孟　華，陳　巖

鄭州大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450003

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硫酸吲哚酚對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響*

孟華，陳巖#

鄭州大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450003

關(guān)鍵詞內(nèi)皮祖細(xì)胞；硫酸吲哚酚；細(xì)胞增殖；活性氧簇

摘要目的：觀察腎毒性物質(zhì)硫酸吲哚酚對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)增殖的影響。方法：體外培養(yǎng)EPC，分別用0(對(duì)照)、25、50、100和200 mg/L硫酸吲哚酚刺激24、72、120 h后，MTT法測定細(xì)胞活性；分別用0(對(duì)照)、200 mg/L硫酸吲哚酚刺激24 h后，BrdU法測定細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞術(shù)測定活性氧(ROS)。結(jié)果：硫酸吲哚酚體外可呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制EPC細(xì)胞活性。200 mg/L硫酸吲哚酚作用24 h, EPC增殖受抑(P<0.05)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS大量累積(P<0.05)。結(jié)論：硫酸吲哚酚可通過增加EPC細(xì)胞內(nèi)ROS累積，抑制EPC增殖。

Effect of indoxyl sulfate on proliferation of endothelial progenitor cells

MENGHua，CHENYan

DepartmentofCardiology,People'sHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450003

Key wordsendothelial progenitor cell；indoxyl sulfate；cell proliferation；reactive oxygen species

AbstractAim: To investigate the effects of uremic solute indoxyl sulfate(IS) on the proliferation of endothelial progenitor cells(EPC).Methods: EPC were isolated from healthy donors, then cultured by 0(the control),25,50,100 and 200 mg/L IS for 24,72,and 120 h, and the viability was measured by MTT method. EPC were cultured by 0(the control) and 200 mg/L IS for 24 h, then the proliferation was detected by BrdU assay, and the reactive oxygen species(ROS) accumulation was examined by flow cytometry.Results: The viability of EPC was dose- and time-dependently inhibited by IS(P<0.05). The proliferation of EPC cultured by 200 mg/L IS for 24 h was inhibited with more ROS accumulation(P<0.05).Conclusion: IS could inhibit the proliferation of EPC via ROS.

心血管疾病是尿毒癥患者的首要致死因素[1]，尿毒癥溶質(zhì)、不對(duì)稱精氨酸、活性氧簇(creactive oxygen species,ROS)等循環(huán)病理物質(zhì)都可能在心血管病致病過程中起到重要作用[2]。很多尿毒癥患者體內(nèi)存在惡化的血管內(nèi)皮功能性障礙[3]，然而，有關(guān)尿毒癥溶質(zhì)的病理學(xué)影響和致內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制仍不清楚。腎毒性物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷的機(jī)制主要包括炎癥反應(yīng)加劇、細(xì)胞凋亡和纖維化等。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPC)是血管內(nèi)皮細(xì)胞前體干細(xì)胞，在促進(jìn)血管新生，促進(jìn)受損血管恢復(fù)和缺血組織再血管化方面發(fā)揮了重要作用[4]。相關(guān)研究[5]結(jié)果顯示，循環(huán)EPC數(shù)量和功能隨著慢性腎功能不全的進(jìn)展而下降，其可能受到腎毒性物質(zhì)的影響。因此，作者對(duì)腎毒性物質(zhì)硫酸吲哚酚對(duì)EPC增殖活性的影響及可能的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。

1材料與方法

1.1EPC的分離、培養(yǎng)和鑒定收集門診健康自愿捐獻(xiàn)者外周血20 mL，符合醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)要求，均簽署知情同意書。密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，按1×106mL-1接種于預(yù)包被人纖維粘連蛋白的6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)液為M199培養(yǎng)液[含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，EGM SingleQuot(Clonetics, Walkersville, USA)，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L]。培養(yǎng)48 h后，更換培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞。每2 d更換培養(yǎng)液。7～20 d后可見鋪路石樣細(xì)胞集落出現(xiàn)，采用細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行鑒定：細(xì)胞培養(yǎng)至90%密度時(shí)，加入2.4 mg/L Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-ac-LDL，Invitrogen公司)，37 ℃孵育1 h；多聚甲醛固定30 min, PBS漂洗3次； 加入10 mg/L FITC標(biāo)記的荊豆凝集-1(FITC-UEA-1,Sigma公司)，37 ℃孵育1 h, PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.2硫酸吲哚酚對(duì)EPC活性影響的觀察收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按照1×104mL-1接種于96孔板。參考慢性腎病患者血漿硫酸吲哚酚水平[6]， 分別用0(對(duì)照)、25、50、100和200 mg/L硫酸吲哚酚刺激24、72、120 h后，MTT法測細(xì)胞活性，酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm波長處的吸光度(A)，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞活性=(實(shí)驗(yàn)組A-本底A)/(對(duì)照A-本底A)×100%。

1.3硫酸吲哚酚對(duì)EPC增殖能力影響的觀察收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按1×104mL-1接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁6 h， 用200 mg/L硫酸吲哚酚刺激24 h后去除上清；每孔加200 μL固定液室溫孵育30 min，去上清；加入100 μL BrdU抗體(Invitrogen)室溫孵育1 h，漂洗3次；加入100 μL二抗室溫孵育30 min，漂洗3次；加入底物100 μL，室溫孵育15 min；加入100 μL終止反應(yīng)液孵育15 min；在酶聯(lián)免疫檢測儀450～540 nm波長處測量A，以測定值表示細(xì)胞增殖率。

1.4硫酸吲哚酚對(duì)ROS影響的觀察細(xì)胞培養(yǎng)至第3代，按1×105mL-1接種于6孔板中，加入200 mg/L硫酸吲哚酚刺激24 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，使用溫浴(37 ℃)的HBSS輕輕沖洗細(xì)胞2遍，加入25 μmol/L的carboxy-H2DCFDA(Invitrogen)37 ℃避光孵育60 min，孵育結(jié)束前10 min加入Hoechst33342(1.0 μmol/L)，用溫浴(37 ℃)的HBSS沖洗細(xì)胞2遍，熒光顯微鏡下觀察，消化細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，以此定量ROS的表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0進(jìn)行分析，EPC活性的比較采用4×3析因設(shè)計(jì)的方差分析，細(xì)胞增殖率和ROS含量的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1EPC的分離及鑒定單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)15～20 d后，可見鋪路石狀細(xì)胞集落形成并具有內(nèi)皮細(xì)胞特征。熒光顯微鏡下可見,Dil-ac-LDL陽性(紅色熒光)及FITC-UEA-1陽性(綠色熒光)細(xì)胞，即為EPC(圖1)。

A:FITGUEA-1;B:Dil-ac-LDL;C:雙染。圖1　EPC熒光染色鑒定

2.2硫酸吲哚酚對(duì)EPC細(xì)胞活性的影響見表1。不同質(zhì)量濃度硫酸吲哚酚刺激EPC相同時(shí)間后，細(xì)胞活性逐漸下降(P<0.05)；相同質(zhì)量濃度硫酸吲哚酚刺激EPC 24、72、120 h后，細(xì)胞活性亦逐漸降低(P<0.05)。

2.3硫酸吲哚酚對(duì)EPC增殖和ROS含量的影響

見圖2、表2。200 mg/L硫酸吲哚酚刺激EPC 24 h后，細(xì)胞增殖率降低，ROS大量累積。

表1　各組EPC活性測定結(jié)果　%

F時(shí)間=11.341,F濃度=8.624,P均<0.001；F交互=0.766，P=0.404。

圖2　熒光顯微鏡下0(上排)和200(下排) mg/L硫酸吲哚酚組EPC中ROS的累積情況

組別n增殖率ROS含量0mg/L硫酸吲哚酚組33.35±0.1088±3200mg/L硫酸吲哚酚組31.83±0.04108±8t26.7314.054P<0.0010.015

3討論

心血管疾病是慢性腎功能不全患者的首要死因[7-8]。慢性腎病患者血管內(nèi)皮功能紊亂，修復(fù)能力降低，與其循環(huán)EPC數(shù)量減少、功能減弱有著密切的關(guān)系[9]，并且循環(huán)EPC數(shù)量隨著腎毒性物質(zhì)的蓄積而減少[10-11]。慢性腎病的許多毒性物質(zhì)可能參與抑制EPC，對(duì)血管內(nèi)皮功能造成損害，但是仍缺乏直接證據(jù)。硫酸吲哚酚是腸菌類異化色氨酸的代謝產(chǎn)物，其血清水平在慢性腎功能衰竭患者體內(nèi)顯著增加，并且經(jīng)血液透析去除量較少。已有研究[12]表明硫酸吲哚酚能夠抑制內(nèi)皮增殖和體外傷口的恢復(fù)。硫酸吲哚酚可使人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)發(fā)生氧化應(yīng)激， 產(chǎn)生大量氧自由基產(chǎn)物，導(dǎo)致HK-2細(xì)胞損傷，加速細(xì)胞凋亡，加速腎功能減退[13]。腎小球系膜細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)與有絲分裂原激活蛋白酶及細(xì)胞增生有關(guān)。硫酸吲哚酚的腎毒性還表現(xiàn)在破壞腎臟的抗氧化能力，它可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和降低超氧化物歧化酶(SOD)的表達(dá),致使超氧化物清除能力降低，加速腎小球系膜細(xì)胞凋亡, 從而損傷腎小球[14]。該研究結(jié)果顯示硫酸吲哚酚體外可劑量和時(shí)間依賴性抑制EPC活性和增殖能力，增加EPC中ROS的累積，而ROS累積可能是硫酸吲哚酚影響EPC細(xì)胞活性的重要因素。

硫酸吲哚酚是透析后未能有效去除的蛋白結(jié)合尿毒癥溶劑，血液透析治療僅可去除30%，因此需要采用其他方案來去除這些尿毒癥溶劑。研究[15]顯示，口服吸附劑AST-120能夠降低患者體內(nèi)硫酸吲哚水平。其他如縮減蛋白質(zhì)消耗等方法也可以降低硫酸吲哚的血清水平。然而這些方案對(duì)尿毒癥患者的影響仍舊未知。該研究結(jié)果顯示，ROS累積可能是硫酸吲哚酚影響EPC細(xì)胞活性的重要因素，這必將為慢性腎功能不全并心血管疾病的治療提供新的思路。

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中圖分類號(hào)R543.2

#通信作者，男，1964年9月生，本科，主任醫(yī)師，研究方向：冠心病的診斷及治療，E-mail：hnsrmyycy@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.029

*河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目142300410264