左俐俊，任亞萍

1)桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院 桂林 541004　2)桂林醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室 桂林 541004

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小鼠不同動(dòng)情周期子宮內(nèi)膜組織中Bcl-2、Bax和Caspase-9蛋白的表達(dá)*

左俐俊1)，任亞萍2)#

1)桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院 桂林 5410042)桂林醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室 桂林 541004

關(guān)鍵詞Bcl-2;Bax;Caspase-9;動(dòng)情周期;雌激素；小鼠

摘要目的：探討B(tài)cl-2、Bax 和Caspase-9在性成熟期小鼠動(dòng)情周期不同階段子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及定位。方法：選取32只性成熟期健康未孕雌性昆明小鼠，通過(guò)陰道脫落細(xì)胞檢測(cè)法，根據(jù)陰道涂片細(xì)胞種類，確定各小鼠所屬動(dòng)情周期階段，將小鼠分4組(n=8)，分別為動(dòng)情前期組、動(dòng)情期組、動(dòng)情后期組、動(dòng)情間期組。免疫組化法檢測(cè)Bcl-2、Bax和Caspase-9蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)。結(jié)果：Bcl-2在子宮內(nèi)膜上皮組織中表現(xiàn)出與動(dòng)情周期相關(guān)的規(guī)律性表達(dá)，動(dòng)情間期表達(dá)高于其他各期(P<0.05)；Bax在各動(dòng)情周期均有表達(dá)，不同動(dòng)情周期子宮內(nèi)膜組織中Bax蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.796)；Caspase-9在動(dòng)情期子宮內(nèi)膜組織中主要表達(dá)于黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)、固有層子宮腺細(xì)胞胞質(zhì)、基質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)，且動(dòng)情前期表達(dá)低于其他各期(P<0.05)。結(jié)論：Bcl-2、Bax、Caspase-9在動(dòng)情周期中共同調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞周期性的增殖與凋亡。

Expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-9 proteins in mouse endometrium tissue at different stages of estrous cycle

ZUOLijun1),RENYaping2)

1)GraduateSchool,GuilinMedicalUniversity,Guilin5410042)DepartmentofHistologyandEmbryology,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004

Key wordsBcl-2;Bax;Caspase-9;estrous cycle;estrogen;mouse

AbstractAim: To explore the expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-9 in endometrium at different stages of estrous cycle in mature mice.Methods: A total of 32 sexual maturity healthy mice were randomly allocated into 4 groups(n=8),and through the rats vaginal smear observation and types of the cells, the mouse′s estrous cycle stage was clearly determined.Then immunohistochemistry was carried out to screen the protein of Bcl-2,Bax,and Caspase-9 in mice.Results: Bcl-2 was highly appeared in diestrus stage(P<0.05).Bax was also expressed in the estrous cycle but had no significant difference among different stages(P=0.796).Besides, Caspase-9 in each estrus stage of mainly expressed in the mucosa epithelial cytoplasm, lamina propria uterus gland cell cytoplasm,and stromal cell cytoplasm,and it was lowly expressed in the beginning of the estrous cycle(P<0.05).Conclusion: Bcl-2,Bax, and Caspase-9 regulate the proliferation and apoptosis of endometrial cell cycle during estrous cycle.

雌性成年小鼠生殖器官發(fā)生增殖、退化的周期性變化稱為動(dòng)情周期，一般為4～5 d,分為動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期。目前較常用的確定小鼠動(dòng)情周期的方法有外陰直接觀察法、陰道栓觀察法和陰道涂片法等。陰道涂片法具有直接、便于操作等特點(diǎn)，故該實(shí)驗(yàn)采用此法來(lái)確定小鼠的不同動(dòng)情周期。已知育齡期哺乳動(dòng)物子宮內(nèi)膜需達(dá)到一定厚度，其自然妊娠率最高，適于胚胎植入[1]。那么小鼠在不同動(dòng)情周期子宮內(nèi)膜的規(guī)律性變化是何因素所為?是否與凋亡因子Bcl-2、Bax和Caspase-9有關(guān)?故作者設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1儀器及試劑 顯微鏡(日本奧林巴斯)，微量移液器(德國(guó)艾本德)，Bcl-2、Bax、Caspase-9一抗(武漢博士德)，DAB試劑盒(北京中杉金橋)，SABC免疫組化染色試劑盒(福州邁新)。

1.2動(dòng)物分組及處理32只8周齡SPF級(jí)雌性昆明小鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，溫度25 ℃，濕度55%～65%，光照10～12 h/d，飼料、飲用水均經(jīng)消毒處理。小鼠均未生育，為確保取材正確，于每日7:00、15:00和22:00陰道涂片觀察小鼠，直至每只小鼠完成一個(gè)完整的動(dòng)情周期，連續(xù)15 d，結(jié)果示該實(shí)驗(yàn)小鼠均有完整的動(dòng)情周期，可以進(jìn)行下一步操作。

1.3小鼠動(dòng)情周期的確定及取材用沾有生理鹽水的消毒棉簽沾取陰道黏液，將棉簽黏液涂于載玻片上，經(jīng)甲醇固定、風(fēng)干、染色、沖洗、風(fēng)干等過(guò)程，在顯微鏡下觀察陰道脫落上皮細(xì)胞形態(tài)。根據(jù)文獻(xiàn)[2]動(dòng)情周期判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。動(dòng)情間期：涂片以白細(xì)胞為主；動(dòng)情前期：涂片以有核上皮為主；動(dòng)情期：涂片以角化上皮為主；動(dòng)情后期：涂片以角化上皮和白細(xì)胞為主。根據(jù)涂片判斷小鼠動(dòng)情周期并分為4組(n=8)，將處于不同動(dòng)情周期的小鼠子宮內(nèi)膜取材備用，取出的組織置于體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛中固定，用于免疫組化檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同組間Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

Bcl-2、Bax和Caspase-9在小鼠不同動(dòng)情周期子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況見(jiàn)圖1和表1。Bcl-2和Bax在各動(dòng)情周期小鼠子宮內(nèi)膜組織中均有表達(dá)，棕黃色陽(yáng)性顆粒主要分布于子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮胞質(zhì)，且小鼠動(dòng)情間期子宮內(nèi)膜明顯增厚。Caspase-9主要表達(dá)于子宮黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)、子宮腺細(xì)胞胞質(zhì)、基質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)。

A:動(dòng)情前期：B:動(dòng)情期：C:動(dòng)情后期：D:動(dòng)情間期。圖1　小鼠子宮內(nèi)膜組織中Bax(1)、Bcl-2(2)、Caspase-9(3)蛋白的表達(dá)情況(SABC，×400)

組別nBcl-2BaxCaspase-9動(dòng)情前期組80.24±0.01*0.28±0.220.20±0.09動(dòng)情期組80.25±0.020.28±0.410.28±0.05#動(dòng)情后期組80.22±0.00*0.24±0.090.27±0.03#動(dòng)情間期組80.27±0.020.27±0.030.26±0.05#F12.7600.34114.020P<0.0010.796<0.001

*:與動(dòng)情間期組比較，P<0.05；#:與動(dòng)情前期組比較，P<0.05。

3討論

子宮內(nèi)膜對(duì)雌激素和孕激素都有反應(yīng)，雌激素可引起子宮肥大，孕激素可促使子宮內(nèi)膜發(fā)生特殊的妊娠周期變化。正常小鼠血漿雌激素在動(dòng)情前期開(kāi)始上升，動(dòng)情期達(dá)到最高，且此期子宮內(nèi)膜細(xì)胞不斷分裂增殖，使機(jī)體利于受孕[3]。Bcl-2和Bax作為一類重要的凋亡因子，協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生與凋亡，兩者既可形成同源二聚體促進(jìn)凋亡，也可形成異源二聚體抑制凋亡，且這種二聚體化過(guò)程決定了細(xì)胞對(duì)“死亡”的敏感性[4-6]。其機(jī)制是胞質(zhì)中的Bax插入到線粒體內(nèi)膜中，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，形成Bax通道，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-10]。已有研究[11]表明，bcl-2基因在正位和異位子宮內(nèi)膜均有表達(dá)，且雌激素可以促進(jìn)其表達(dá)，孕激素則抑制其表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，Bcl-2在動(dòng)情周期各期均有表達(dá)，且表達(dá)多見(jiàn)于子宮黏膜上皮細(xì)胞和固有層子宮腺細(xì)胞。此外，該研究結(jié)果顯示，Bcl-2表達(dá)在動(dòng)情期與動(dòng)情間期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明動(dòng)情期子宮內(nèi)膜的凋亡抑制活動(dòng)仍在進(jìn)行中，為子宮內(nèi)膜增厚、胚胎植入做準(zhǔn)備，若未受精，便進(jìn)入動(dòng)情后期，凋亡抑制基因表達(dá)降低，凋亡加速，子宮內(nèi)膜變薄。此外，動(dòng)情間期雌激素將達(dá)到一個(gè)較高水平，蛋白表達(dá)也最高，此期機(jī)體凋亡抑制基因也高表達(dá)，提示Bcl-2可能通過(guò)抑制基底層腺細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用。也有相關(guān)實(shí)驗(yàn)[12]顯示Bcl-2在人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈現(xiàn)規(guī)律性表達(dá)，而該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)動(dòng)情間期Bcl-2表達(dá)最高，動(dòng)情后期為促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表達(dá)明顯降低，說(shuō)明Bcl-2在子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)出的規(guī)律性表達(dá)，正是此蛋白對(duì)小鼠不同動(dòng)情周期調(diào)節(jié)的微觀表現(xiàn)。有關(guān)文獻(xiàn)[13]顯示，Bax在育齡期女性整個(gè)月經(jīng)周期中都有表達(dá)，這與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。目前對(duì)于Bax在子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況仍存在爭(zhēng)議，曾有學(xué)者[14]提出Bcl-2受雌激素調(diào)節(jié)，并與月經(jīng)周期有關(guān)，且發(fā)生著周期性變化，而B(niǎo)ax雖與子宮內(nèi)膜改變有著必然聯(lián)系，卻不受性激素調(diào)節(jié)，也無(wú)此規(guī)律性變化。該研究結(jié)果證實(shí)Bcl-2和Bax共同調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡，且Bcl-2表現(xiàn)出與動(dòng)情周期相關(guān)的規(guī)律性表達(dá)，而B(niǎo)ax雖在各期均有表達(dá)，卻沒(méi)有可靠的規(guī)律可循，推測(cè)Bax可能通過(guò)影響B(tài)cl-2的表達(dá)起作用，也可能通過(guò)其他未知途徑來(lái)影響內(nèi)膜腺體的增生與凋亡。

細(xì)胞凋亡的機(jī)制中主要有2種信號(hào)途徑，即線粒體途徑和死亡受體途徑。而在凋亡的線粒體途徑中，Caspase-9是Caspase家族中最重要的凋亡起始因子[15-16]。該研究結(jié)果顯示，Caspase-9蛋白在動(dòng)情周期各期子宮內(nèi)膜主要表達(dá)在黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)、子宮腺細(xì)胞胞質(zhì)、基質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)，說(shuō)明Caspase-9參與了動(dòng)情周期更替的全部過(guò)程。此外，Caspase-9在動(dòng)情間期的表達(dá)不是最多也不是最少，但同時(shí)結(jié)合在動(dòng)情間期子宮內(nèi)膜最薄的情況下能有較高的吸光度值，充分說(shuō)明Caspase-9蛋白在單位面積子宮黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)足夠高，這是從動(dòng)情期開(kāi)始，子宮內(nèi)膜便做好了充分的準(zhǔn)備，歷經(jīng)后期到間期，Caspase-9在這3期子宮內(nèi)膜表達(dá)最多，為順利進(jìn)入下一個(gè)動(dòng)情周期做準(zhǔn)備。

綜上所述，該研究結(jié)果說(shuō)明Bcl-2、Bax和Caspase-9在不同動(dòng)情期階段的子宮內(nèi)膜組織中有表達(dá)，子宮內(nèi)膜的周期性改變需要三者的協(xié)同配合。這也提示，在人類若這個(gè)程序被干擾，可能會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的子宮內(nèi)膜疾病，如功能失調(diào)性子宮出血病、子宮內(nèi)膜異位或癌變等。

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中圖分類號(hào)R339.2；R-332

#通信作者，女，1973年3月生，碩士，副教授，研究方向：生殖生理與疾病，E-mail：yapingrengl@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.011

*廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目2013ZD043；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目20130416-3