圖4B）。

圖4 AfWIN1在蜻蜓鳳梨各組織中的相對表達(dá)量Fig．4 Relative expression of AfWIN1in different tissues of Aechemia fasciata

2．4外源乙烯處理后AfWIN1的響應(yīng)

由圖5可見，AfWIN1的啟動子序列上具有很多激素或脅迫響應(yīng)元件，但并未見直接響應(yīng)乙烯的元件。由圖6可見，乙烯利灌心后蜻蜓鳳梨幼株和成株心葉中AfWIN1轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量。幼株處理1h后，AfWIN1在心葉中的表達(dá)量顯著上調(diào)，而在處理6h、24h后又恢復(fù)到初始水平；成株中，AfWIN1在乙烯利處理1h、6h一直上調(diào)，但24h恢復(fù)至6h時的水平。AfWIN1在蜻蜓鳳梨幼株和成株心葉中對外源乙烯利處理響應(yīng)模式的不同暗示AfWIN1受不同因子或（和）不同機(jī)制的調(diào)控。

圖5 AfWIN1啟動子序列的順式元件示意圖Fig．5 The cis－elements schematic diagram of AfWIN1promoter sequence

圖6 AfWIN1在外源乙烯利處理后幼株和成株心葉中的相對表達(dá)量Fig．6 Relative expression of AfWIN1in central leaves of juvenile and adult plants of Aechemia fasciatatreated with ethylene

3結(jié)論與討論

目前，有關(guān)鳳梨科植物生長發(fā)育調(diào)控分子機(jī)理的研究多集中在開花方面。沉默掉乙烯合成過程中關(guān)鍵酶ACC合成酶（1－amino－cyclopropane－1－carboxylate synthase）的編碼基因ACACS2后，菠蘿開花時間顯著延遲［18］。Li等［19］通過對乙烯處理蜻蜓鳳梨的比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，AP2／EREBP家族的一些基因響應(yīng)乙烯且可能調(diào)控開花。Lei等［20］則發(fā)現(xiàn)，蜻蜓鳳梨AP2亞族的1個AfAP2－1基因在擬南芥中過表達(dá)后顯著延遲開花。此外，將菠蘿的1 個Flowering Locus T（FT）基因在擬南芥中過表達(dá)后也使得轉(zhuǎn)基因株系開花時間提前［21］。在擬南芥中過表達(dá)菠蘿的1個花器官決定同源基因PISTILLATA（PI）則使得轉(zhuǎn)基因植株開花時間提前，葉片增大，花序增多，但未見明顯的花器官變異［22］。隨著菠蘿基因組測序工作的完成，有關(guān)菠蘿乃至鳳梨科植物包括開花在內(nèi)的生長發(fā)育調(diào)控分子機(jī)理的研究將越來越深入［23－24］。

有關(guān)WIN1同源基因功能的研究在多種物種中均有報道。擬南芥的SHN1／WIN1過表達(dá)后促進(jìn)了蠟質(zhì)的合成、改變了角質(zhì)層的特性且賦予了植株更高的耐旱性［25－26］。與此類似，在苜蓿（Medicago sativa）中過表達(dá)1個WIN1的同源基因WXP1后也增加了葉片表皮的蠟質(zhì)合成，且提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性［27］。此外，在擬南芥中過表達(dá)大豆的GmSHN1和GmSHN9則同樣調(diào)控蠟質(zhì)和角質(zhì)的合成，改變角質(zhì)特性，且使得葉型產(chǎn)生變化［28］。本研究結(jié)果表明，AfWIN1在基因組結(jié)構(gòu)上類似于GmSHN3和GmSHN4，都含2個內(nèi)含子。Gm－SHN3和GmSHN4在大豆的花瓣和豆莢中有高表達(dá)［28］，但AfWIN1則在根中表達(dá)量最高，而在所有檢測花器官的總苞中表達(dá)量相對較高，表明Af－WIN1雖然在基因結(jié)構(gòu)上類似于GmSHN3和Gm－SHN4，但可能功能有異。這一點(diǎn)從AfWIN1在幼株、成株和抽薹39d成株的外葉、心葉、莖和根中表達(dá)量差異也可看出。隨著蜻蜓鳳梨株齡的增長，AfWIN1轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)量逐漸上調(diào)，暗示Af－WIN1可能參與蜻蜓鳳梨營養(yǎng)生長的調(diào)控。

根據(jù)進(jìn)化樹分析結(jié)果，AfWIN1歸屬Va類，但序列比對后發(fā)現(xiàn)，AfWIN1含有1個典型的AP2結(jié)構(gòu)域，同時也含有1個保守的中間基序（middle motif，mm），但缺少C端基序（C－terminal motif，cm）。已知C端基序是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的核心組分［29］，因此，AfWIN1雖然預(yù)測定位于細(xì)胞核，但可能并不是1個轉(zhuǎn)錄激活因子，這也可能使其進(jìn)化為有別于目前已經(jīng)報道WIN1／SHN1同源蛋白的新功能，因此，未來通過在酵母中檢測其是否具有自激活能力則顯得很有必要。

過表達(dá)WIN1同源基因在很多物種中均提高了對干旱的耐受性［25，27，30］。本研究對AfWIN1 3001bp的啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)，除大量的光響應(yīng)元件外，該啟動子區(qū)含有多個干旱響應(yīng)元件TAACTG，暗示其可能響應(yīng)干旱脅迫。此外，一些WIN1同源基因也響應(yīng)了植物激素如ABA以及冷脅迫的處理［27，29］。AfWIN1基因啟動子區(qū)的確也含有多種激素，如生長素（Auxin）、赤霉素（gibberellin acid，GA）、ABA、水楊酸（salicylic acid，SA）以及JA的響應(yīng)元件，但并未見有關(guān)響應(yīng)冷脅迫的順式元件，未來還需要更多的試驗驗證AfWIN1對各種激素和非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)理。此外，盡管AfWIN1啟動子區(qū)并不含有乙烯響應(yīng)元件，但本研究結(jié)果表明，AfWIN1對外源乙烯處理可迅速響應(yīng)，但在幼株和成株中響應(yīng)的幅度和快慢不盡相同。已知很多ERF基因參與了JA和ETH的交叉信號路徑［3134］，因此，ETH很可能通過其他交叉因子調(diào)控AfWIN1的表達(dá)。

本研究通過對AfWIN1的克隆以及相關(guān)表達(dá)特性的分析，初步驗證AfWIN1可能參與蜻蜓鳳梨營養(yǎng)生長的調(diào)控，未來可通過過表達(dá)和基因沉默技術(shù)進(jìn)一步驗證AfWIN1的基本功能，為通過基因工程手段調(diào)控鳳梨科植物生長發(fā)育奠定理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：劉忠麗）

生理生化·耕作栽培

Physiology and Biochemistry·Tillage and Cultivation

Cloning and Expression Characteristics of AfWIN1in Aechemia fasciata

LEI Ming，WANG Jiabin，CONG Hanqing，LI Zhiying，XU Li＊

（Southern China Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Innovation，Ministry of Agriculture／Institute of Tropical Crop Genetic Resources，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Danzhou，Hainan571737，China）

The AfWIN1gene was firstly cloned from a transcription factor in APETALA2／Ethylene Response Element Binding Protein（AP2／EREBP）family by rapid amplification of cDNA ends（RACE）technology based on the data of transcriptome，secondly the subcellular localization was predicted by online software，thirdly the transcript expression was analyzed by real－time fluorescence quantification PCR （qRT－PCR）and finally the promoter sequence was isolated by the chromosome walking method to lay the foundation for regulating and controlling growth and development of Aechemia fasciata by using the genetic engineering method．Results：The length of AfWIN1cDNA is 995bp containing a 501bp open reading frame（ORF）with 166amino acid residues．AfWIN1is located in the alkaline hydrophilic protein of the nucleus．The transcript expression of AfWIN1rises gradually with increase of plant age but the expression in floral organs is very low．The 5′－upstream regulatory sequence of AfWIN1gene includes more cis－elements of hormone response．AfWIN1may be involved in the vegetative growth process but can not regulate and control development of its floral organs because AfWIN1has different ethylene response pattern in central leaf of juvenile and adult plants．

Aechemia fasciata；tropical ornamenting plants；AfWIN1；transcription factor；ethylene

S682．39

A

1001－3601（2016）11－0455－0017－07

2016－07－06；2016－11－01修回

國家自然基金面上項目（31372106）；海南省自然科學(xué)基金面上項目（20163127）

雷 明（1982－），男，助理研究員，博士，從事鳳梨科植物開花分子機(jī)理和光合逆境生理研究。E－mail：leiming＠catas．cn

＊通訊作者：徐 立（1975－），男，研究員，博士，從事熱帶作物生長發(fā)育分子機(jī)理研究。E－mail：xllzy＠263．net