許彬，李慧星，肖連冬，郝同飛（南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽473004）

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脂肪酶水解麥糟中脂肪的反應(yīng)動力學(xué)研究

許彬，李慧星，肖連冬，郝同飛
（南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽473004）

摘要：脫脂是制備麥糟膳食纖維的重要工序。實驗利用脂肪酶水解麥糟中脂肪，采用單因素實驗和響應(yīng)曲面法考察并優(yōu)化影響反應(yīng)速率的因素。在優(yōu)化的條件下，依據(jù)中間復(fù)合物學(xué)說，建立酶促動力學(xué)方程。結(jié)果表明：在pH 7.0，溫度40℃，加酶量0.32 g，C(Mg)2+為0.108 mol/L條件下，反應(yīng)速率達(dá)0.67 mg/mL·h，酶促動力學(xué)方程為。結(jié)果可為應(yīng)用脂肪酶水解麥糟中脂肪的生產(chǎn)強化和工程設(shè)計提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：麥糟；脂肪酶；動力學(xué)；膳食纖維

麥糟是啤酒工業(yè)的主要副產(chǎn)物，富含非淀粉多糖[1-3]。利用它來生產(chǎn)“第七大營養(yǎng)素”膳食纖維，具有良好的環(huán)境和經(jīng)濟效益。目前，酶堿法是制備麥糟膳食纖維的主要方法，采用脫脂、酶解、堿解工序脫除脂肪，淀粉和蛋白等[4-9]。前期研究中已指出利用脂肪酶脫脂具有可行性，取得了良好效果，且相比較于傳統(tǒng)的有機溶劑法脫脂具有反應(yīng)條件溫和、無污染、無有機溶劑殘留等優(yōu)勢[10]。

反應(yīng)動力學(xué)是研究催化反應(yīng)速率的科學(xué)，考察各因素對反應(yīng)速率的影響，建立可靠而適用的動力學(xué)方程，以期用數(shù)學(xué)原理和質(zhì)量作用定律來解釋反應(yīng)的進(jìn)程。反應(yīng)動力學(xué)的研究對于強化生產(chǎn)，工程設(shè)計和催化性能改進(jìn)具有重要的指導(dǎo)意義。酶催化反應(yīng)動力學(xué)的研究多采用Michealis和Menten提出的中間復(fù)合物學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為酶催化反應(yīng)包括兩步，酶（E）與底物（S）首先結(jié)合形成中間復(fù)合物（ES），然后該復(fù)合物分解成產(chǎn)物（P）。此外，在中間復(fù)合物學(xué)說基礎(chǔ)上建立的米氏方程已被廣泛應(yīng)用于描述各種酶促反應(yīng)動力學(xué)[11-13]。

試驗研究脂肪酶水解麥糟中脂肪的反應(yīng)動力學(xué)，采用單因素試驗和響應(yīng)曲面法考察影響反應(yīng)速率的因素，優(yōu)化條件。根據(jù)Michealis-Menten提出的學(xué)說，建立描述酶促動力學(xué)的米氏方程，并利用Wilkinson統(tǒng)計法[14]精確求解動力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm，以期為實現(xiàn)工程上應(yīng)用脂肪酶制備麥糟膳食纖維提供技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

麥糟（膳食纖維60.8 %，粗蛋白21.8 %，粗脂肪7.8 %，淀粉3.0 %，灰分3.0 %）：南陽天冠啤酒有限公司；脂肪酶（pH6.5～10.5，溫度15℃～40℃，酶活力10 000 u/g）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；乙醚、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸鉀、硫酸亞鐵、氯化鈣、硫酸銅等試劑均為分析純。

TDL-4013臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；AR1140/C電子天平：上海奧豪斯公司；HHS21-4電熱恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；FW-100高速萬能粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1脂肪酶水解的單因素試驗

酶促反應(yīng)體系是在250 mL三角瓶中進(jìn)行，加入麥糟5 g，添加一定量脂肪酶和金屬離子，反應(yīng)體系體積為100 mL，在一定的溫度、pH下振蕩反應(yīng)0.5 h后取出，迅速在沸水浴中加熱10 min鈍化酶，使反應(yīng)終止，離心后干燥至恒重。反應(yīng)速率定義為式1：

反應(yīng)速率/（mg/mL·h）＝

以反應(yīng)速率為指標(biāo)，通過單因素試驗考察溫度、加酶量、金屬離子、pH 4個因素的影響，每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.2響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計Box-Behnken試驗方案[15]進(jìn)一步研究溫度、加酶量和CMg2+對反應(yīng)速率的影響，考察因素的交互作用及顯著性，優(yōu)化條件。設(shè)變量X1、X2、X3分別代表溫度、加酶量和CMg2+，因素水平及編碼見表1。

表1試驗因素水平及編碼Table 1 Code and level of factors chosen for the trials

1.2.3反應(yīng)動力學(xué)研究

分別取4、6、8、10、12、14、16 g麥糟作為底物，在優(yōu)化得到的條件下，考察不同底物濃度對反應(yīng)速率的影響，依據(jù)Michealis-Menten提出的中間復(fù)合物學(xué)說，建立酶促動力學(xué)方程，并通過Wilkinson統(tǒng)計法求解酶促反應(yīng)的2個重要動力學(xué)參數(shù)，米氏常數(shù)Km（mg/mL）和最大反應(yīng)速率Vm（mg/mL·h）。

1.2.4脂肪的測定參考文獻(xiàn)[10]。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1溫度對反應(yīng)速率的影響

圖1為在加酶量0.25 g，pH6.5，溫度對反應(yīng)速率的影響。

圖1溫度對反應(yīng)速率的影響Fig.1 Effect of temperature on reaction velocity

反應(yīng)速率曲線為鐘罩形曲線，實驗現(xiàn)象與酶促反應(yīng)規(guī)律吻合，即溫度對反應(yīng)速率影響是溫度加速酶催化速率和溫度加速酶變性失活兩個方面的綜合。在25℃～40℃范圍內(nèi)，溫度未超過脂肪酶耐受的溫度，酶活性隨著溫度的升高而升高，反應(yīng)速率不斷增加。當(dāng)溫度超過40℃時，高溫使酶變性失活，隨著溫度的升高，酶的活性下降，反應(yīng)速率顯著降低。

2.1.2加酶量對反應(yīng)速率的影響

當(dāng)溫度為35℃，pH6.5時，加酶量對反應(yīng)速率的影響見圖2。

圖2加酶量對反應(yīng)速率的影響Fig.2 Effect of additional lipase amount on reaction velocity

根據(jù)中間復(fù)合物學(xué)說，酶促反應(yīng)在底物過量情況下，加酶量的增加，可以提供更多的酶活性位點催化底物生成產(chǎn)物，理論上，反應(yīng)速率應(yīng)與加酶量呈正比例關(guān)系。由圖2可以看出，反應(yīng)速率隨著加酶量的增加而提高，但當(dāng)加酶量為0.30 g時，繼續(xù)提高加酶量，酶與底物的接觸位點逐漸趨于飽和，反應(yīng)速率的增加幅度較小。

2.1.3金屬離子對反應(yīng)速率的影響

溫度35℃，pH6.5，加酶量0.25 g條件下，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+和Cu2+5種金屬離子對反應(yīng)速率的影響見圖3。

圖3金屬離子對反應(yīng)速率的影響Fig.3 Effect of metal ion on reaction velocity

金屬離子可以是酶的激活劑，也可以是酶的抑制劑，大多情況下，金屬離子是酶的激活劑，即能提高酶活性，加速酶促反應(yīng)的進(jìn)行。此外，不同金屬離子對酶的激活作用具有一定選擇性。由圖3可知，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+4種金屬離子是脂肪酶的激活劑，并且隨著金屬離子濃度的增加，反應(yīng)速率不斷提高，其中Mg2+的激活作用較明顯，而Ca2+、Fe2+和Zn2+3種金屬離子的激活作用不明顯。添加Cu2+，酶活性被抑制，且提高Cu2+濃度，反應(yīng)速率降低，可知Cu2+是脂肪酶的抑制劑。

2.1.4 pH對反應(yīng)速率的影響

在溫度35℃，加酶量0.25 g的條件下，pH對反應(yīng)速率的影響見圖4。

圖4 pH對反應(yīng)速率的影響Fig.4 Effect of pH on reaction velocity

隨著pH的變化，酶、底物可處在不同的解離狀態(tài)，會影響酶和底物的結(jié)合，從而影響酶促反應(yīng)速率。由圖4可以看出，pH和反應(yīng)速率的變化曲線為鐘罩形，在pH6.0～9.0范圍內(nèi)，反應(yīng)速率隨著pH的增加而提高，但當(dāng)pH7.0時，繼續(xù)提高pH，反應(yīng)速率提高幅度較小。當(dāng)pH10.0時，反應(yīng)速率突然下降，可能是超出了酶生理pH范圍，改變了酶活性構(gòu)象，使酶活性降低。考慮到實際應(yīng)用生產(chǎn)過程，中性pH對操作和設(shè)備的要求低，因此在試驗選擇的水平范圍內(nèi)，選擇pH 7.0。2.2響應(yīng)曲面法優(yōu)化條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法的Box-Behnken試驗方案優(yōu)化條件，試驗結(jié)果見表3，因素的方差分析見表4。

表3試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Experimental designs and results

表4因素方差分析Table 4 Analysis of mean square deviation of factors

由表4可知，F(xiàn)X1×X1、FX2×X2>F0.01（1，5）=16.25，表明溫度二次項和加酶量二次項的影響高度顯著；F0.01（1，5）=16.25> FX2、FX3、FX3×X3>F0.05（1，5）=6.61，表明加酶量、CMg2+及CMg2+二次項的影響顯著。

通過SAS8.0軟件優(yōu)化得到的條件為：X1=0、X2=0.2、X3=0.4，即溫度40℃，加酶量0.32 g，CMg2+為0.108 mol/L，該條件下，模型預(yù)測反應(yīng)速率0.68 mg/mL·h。在該條件下，重復(fù)試驗3組，結(jié)果見表5，反應(yīng)速率為0.67 mg/mL·h，變異系數(shù)1.59 %，結(jié)果穩(wěn)定，可靠。

表5重復(fù)試驗結(jié)果Table 5 Results of repeated experiment

2.3酶促反應(yīng)動力學(xué)

pH7.0，溫度40℃，加酶量0.32 g，CMg2+為0.108 mol/L條件下，底物濃度對反應(yīng)速率的影響見圖5。

圖5底物濃度對反應(yīng)速率的影響Fig.5 Effect of substance concentration on reaction velocity

隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速率不斷提高，在底物濃度較低時，反應(yīng)速率隨底物濃度增加而急劇增加。隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速率的提高幅度逐漸減小，反應(yīng)速率趨于恒定。試驗根據(jù)Michealis-Menten提出的中間復(fù)合物學(xué)說，酶（E）與底物（S）首先結(jié)合成二元中間復(fù)合物（ES），ES分解為產(chǎn)物（P）和釋放酶，其反應(yīng)方程為式2：

用米氏方程（式3）擬合圖5中試驗數(shù)據(jù)，建立酶促動力學(xué)方程[16]。

式中：CS為底物濃度，（mg/mL）；Vm為最大反應(yīng)速率，（mg/mL·h）；Km為米氏常數(shù)，（mg/mL）。

米氏方程中兩個重要動力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm的求解常用Lineweaver-Burk法[d]，但要求底物濃度在0.33 Km～2.0 Km范圍內(nèi)才比較準(zhǔn)確，否則求解的誤差較大。Wilkinson統(tǒng)計法是包括非線性求估算解和泰勒展開式求精校解，可以克服底物濃度過大或過小造成的計算誤差，其求解結(jié)果較為可靠[11]。采用Wilkinson統(tǒng)計法求解Km和Vm，計算過程如表6和表7。

表6 Wilkinson法求估算解Table 6 Calculate the provisional value by Wilkinson method

表7 Wilkinson法求精校解Table 7 Fine adjustment of value by Wilkinson method

式4中：Km0是米氏常數(shù)的估算解；式5中Vm0是最大反應(yīng)速率的估算解；式6、式7中b1和b2為計算過程中的修正常數(shù)。式8和式9為米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm的精確解。建立的酶促動力學(xué)方程如式（10）所示：

3　結(jié)論

1）脂肪酶水解麥糟中脂肪的過程中，溫度二次項和加酶量二次項對反應(yīng)速率的影響高度顯著，而加酶量、CMg2+及CMg2+二次項的影響顯著。在選擇的水平范圍內(nèi)，優(yōu)化得到的條件是：pH 7.0，溫度40℃，加酶量0.32 g，CMg2+為0.108 mol/L，該條件下反應(yīng)速率達(dá)0.67 mg/mL·h。

2）根據(jù)Michealis-Menten提出的中間復(fù)合物學(xué)說，采用Wilkinson統(tǒng)計法精確求解反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)，在優(yōu)化的條件下，建立了脂肪酶水解麥糟脂肪的酶促動

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Reaction Dynamics of Liqid Hydrolysis from Brewer's Spent Grains with Lipase

XU Bin，LI Hui-xing，XIAO Lian-dong，HAO Tong-fei
（College of Biology and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，Henan，China）

Abstract：Degrease is an important process in dietary fiber preparation from brewer's grain. Dynamics of lipid hydrolysis from brewer's grains with lipase was studied. The effects of pH，temperature，time and additional amount of enzyme were investigated by single-factor experiments and response surface methodology with Box-Behnken design. A model of lipid hydrolysis dynamics was built with Michaelis-Menten equation. The optimized conditions were pH 7.0，temperature 40℃，additional amount of enzyme 0.32 g and concentration of magnesium 0.108 mol/L. Under these conditions，maximum reaction velocity achieved 0.67 mg/mL·h. The model of lipid hydrolysis dynamics was. The results would provide references for preparation of brewer's grain dietary fiber.

Key words：brewer's grain；lipase；dynamics；dietary fiber

收稿日期：2014-06-15

作者簡介：許彬（1980—），女（漢），講師，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工貯藏。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.048