楊紅巖，才讓卓瑪，唐　煜，馮海霞，張　瑩，蔡傳勇，常運朝，車團結*

（1.甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，蘭州　730030；2.甘肅省生物芯片工程實驗室，蘭州　730030；3.甘肅省功能基因組與分子診斷重點實驗室，蘭州　730030）

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顯色培養(yǎng)基在飼料沙門氏菌檢測中的應用

楊紅巖1，才讓卓瑪1，唐煜1，馮海霞2，張瑩2，蔡傳勇3，常運朝2，車團結3*

（1.甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，蘭州730030；2.甘肅省生物芯片工程實驗室，蘭州730030；3.甘肅省功能基因組與分子診斷重點實驗室，蘭州730030）

摘要：研究旨在探討沙門氏菌顯色培養(yǎng)基在飼料微生物檢測中的應用。利用氯化鎂-孔雀綠增菌液和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液增菌后，利用沙門氏菌顯色培養(yǎng)基對60份飼料樣品中的沙門氏菌進行檢測。傳統(tǒng)檢測方法確定，飼料中沙門氏菌陽性份數為2（3.3%），氯化鎂-孔雀綠增菌-沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液-沙門氏菌顯色培養(yǎng)基檢測的陽性率與傳統(tǒng)方法相當。經過PCR擴增陽性樣品的fim Y基因測序鑒定，兩例陽性樣品均為沙門氏菌。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基用于飼料中沙門氏菌的檢測，具有菌落形態(tài)典型、易于分辨的特點，適用于飼料中沙門氏菌的檢測。

關鍵詞：沙門氏菌；顯色培養(yǎng)基；飼料檢測

沙門氏菌是一種常見的人畜共患食源性致病菌，在全世界范圍內廣泛流行，給人類健康和畜牧業(yè)生產帶來了巨大威脅。畜禽飼料中如果含沙門氏菌，菌量達到一定數目時，動物感染沙門氏菌可引起疾病甚至死亡，造成巨大的經濟損失，阻礙畜牧業(yè)健康發(fā)展。因此，準確、快速地檢測飼料中沙門氏菌，對于預防畜禽和人類沙門氏菌感染具有重要的意義。目前，飼料中沙門氏菌檢測方法是依靠普通細菌培養(yǎng)基培養(yǎng)法，再將疑似菌落進行生化鑒定和血清學檢測，操作繁瑣、費事費力，而且敏感性和特異性均較差[ 1 ]。本文對沙門氏菌顯色培養(yǎng)基在飼料沙門氏菌檢驗中的應用進行了初步研究。

1　試驗材料

1.1飼料樣品的采集

飼料樣品來自甘肅省內58家養(yǎng)殖場（戶）不同種類的60份配合飼料，其中雞飼料14份，豬飼料27份，羊飼料4份，牛飼料15份。

1.2試驗材料

緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基、氯化鎂-孔雀綠增菌液（RV）、亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液（SC）、酚紅煌綠瓊脂、DHL瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、三糖鐵瓊脂（TSI）、尿素瓊脂、賴氨酸脫羧試驗培養(yǎng)基、β-半乳糖苷酶試劑，以上培養(yǎng)基均由本實驗室自行配置；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基購自青島海博；快速DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

2　試驗方法

2.1沙門氏菌的分離培養(yǎng)

沙門氏菌的傳統(tǒng)檢測方法按GB/T13091-2002進行。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基的檢測方法首先按照國家標準GB4789.4-2010進行待檢樣品的制備，并用緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基預增菌，取預增菌培養(yǎng)物1 mL，接種于裝有氯化鎂-孔雀綠增菌液9 mL和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液的培養(yǎng)管中，分別置于42℃培養(yǎng)和36℃培養(yǎng)24 h；分別取上述培養(yǎng)物100 μL接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)平皿上，置于37℃培養(yǎng)24 h。

2.2沙門氏菌的鑒定

挑取沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上的陽性菌落，接種于SS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16 h，取1 mL菌液提取基因組DNA，DNA提取參照試劑盒說明書進行，進行沙門氏菌保守基因片段的測序驗證。

2.2.1沙門氏菌保守基因fimY的擴增

以沙門氏菌保守基因fimY設計引物，上游引物：5' GCCGGTAAACTACA CGATGA 3'，下游引物5' GAGTTACTGAACCAACAGC T 3'，擴增產物長度為526 bp[ 1 ]。最佳反應體系：10 X PCR buffer 2.5 μL，25 mmol·L- 1，MgCl21 μL，10 mmol·L- 1dNTP 0.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，Taq酶（2.5 U·μL-1）0.2 μL，滅菌三蒸水19.25 μL，最后加提取的模板溶液0.5 μL。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

2.2.2擴增產物的測序鑒定

擴增的PCR產物經過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收預期長度的基因片段，并與pMD18-T載體連接，操作步驟按說明書進行。連接產物轉化到JM109感受態(tài)細胞中，通過藍白斑篩選和菌落PCR鑒定為陽性的菌落，送上海生工生物工程公司測序，獲得的測序結果進行BLAST結果比對分析。

附表　飼料沙門氏菌檢測結果

3　試驗結果

3.1飼料中沙門氏菌的分離培養(yǎng)

飼料沙門氏菌檢測結果見附表。

按照國家標準，挑選的陽性菌落經過生化鑒定和血清學鑒定，60個飼料樣品中陽性樣品為2份，陽性率為3.3%。沙門氏菌分離培養(yǎng)見圖1。圖1A為氯化鎂-孔雀綠增菌培養(yǎng)基-沙門氏菌顯色培養(yǎng)基；圖1B為亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，其檢測的陽性樣品與傳統(tǒng)方法一致。

圖1　沙門氏菌分離培養(yǎng)

3.2沙門氏菌保守基因fimY的擴增

根據沙門氏菌國家檢驗標準，氯化鎂-孔雀綠增菌-沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液沙門氏菌顯色培養(yǎng)基分離到的沙門氏菌樣品進行fimY基因PCR擴增，見圖2。氯化鎂-孔雀綠增菌-沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液沙門氏菌顯色培養(yǎng)基鑒定的兩例樣品中，fimY基因均擴增成功。

圖2　fimY基因PCR擴增結果

3.3fimY基因的測序驗證

擴增到的fimY基因與pMD18-T載體經重組菌液PCR鑒定陽性的菌落測序結果分析表明，均為沙門氏菌。

4　討論

沙門氏菌傳統(tǒng)檢測方法是基于H2S和乳糖發(fā)酵試驗進行的，但該類培養(yǎng)基特異性差、假陽性率高，而且費時費力[ 2 ]。因此，建立一種省時省力的可通過顏色顯示或發(fā)出的熒光來鑒別待檢細菌的方法，顯得尤為必要。目前，已經有多種依據沙門氏菌生物學特征，如α-半乳糖苷酶活性、C8-酯酶活性等研制的顯色培養(yǎng)[ 3 ]。也有大量關于顯色培養(yǎng)基的靈敏度和特異性研究的報道[ 4-5 ]。

本試驗利用沙門氏菌顯色培養(yǎng)基對60例飼料中沙門氏菌進行檢驗，飼料樣品首先利用增菌培養(yǎng)液預增菌，分別再用氯化鎂-孔雀綠增菌液和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液選擇性增菌后，接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，生長的菌落直徑較大、菌落數量比普通培養(yǎng)基多，而且可以通過菌落的顏色進行辨識，能夠有效降低后續(xù)生化鑒定、血清學鑒定的工作量，具有簡便、快速、準確的優(yōu)點。

目前，以細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學鑒定為基礎的傳統(tǒng)微生物分析檢測技術仍然是細菌鑒定的金標準。本研究中，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基在沙門氏菌的檢出率上與傳統(tǒng)方法相當，但其能夠有效抑制其他雜菌的生長，通過菌落顏色可以判斷陽性菌落，減少了后續(xù)驗證的工作量。由于本試驗樣品種類和數量有限，還需要進行大量樣本的驗證，進一步評價沙門氏菌顯色培養(yǎng)基在飼料檢測中的推廣應用價值。隨著微生物顯色培養(yǎng)基的靈敏度和特異性的進一步提高，由于其特有的優(yōu)勢可能會逐漸被國際國內標準所采用[ 6- 7 ]。

[參考文獻]

[ 1 ]孔繁德.沙門氏菌快速檢測體系的建立與應用及其耐藥性分析研究[D].南京:南京農業(yè)大學, 2006.

[ 2 ] Hyeon J Y, Park J H, Chon J W, et al. Evaluation of selective en?richment broths and chromogenic media for Salmonella detection in highly contaminated chicken carcasses[J]. Poultry Science, 2012, 91（5）: 1 222-1 226.

[ 3 ] Pal A, Marshall D L. Comparison of culture media for enrichment and isolation of Salmonella spp. from frozen Channel catfish and Vietnamese basa fillets[J]. Food Microbiology, 2009, 26（3）: 317-319.

[ 4 ] Manafi M. New developments in chromogenic and fluorogenic cul?ture media[J]. International Journal of Food Microbiology, 2000, 60 （2-3）: 205-218.

[ 5 ] Maciorowski K G, Herrera P, Jones F T, et al. Cultural and immu?nological detection methods for Salmonella spp. in animal feeds-a review[J]. Veterinary Research Communications, 2006, 30（2）: 127-137.

[ 6 ]楊小鵑,吳清平,張菊梅,等.顯色培養(yǎng)基和傳統(tǒng)XLD培養(yǎng)基檢測沙門菌效果比較[J].衛(wèi)生研究, 2013, 42（1）: 132-133.

[ 7 ]盧勉飛,蔡芷荷,吳清平,等.顯色培養(yǎng)基快速檢測沙門菌效果的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2008, 18（12）: 2 618-2 630.

Evaluation of Chromogenic Media for SalmonellaDetection in Animal Feeding Stuffs

YANG Hongyan1, CAI RANG Zhuoma1, TANG Yu1, FENG Haixia2, ZHANG Ying2, CAI Chuanyong3, CHANG Yunchao2, CHE Tuanjie3*

（1. Control Institute of Feed and Pharmaceuticals, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Bio-array of Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 3. Key Laboratory of Function Genome and Molecular Detection of Gansu Province, Lanzhou 730000, China）

Abstract:This trial evaluated chromogenic Salmonella agar in comparison with a conventional culture method in detecting Salmonella in feed in the presence of Salmonella spp. The culture method for the detection of Salmonel?la rely on pre-enrichment in Rappaport-Vassiliadis soy broth(RVS) or Selenite cystine medium(SC). After enrich?ment, we compared chromogenic agar with a classic conventional culture method for animal feeding stuffs. Salmonel?la were isolated from 2 of the 60 samples(3.3%) with conventional culture methods and chromogenic agar. The posi?tive samples were confirmed by PCR method amplifying and sequencing the fim Y gene of Salmonella spp. The results indicated that the enrichment broths combingchromogenic Salmonella agar had agreat effect on rapid visual?ization of Salmonella spp. colonies for surveillance of Salmonella infections in animal feedingstuffs.

Key words:Salmonella; chromogenic medium; feedingdetection

作者簡介：楊紅巖（1966-），女，藏族，甘肅迭部人，高級獸醫(yī)師，主要從事動物產品質量安全及飼料安全檢測。

收稿日期：2015-12-11

中圖分類號：S852.6；S816

文獻標志碼：A

文章編號：1001-0084（2016）02-0043-03