李江英，白雪娟，梁　艷，張俊仙，陽幼榮，趙衛(wèi)國#，吳雪瓊#

1)河北北方學(xué)院 張家口 075000　2)解放軍第309醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所；全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091

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應(yīng)用DNAStar軟件預(yù)測結(jié)核分枝桿菌Rv3812的抗原表位*

李江英1,2)，白雪娟2)，梁艷2)，張俊仙2)，陽幼榮2)，趙衛(wèi)國1,2)#，吳雪瓊1,2)#

1)河北北方學(xué)院 張家口 0750002)解放軍第309醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所；全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091

關(guān)鍵詞抗原表位；結(jié)核分枝桿菌Rv3812；二級結(jié)構(gòu)

摘要目的：預(yù)測結(jié)核分枝桿菌Rv3812蛋白的抗原表位。方法：利用DNAStar軟件包中Editseq軟件將結(jié)核分枝桿菌Rv3812氨基酸序列進(jìn)行編輯保存，然后利用Protean軟件進(jìn)行氨基酸序列分析，預(yù)測Rv3812蛋白的二級結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞抗原表位及T細(xì)胞抗原表位，然后再用BLAST分析其與人類抗原表位的同源性。結(jié)果：Rv3812蛋白具有豐富的二級結(jié)構(gòu)和多處抗原指數(shù)較高的區(qū)段，潛在的B細(xì)胞抗原表位較少，可能位于55～68、77～99、116～120、265～280、283～294、303～326、330～337和425～435位氨基酸殘基或其附近。該蛋白潛在的T細(xì)胞抗原表位較多，可能位于6～30、55～85、97～140、159～191、202～204、208～231、251～264、270～281、287～299、311～334、337～343、349～356、368～385、394～413、428～433、437～441、470～476、479～481和488～493位氨基酸殘基或其附近。結(jié)論：Rv3812是一個(gè)T細(xì)胞抗原表位占優(yōu)勢的蛋白抗原，B細(xì)胞抗原表位略少。

Prediction of epitopes of Mycobacterium tuberculosis Rv3812 protein using DNAStar software

LIJiangying1,2)，BAIXuejuan2)，LIANGYan2)，ZHANGJunxian2)，YANGYourong2)，ZHAOWeiguo1,2)，WUXueqiong1，2)

1)HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou0750002)PLAKeyLaboratoryofTuberculosisControlandPrevention;TuberculosisResearchInstituteofPLA,No. 309HospitalofChinesePLA,Beijing100091--------------------

*國家重大傳染病防治科技重大專項(xiàng)基金2012ZX10003008002；軍隊(duì)醫(yī)學(xué)科技“十二·五”重點(diǎn)項(xiàng)目BWS11J050；北京市科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展工程專項(xiàng)Z141107004414021；解放軍第309醫(yī)院重點(diǎn)課題2015ZD-004

Key wordsantigen epitope;Mycobacterium tuberculosis Rv3812 protein;secondary structure

AbstractAim: To predict the epitopes of Mycobacterium tuberculosis Rv3812 protein.Methods: Using DNAStar package Editseq software to save Mycobacterium tuberculosis Rv3812 amino acid sequence for editing, and then use Protean software to carry on the amino acid sequence analysis, predicting the secondary structure, B cell epitopes and T cell epitopes of Mycobacterium tuberculosis Rv3812. Use the BLAST to analysis its homology with human antigen epitopes. Results: The Rv3812 protein had rich secondary structure and multiple sections with higher antigenicity. There were a few potential B cell epitopes at 55-68, 77-99,116-120,265-280,283-294,303-326,330-337,425-435 amino acid residues or nearby. There were also more potential T cell epitopes at 6-30，55-85, 97-140,159-191, 202-204,208-231,251-264,270-281,287-299,311-334,337-343,349-356,368-385,394-413,428-433,437-441,470-476,479-481,488-493 amino acid residues or nearby.Conclusion: Mycobacterium tuberculosis Rv3812 protein is a T-cell-epitope dominant antigen, B cell epitopes also exists but less than T cell epitopes.

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種人畜共患傳染病，是當(dāng)今嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題，躋身全球十大疾病死亡原因之列。卡介苗(BCG)作為一種活性減弱的牛型結(jié)核分枝桿菌疫苗，是目前使用最廣泛的疫苗之一[1-2]。我國是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，同時(shí)也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病流行嚴(yán)重的國家之一，年發(fā)病人數(shù)約130萬，占全球發(fā)病人數(shù)的14.3%，位居全球第2位[3-4]。因此, 開發(fā)安全高效的新型結(jié)核疫苗具有重要的社會效益?？乖砦皇侵缚乖肿又袥Q定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，代表了抗原分子上的一個(gè)免疫活性區(qū)，負(fù)責(zé)與抗體分子或者細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)。1998年結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv全基因組測序的完成，使得生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行表位預(yù)測成為可能[5]。結(jié)核分枝桿菌Rv3812(即PE_PGRS62)基因全長1 515 bp，屬于富含甘氨酸和丙氨酸的獨(dú)特的PE蛋白家族，是膜結(jié)合蛋白，由504個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為51 789.3，等電點(diǎn)為4.180 2。有研究[6-10]發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌Rv3812是T細(xì)胞抗原占優(yōu)勢的蛋白，是潛在的候選T細(xì)胞抗原疫苗。作者運(yùn)用DNAStar軟件對Rv3812蛋白的二級結(jié)構(gòu)和B、T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析和預(yù)測，為進(jìn)一步對Rv3812中可能作為抗原表位的多肽進(jìn)行分析以及研究新型結(jié)核疫苗奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料應(yīng)用DNAStar有限公司開發(fā)的生物軟件DNAStar軟件包，在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行DNA和蛋白質(zhì)分析；利用DNAStar軟件包中Editseq軟件將結(jié)核分枝桿菌Rv3812氨基酸序列進(jìn)行編輯保存，然后用Protean軟件對蛋白的二級結(jié)構(gòu)和抗原表位進(jìn)行分析和預(yù)測[11]。從NCBI網(wǎng)站獲取Rv3812蛋白氨基酸全長序列(504個(gè)氨基酸)，GenBank序列號NP_218329.1。

1.2Rv3812氨基酸序列與人類蛋白質(zhì)的BLAST分析采用EXPASY在線軟件(NCBI BLAST2 service)對Rv3812氨基酸序列與人類蛋白質(zhì)的同源性進(jìn)行分析，具體方法:利用Internet 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入EXPASY主頁(http://web.expasy.org/blast/)，選擇蛋白數(shù)據(jù)庫[blastp-query against the UniProt Knowledgebase (Swiss-Prot+4TrEMBL)]，選擇database (Homo sapiens)，選定Run BLAST，輸入Rv3812蛋白的氨基酸序列后進(jìn)行比對。

1.3Rv3812蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測用Gamier-Robson方法[12]、Chou-Fasman方法[13]預(yù)測Rv3812蛋白的二級結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方案認(rèn)為β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為凸出結(jié)構(gòu),多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面, 利于與抗體嵌合,較可能成為抗原表位。而α螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則不易形變, 較難嵌合抗體, 一般不作為抗原表位[14]。

1.4Rv3812蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測用Kyte-Doolittle方法[15]和Hopp-Woods方法[16]預(yù)測蛋白質(zhì)的疏水區(qū)和親水區(qū)，親水性指數(shù)比較高的區(qū)域暴露于表面的幾率較大，作為抗原表位的可能性也最大[17]。用Emini方法[18]預(yù)測特定區(qū)域位于蛋白質(zhì)的表面可能性，即蛋白質(zhì)抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性，它反映了蛋白質(zhì)抗原內(nèi)、外各層殘基的分布情況。用Karplus-Schulz方法[19]預(yù)測蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性，柔韌性好的肽段，發(fā)生扭曲、折疊的幾率較高，能形成豐富的二級結(jié)構(gòu)。用Jameson-wolf方法[20]預(yù)測潛在的蛋白質(zhì)抗原決定簇，抗原性好的肽段提示含有潛在抗原表位的可能性大。最后根據(jù)Rv3812蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果及蛋白質(zhì)親水性、表面可能性、抗原性及柔韌性，綜合預(yù)測潛在優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位。

1.5Rv3812蛋白T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測用AMPHI方法[21]預(yù)測免疫優(yōu)勢輔助性T 淋巴細(xì)胞抗原位點(diǎn)；用Rothbard-Taylor方法[22]預(yù)測含有特定基序(motif)的潛在T細(xì)胞抗原決定簇，最后綜合預(yù)測潛在優(yōu)勢T細(xì)胞抗原表位。

2結(jié)果

2.1BLAST分析結(jié)果通過分析，發(fā)現(xiàn)Rv3812蛋白的氨基酸序列與人類黏蛋白/黏液素(MUC5AC)只有10.3%(52/504個(gè)氨基酸)的同源性，同源性主要位于第248～466位氨基酸殘基，這段同源性達(dá)到22%。

2.2Rv3812蛋白二級結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞抗原表位及T細(xì)胞抗原表位預(yù)測見圖1。預(yù)測Rv3812蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)形成在7～33、37～48、67～79、82～91、100～117、146～198、232～243、248～257、303～308、370～391、396～412和493～504位氨基酸殘基，共212個(gè)氨基酸，占整個(gè)氨基酸序列的42%；β折疊在1～8、46～55、61～65、96～102、120～129、131～136、199～217、220～226、259～300、325～333、337～369、413～425、432～443、446～450、453～460、465～484和486～494位氨基酸殘基，共222個(gè)氨基酸，占整個(gè)氨基酸序列的44%。在各β折疊單元之間存在β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，其中β轉(zhuǎn)角在34～37、56～59、65～69、81～84、92～95、116～119、137～139、142～145、218～221、228～231、244～247、267～270、290～293、314～317、320～323、334～337、390～393、408～411、424～431、433～436、443～446、450～453和460～463位氨基酸殘基，共96個(gè)氨基酸，占整個(gè)氨基酸序列的19%；在34～36、59～60、140～145、227～230、312～315、332～336和428～431位氨基酸殘基存在無規(guī)則卷曲，共28個(gè)氨基酸，占整個(gè)氨基酸序列的5%。

2.3Rv3812蛋白的親水性分析Rv3812蛋白存在的低親水性區(qū)域主要位于25～27、77～83、103～107、129～135、137～141、144～146、151～153、303～312、382～384和429～431位氨基酸殘基，高親水性區(qū)域主要位于55～65、85～99、155～159和318～324位氨基酸殘基，總共有94個(gè)氨基酸，占整個(gè)氨基酸序列的19%，其中高親水性的氨基酸占整個(gè)氨基酸序列的8%。Rv3812蛋白存在較多的疏水性區(qū)域，并且疏水性程度較高，高疏水性區(qū)域主要位于1～24、31～54、108～118、160～196、199～229、233～236、238～243、246～248、250～255、258～267、272～282、339～381、291～302、390～405、418～428和434～504位氨基酸殘基；低疏水性區(qū)域主要位于100～102、121～126、147～150、313～317、328～333、385～388和407～416位氨基酸殘基，總共有394個(gè)氨基酸，占整個(gè)氨基酸序列的78%，其中高疏水性的氨基酸占整個(gè)氨基酸序列的70%。

圖1　結(jié)核分枝桿菌Rv3812蛋白二級結(jié)構(gòu)和抗原表位預(yù)測

2.4Rv3812蛋白的表面可能性分析Rv3812的表面可能性較大的區(qū)域主要位于24～26、57～62、88～92、128～131、154～157、283～285、304～309、320～324、332～333、335～336、383～384和431～432位氨基酸殘基，其他部位展示的可能性較小或表現(xiàn)為負(fù)值，共44個(gè)氨基酸，約占整個(gè)氨基酸序列的8%。

2.5Rv3812蛋白柔韌性分析Rv3812蛋白含有的柔韌性區(qū)域主要位于22～27、34～38、57～68、79～82、90～98、102～107、117～120、128～133、204～207、216～222、265～280、284～294、319～326、330～336、347～353、380～385、418～421、425～435、461～463和468～473位氨基酸殘基，共142個(gè)氨基酸，約占整個(gè)氨基酸序列的28%。

2.6Rv3812蛋白抗原性分析Rv3812蛋白含有的抗原性區(qū)域主要位于25～32、 44～50、 56～66、79～87、 89～98、103～110 、118～121、267～274、284～295、315～327、333～339、381～387和426～436位氨基酸殘基，共118個(gè)氨基酸，約占整個(gè)氨基酸序列的23%。

2.7Rv3812蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測分析通過以上預(yù)測的Rv3812蛋白的二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)角區(qū)、無規(guī)則卷曲區(qū)、蛋白質(zhì)親水性、表面可能性、柔韌性及抗原性，得到B細(xì)胞潛在優(yōu)勢抗原表位主要位于55～68、77～99、116～120、265～280、283～294、303～326、330～337和425～435位氨基酸殘基或其附近，共113個(gè)氨基酸，約占整個(gè)氨基酸序列的22%。

2.8Rv3812蛋白T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測分析用AMPHI方法和Rothbard-Taylor方法預(yù)測的T細(xì)胞潛在優(yōu)勢抗原表位主要位于6～30、55～85、97～140、159～191、202～204、208～231、251～264、270～281、287～299、311～334、337～343、349～356、368～385、394～413、428～433、437～441、470～476、479～481和488～493位氨基酸殘基或其附近,共303個(gè)氨基酸，約占整個(gè)氨基酸序列的60%。

3討論

綜合運(yùn)用生物信息學(xué)的技術(shù)方法對蛋白質(zhì)的相關(guān)信息進(jìn)行分析、處理、模擬和預(yù)測，最終預(yù)測抗原表位的模式，已為越來越多的研究者所采用[23-24]。因?yàn)檫@樣的研究方式可以減少實(shí)驗(yàn)的盲目性，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的目的性，大大提高實(shí)驗(yàn)的成功率[14]。而開發(fā)結(jié)核感染相關(guān)抗原表位，為深入研究結(jié)核感染機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的結(jié)核感染診斷標(biāo)志物及獲取有效的表位疫苗奠定了基礎(chǔ)[25]。

該研究通過BLAST分析，發(fā)現(xiàn)Rv3812蛋白的氨基酸序列與人類蛋白質(zhì)的同源性很低，不會誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫性疾病。與黏蛋白/黏液素(MUC5AC)同源性雖然很低，但在第248～466位氨基酸殘基上有22%的同源性，因此，在抗原表位設(shè)計(jì)、合成時(shí)需注意這些同源性區(qū)域，以獲得交叉反應(yīng)性低的、特異性的抗原表位。

該研究運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對Rv3812蛋白的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測，從該蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水性、表面可能性、柔韌性及抗原指數(shù)等方面進(jìn)行分析，Rv3812蛋白α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)數(shù)量較多，分別占整個(gè)氨基酸序列的42%和44%；在各β折疊單元之間存在β轉(zhuǎn)角較多，占整個(gè)氨基酸序列的19%；但無規(guī)則卷曲相對較少，占整個(gè)氨基酸序列的5%，預(yù)示該蛋白可能含有相對較少的B細(xì)胞抗原表位；該蛋白親水性多肽也較少，占整個(gè)氨基酸序列的19%，而高親水性氨基酸只占8%；疏水性多肽較多，占整個(gè)氨基酸序列的78%，其中高疏水性氨基酸占比高達(dá)70%，設(shè)計(jì)表位時(shí)應(yīng)注意這些區(qū)域。該蛋白含有的表面可能性區(qū)域很少，只占整個(gè)氨基酸序列的8%，說明形成表位的可能性較??；該蛋白含有的柔韌性區(qū)域較少，占整個(gè)氨基酸序列的28%，說明形成表位的可能性較小，不容易與抗體進(jìn)行結(jié)合；該蛋白含有的抗原性區(qū)域也較少，占整個(gè)氨基酸序列的23%，提示可能成為表面抗原的多肽較少。綜合分析得到潛在B細(xì)胞表位相對較少，占整個(gè)氨基酸序列的22%。由于考慮的方面較多，DNAStar軟件預(yù)測的B細(xì)胞表位相對準(zhǔn)確性較高。但DNAStar軟件是在氨基酸一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上應(yīng)用多個(gè)參數(shù)預(yù)測B細(xì)胞抗原表位，忽略了各氨基酸之間的分子作用力，因此，對構(gòu)象依賴的B細(xì)胞表位的預(yù)測有一定局限性。為進(jìn)一步確認(rèn)新發(fā)現(xiàn)的B細(xì)胞線性表位，該研究通過人工方法合成Rv3812相應(yīng)的B細(xì)胞線性表位多肽并進(jìn)行免疫學(xué)驗(yàn)證，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)[26]，由于多肽抗原相對分子質(zhì)量太小而不能產(chǎn)生顯著的免疫反應(yīng)，為此，常將多肽抗原偶聯(lián)到牛血清白蛋白(BSA)、血藍(lán)蛋白(-KLH)等較大的蛋白載體上，以期獲得更高的免疫原性[27]。

該研究用DNAStar軟件的AMPHI方法和Rothbard-Taylor方法預(yù)測結(jié)核分枝桿菌Rv3812蛋白T細(xì)胞潛在的優(yōu)勢抗原表位較多，占整個(gè)氨基酸序列的60%，是一個(gè)T細(xì)胞占優(yōu)勢的蛋白。Chaitra等[10，28]預(yù)測并進(jìn)行鑒定的抗原表位有61～69、260～268和490～498位氨基酸殘基， 61～69位氨基酸殘基在該作者預(yù)測的55～85位氨基酸殘基范圍內(nèi)，260～268位氨基酸殘基中的260～264在作者預(yù)測的251～264位氨基酸殘基上，265～268在作者預(yù)測的251～264位氨基酸殘基的附近位置上，490～498位氨基酸殘基中的490～493在作者預(yù)測的488～493位氨基酸殘基上，484～498在作者預(yù)測的488～493位氨基酸殘基的附近位置上。作者與Chaitra等預(yù)測的表位有些微差異，產(chǎn)生差異的原因可能是DNAStar軟件預(yù)測T細(xì)胞表位考慮的因素較少，預(yù)測的準(zhǔn)確性不一定高，導(dǎo)致有的優(yōu)勢表位未能預(yù)測到，也可能是由于機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答機(jī)制的復(fù)雜性，表位預(yù)測還不能完全反應(yīng)體內(nèi)的實(shí)際情況。因此，作者將聯(lián)合應(yīng)用SYFPEITHI 軟件(http://www.syfpeithi.de)、BIMAS 軟件(http://www-bimas.cit.nih.gov)和NetCTL軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)進(jìn)一步預(yù)測T細(xì)胞表位，以提高預(yù)測的準(zhǔn)確度和特異性，然后再合成多肽表位做進(jìn)一步的體外驗(yàn)證試驗(yàn)。例如T細(xì)胞表位可通過T 細(xì)胞增殖性試驗(yàn)、細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)、ELISPOT技術(shù)等鑒定。

總之，該研究結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌Rv3812蛋白是一個(gè)T細(xì)胞抗原表位占優(yōu)勢的蛋白抗原，所含的潛在B細(xì)胞抗原表位較少，預(yù)測結(jié)果將為該蛋白的免疫學(xué)特性研究及其應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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中圖分類號R378.91+1

#通信作者，吳雪瓊,女，1963 年7月生，博士，研究員，研究方向：新型疫苗、診斷技術(shù)和新藥的研究；E-mail: wu-xueqiong@263.net；趙衛(wèi)國,男，1966年1月生，博士，教授，研究方向：結(jié)核分枝桿菌的快速診斷,E-mail:zhaowg309@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.007