馮忠軍，馮彥蕊，聞海豐，孫　寅(.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 05005；.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，山東 濟寧 709)

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·論著·

類風濕性關節(jié)炎患者血漿和關節(jié)滑液中miR-16的表達

馮忠軍1，馮彥蕊1，聞海豐1，孫寅2(1.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050051；2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，山東 濟寧 272029)

[摘要]目的通過檢測miR-16在類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者血漿和關節(jié)滑液中的表達，探討其在RA鑒別診斷以及病情評估中的應用價值。方法應用莖環(huán)逆轉錄引物的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR法檢測RA患者血漿、關節(jié)滑液以及單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中miR-16的表達水平，以U6snRNA為內參，另有10例骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)作病例對照。結果目的基因miR-16和內參U6snRNA的擴增曲線及熔解曲線均良好，未出現非特異性產物及引物二聚體現象。miR-16在血漿中表達水平顯著高于關節(jié)滑液和外周血PBMC(P<0.01)；miR-16在RA患者PBMC中的表達水平顯著高于正常對照組(P<0.01)。與OA患者相比，miR-16在RA患者關節(jié)滑液中的表達水平顯著升高(P<0.01)。血漿中miR-16表達與疾病活動度量表(Disease Activity Score,DAS28)評分呈負相關(P<0.05)，與紅細胞沉降率( erythrocyte sedimentation rate，ESR)及C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)均無相關性(P>0.05)；PBMC中miR-16表達與DAS28評分、ESR及CRP均呈正相關(P<0.05)；關節(jié)滑液中miR-16表達與DAS28評分、ESR及CRP均無相關性(P>0.05)。結論莖環(huán)逆轉錄引物的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR法是靈敏而且特異的miRNA檢測方法。血漿和關節(jié)滑液miR-16的來源并不相同，在血漿和關節(jié)滑液中可能存在不同的miRNA表達譜。miR-16的表達水平可望用于RA與OA的鑒別診斷以及作為RA病情活動度的有效評價指標。

[關鍵詞]關節(jié)炎，類風濕；滑液；微RNAs

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.013

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現的自身免疫病，致殘率較高，而臨床常用的影像學、組織學、血清學等診斷方法存在很大的缺陷。微小RNA(microRNA,miRNA)作為重要的免疫調控分子，通過調控mRNA的翻譯，引起蛋白質的表達改變，從而影響生物效應。盡管其功能尚未完全闡明，但研究發(fā)現，miRNA具有很強的細胞、組織或疾病特異性，顯示了其作為疾病診斷標志物的某些特征[1-3]。本研究采用莖環(huán)逆轉錄引物的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量聚合酶鏈反應(stem-loop real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，stem-loop FQ-PCR)法檢測RA患者血漿及關節(jié)滑液中miR-16的表達水平，并結合疾病活動度量表(Disease Activity Score，DAS28)評分及某些實驗室指標進行分析,旨在探討其在RA早期篩選、鑒別診斷以及病情評估中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2012年4月—2013年1月在河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院免疫風濕科確診的RA患者30例,均符合美國風濕病學會1987年修訂的RA分類標準。男性8例，女性22例，年齡38～69歲，平均(50.28±7.09)歲，其中16例留取關節(jié)滑液,同時記錄DAS28評分、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)及C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)等臨床相關資料。骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)患者10例，來自同期關節(jié)骨科門診并排除其他自身免疫性疾病，男性3例，女性7例，年齡35～67歲，平均(50.90±6.17)歲。正常對照組20例，均排除自身免疫、肝臟、心腦血管疾病,男5例，女15例，年齡32～60歲，平均(48.01±4.11)歲。3組受試者性別和年齡差異均無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

所有研究對象均對相關研究知情同意。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑ND-2000型超微量核酸蛋白測定儀(美國Nanodrop公司)，ABI7300型實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)，miRNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)，Hsa-mir-16熒光定量PCR引物試劑盒及EzOmics實時定量PCR試劑盒(南通百奧邁科生物技術有限公司)。

1.2.2標本采集與總RNA提取采集受試者乙二胺四乙酸二鉀(ethylene diamine tetraacetic acid-K2,EDTA-K2)抗凝靜脈血3 mL，分別提取血漿和外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中總RNA。無菌抽取的關節(jié)滑液經離心后取上清液于12 h內提取總RNA。提取方法按照操作說明書進行。純化的總RNA經純度和濃度檢測(OD260/OD280在1.6～2.0范圍)及完整性鑒定(1.2%瓊脂糖凝膠電泳出現28 s、18 s和5 s等3條帶，并且28 s條帶亮度約是18 s條帶的1.5～2.0倍)后用于PCR擴增反應。所有樣本均于-70 ℃保存待用。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測miR-16用RNase free水調整上述RNA樣本濃度后，根據標本數量，分別為目的基因miR-16和內參基因U6snRNA配制反應液并分裝(每個樣本反應體積均為20 μL)，全程冰上操作。①miR-16反應體系如下：2×Master Mix 12.5 μL；50×SYBR Green Ⅰ 0.5 μL；RT primer 0.5 μL；Forward Primer(5μmol) 0.5 μL；Reverse Primer(5 μmol)0.5 μL；DEPC-H2O 5.5 μL。②U6snRNA反應體系如下：2×Master Mix 12.5 μL；50×SYBR Green Ⅰ 0.5 μL；U6snRNA Forward Primer(5μmol)0.5 μL；U6snRNA Reverse Primer(5μmol)0.5 μL；DEPC-H2O 6 μL。向每個反應管中分別加入RNA模板5 μL，樣本最終反應體系為25 μL。同時，使用不含模板的陰性對照(no template control,NTC)來判斷反應過程中是否出現引物二聚體污染。按照以下反應參數進行PCR擴增，反轉錄：42 ℃ 60 min，1個循環(huán)；預變性：95 ℃熱啟動10 min，1個循環(huán)；擴增：95 ℃變性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，于72 ℃處收集熒光，共40個循環(huán)；55～95 ℃每上升1 ℃收集1次熒光。創(chuàng)建熔解曲線，反應參數為：95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～95 ℃，以0.1 ℃/s的速率升溫，整個過程連續(xù)采集熒光。

1.3數據處理PCR的結果以Ct值表示,數據處理采用比較Ct值法，△Ct目的基因=每個標本的目的基因Ct值-內參基因Ct值，△△Ct目的基因=處理組△Ct目的基因值-對照組△Ct目的基因值，miR-16與U6相對表達量用2-△△Ct方法計算，2-△△Ct值表示病例組miRNA的表達水平相對于對照組的差異倍數，變化倍數大于>2為高表達，變化倍數<0.5為低表達。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。由于實驗數據并不滿足正態(tài)分布和方差齊性條件，故數據以中位數(25%～75%)[M(Q1，Q3)]表示，采用非參數秩和檢驗；相關性采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1擴增產物鑒定經電泳檢測，miR-16和U6與預期片段大小(分別為75 bp和100 bp)相符，條帶清晰，無拖尾現象。

2.2擴增曲線及熔解曲線分析所有樣本擴增曲線呈典型S型，平臺期大致平行，提示各孔反應運行良好，且擴增效率基本一致；Ct值在18～35之間，說明本次實驗數據有效，可以用來進行基因表達量的對比分析。所有樣本解鏈曲線均為單一峰值，而且峰線窄而尖，Tm值約為78 ℃左右，未出現雜峰，表明PCR產物單一，無非特異性擴增；NTC解鏈曲線無特異性主峰出現，說明并不存在引物二聚體污染。

2.3miR-16表達水平比較及其與臨床指標的關系

2.3.1miR-16在RA血漿中的表達miR-16在血漿中的水平顯著高于關節(jié)滑液和PBMCs(P<0.01)。關節(jié)滑液中的表達水平高于PBMCs，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-16在RA組血漿中的表達水平低于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在PBMCs中的表達水平顯著高于正常對照組(P<0.01)。與OA患者相比，miR-16在RA患者關節(jié)滑液中的表達水平顯著升高(P<0.01)。見表1～3。

2.3.2相關性分析血漿中miR-16表達與DAS28評分呈負相關(P<0.05)，與ESR和CRP均無相關性(P>0.05)；PBMC中miR-16表達與DAS28評分、ESR及CRP均呈正相關(P<0.05)；關節(jié)滑液中miR-16表達與DAS28評分、ESR及CRP均無相關性(P>0.05)。見表4。

表1　RA患者不同標本中miR-16表達比較

*P<0.05與關節(jié)滑液比較#P<0.05與PBMC比較(秩和檢驗)

表2　RA組和正常對照組血漿和PBMC中

表3　RA組與OA組關節(jié)滑液中miR-16表達比較

表4　RA患者不同組織miR-16表達水平與DAS28評分、ESR及CRP的相關性

3討論

RA是一種嚴重危害人類健康的、以滑膜組織慢性炎癥病變?yōu)轱@著特征的疾病，但早期癥狀并不典型，確診時已出現關節(jié)進行性破壞而錯失最佳治療時機。人們仍在不斷尋找能夠用于RA早期篩選的新一代診斷指標。miRNA是一類大小19～23個堿基的內源性非編碼單鏈相對小分子質量RNA，現已發(fā)現超過700種，其在血清/血漿中的含量十分穩(wěn)定，可抵抗RNA酶降解，也可耐受強酸、強堿、煮沸及反復凍融等各種極端條件[1]。近年來在血清/血漿、尿液、唾液及陰道分泌物等體液中陸續(xù)發(fā)現了miRNA分子的存在[4-6]。體液miRNA與組織/細胞miRNA一樣，在不同病理狀態(tài)下呈現特異性改變，在正常和病理組織中，miRNA表達水平存在差異，即使在不同分化時期的同一組織，其表達水平也不同。miRNA參與了T、B淋巴細胞分化和天然免疫反應，并調節(jié)免疫細胞信號轉導，在轉錄后水平通過表達量的上調或下調影響細胞的發(fā)育和疾病過程[1]，在炎性細胞的發(fā)育、炎性分子的表達等方面都有重要調節(jié)作用，最終影響炎性反應的進程和結果。目前至少發(fā)現10種miRNA在RA中異常表達(miRNA-16、miRNA-124a、miRNA-132、iRNA-146a、miRNA-155、miRNA-203、miRNA-223、miRNA-346、miRNA-363、miRNA-498)[7]。miRNA-124a和miRNA-363下調，7個上調，只有1個miRNA的研究結果是相互矛盾的，miRNA-132在分離的外周血單個核細胞中高表達，但在血漿樣品中與對照組相比表達降低[3]。miR-16位于13號染色體長臂1區(qū)4帶(13q14)，通過靶向作用bcl-2蛋白的表達而降低細胞的增殖和侵襲能力并誘導細胞凋亡,miR-16極有可能影響炎性因子的表達從而參與炎癥的發(fā)病過程[2,8]。

Stem-loop RT-qPCR法使用5′端為特殊莖環(huán)結構的逆轉錄引物，與miRNA結合時不與莖環(huán)序列嚴格配對的miRNA無法進行反轉錄,從而可實現對目標miRNA分子的特異性篩選，采用SYBR Green Ⅰ染料滲入法檢測信號靈敏度高,特異性好。miR-16和U6擴增產物分別經瓊脂糖凝膠電泳檢測和全程熔解曲線分析，結果均表明未出現非特異性擴增和引物二聚體現象，提示熔解曲線分析可有效區(qū)分特異及非特異性PCR產物；此外，擴增曲線呈典型S型，指數期明顯，平臺期一致,CT值基本在有效范圍內，提示莖環(huán)逆轉錄引物特異性高，可將目的基因與miRNA前體、同一家族miRNA成員以及基因組DNA等區(qū)分開來。我們采用該法檢測RA患者血漿和關節(jié)滑液miR-16的表達水平，所需樣本量也很少，只需提供100 ng左右的總RNA即可檢測到miRNA的存在，是一種靈敏而且特異的miRNA定量檢測方法。

本研究結果顯示，在RA患者關節(jié)滑液與血漿中均可檢測到miR-16的表達，關節(jié)滑液和PBMC中miR-16的表達量差異無統(tǒng)計學意義，但是血漿組miR-16的表達水平卻顯著高于關節(jié)滑液。miR-16的表達量差異如此之大，提示血漿、關節(jié)滑液及PBMC中的來源并不相同，彼此之間沒有相關性，在血漿、關節(jié)滑液及PBMC中有可能存在不同的miRNA表達譜[9]。血漿miR-16的表達水平顯著高于關節(jié)滑液和PBMC，由此我們推測全身各組織分泌及細胞內RNA的破碎釋放極有可能是血漿miR-16的主要來源。與OA患者相比，RA患者關節(jié)滑液miR-16的表達水平明顯升高，有望成為RA診斷及與OA鑒別診斷的新一代分子標志物。

DAS28評分、ESR和CRP是反映疾病活動度和炎癥程度的常用指標。本研究結果顯示，miR-16在RA患者PBMC中的表達水平不僅顯著高于正常對照組，并且其表達量與DAS28評分、ESR及CRP均呈顯著正相關。與相關報道相同[2,10]。提示PBMC中miR-16的表達上調與RA病情活動度和炎癥程度有密切關系，miR-16與RA成纖維細胞增殖及滑膜細胞炎癥反應密切相關[10-13]。另外，RA患者血漿miR-16的表達與DAS28評分呈顯著負相關，但樣本數量較少，需要加大樣本數量進一步證實數據的穩(wěn)定性及可重復性。

免疫細胞的參與在RA的發(fā)病過程中發(fā)揮了十分重要的作用。T細胞可通過細胞間相互作用誘導細胞因子及炎癥介質的產生,從而加重機體的炎癥反應并最終導致關節(jié)組織的破壞。因而miR-16在PBMC(主要為淋巴細胞)的表達水平與血漿、關節(jié)滑液相比更能反映患者機體的炎癥程度和病情的活動度?；簃iR-16則有可能直接來源于病變滑膜組織以及浸潤細胞的分泌，其過度表達與滑膜局部炎癥刺激有很大的關系，更能反映關節(jié)滑膜的病變程度。miR-16所引起的炎癥反應很可能是眾多靶基因共同作用并且相互影響的結果，其與DAS28評分的顯著相關性也強烈提示在RA錯綜復雜的病因學網絡中，miR-16及其靶基因是非常重要的組成部分。但是目前與RA病程相關的miR-16的靶基因并未明了，miR-16如何參與RA的發(fā)病機制，需要進一步研究。

綜上所述，關節(jié)滑液miR-16可望用于RA與OA的鑒別診斷，血漿miR-16可望用作評估RA病情的有效指標。盡管其詳細的作用機制尚不清楚，但不能否定其潛在的診斷價值。而進一步深入研究miR-16及其靶基因的表達及其對靶基因的調控機制，可能為及時阻止RA患者病情發(fā)展、降低致殘率及提高生活質量帶來新的希望。

[參考文獻]

[1]Bartel DP. microRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J]. Cell,2004,116(2):281-297.

[2]Pauley KM,Satoh M,Chan AL,et al. Upregulated miR-146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients[J]. Arthritis Res Ther,2008,10(4):R101.

[3]Duroux-Richard I,Jorgensen C,Apparailly F. miRNAs and rheumatoid arthritis-promising novel biomarkers[J]. Swiss Med Wkly，2011，141(3):w13175.

[4]Ceribelli A,Nahid MA,Satoh M,et al. MicroRNAs in rheumatoid arthritis[J]. FEBS Lett，2011,585(23):3667-3674.

[5]Hanke M,Hoefig K,Merz H,et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker:microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer[J]. Urol Oncol,2010,28(6):655-661.

[6]Zubakov D,Boersma AW,Choi Y,et al. microRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation[J]. Int J Legal Med,2010,124(3):217-226.

[7]Duroux-Richard I,Presumey J,Courties G,et al. microRNAs as new player in rheumatoid arthritis[J]. Join Bone Spine，2011，78(1):17-22.

[9]Mookherjee N,El-Gabalawy HS. High degree of correlation between whole blood and PBMC expression levels of miR-155 and miR-146a in healthy controls and rheumatoid arthritis patients[J]. J Immunol Methods，2013，400/401(12)：106-110.

[10]馮知濤，李娟，任潔，等.類風濕關節(jié)炎患者外周血miR-146a及miR-16的表達及與病情活動的相關性研究[J].南方醫(yī)科大學學報,2011,31(2):320-324.

[11]呂廣衛(wèi)，董士民.微小RNA與心肌肥大[J].臨床薈萃，2013，28(6):716-718.

[12]Okuhara A， Nakasa T， Shibuya H，et al. Changes in microRNA expression in peripheral mononuclear cells according to the progression of osteoarthritis[J]. Mod Rheumatol,2012,22(3):446-457.

[13]Murata K,Yoshitomi H,Tanida S,et al. Plasma and synovial fluid microRNAs as potential biomarkers of rheumatoid arthritis and osteoarthritis[J]. Arthritis Res Ther,2010,12(3):R86.

(本文編輯：劉斯靜)

Expression of miR-16 in plasma and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis

FENG Zhong-jun1, FENG Yan-rui1, WEN Hai-feng1, SUN Yin2

(1.Department of Laboratory Medicine， the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051， China；2.Department of Laboratory Medicine， the Affiliated Hospital of Jining Medical College， Jining 272029， China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the expression levels of miR-16 in plasma and synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis(RA),and to explore its value in early differented diagnosis and in prediction of disease severity of RA. MethodsPlasma, peripheral blood mononuclear cell(PBMCs) and synovial fluid were taken from patients with RA and osteoarthritis(OA).The expression level of miR-16 was detected by stem-loop real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(stem-loop FQ-PCR) with SYBR GreenⅠdye, and using U6snRNA as endogenous control. ResultsBoth of the amplication curves and the dissociation curves of miR-16 and U6snRNA were running well. No primer dimmers were formed, and the products of PCR were specific. The expression level of miR-16 in plasma was higher than those in synovial fluid and PBMCs, respectively(P<0.01). The expression level of miR-16 in PBMCs was higher for RA patients than for healthy controls(P<0.01)， the level in synovial fluid was higher for RA patients than for OA patients(P<0.01). The expression level of miR-16 in plasma was inversely correlated with the Disease Activity Score(DAS28)(P<0.05), but was not correlated with erythrocyte sedimentation rate(ESR) and C-reactive protein(CRP). the miR-16 level in PBMCs was positively correlated with DAS28, ESR and CRP(P<0.05). The miR-16 level in synovial fluid had no correlations with DAS28, ESR and CRP(P>0.05). ConclusionStem-loop FQ-PCR with SYBR Green Ⅰdye was a sensitive and specific method for the quantitative detection of miRNAs. There were distinct profiles in plasma and synovial fluid,and the expression level of miR-16 in synovial fluid can be a marker for differential diagnosis of RA and OA. The expression level of plasma miR-16 can serve as an effective novel indicator on assessment of the clinical disease activity.

[Key words]arthritis， rheumatoid; synovial fluid; microRNAs

[中圖分類號]R593.22

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)03-0296-05

[作者簡介]馮忠軍(1968-)，男，河北泊頭人，河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院主任技師，醫(yī)學碩士，從事臨床檢驗學研究。

[收稿日期]2014-11-19；[修回日期]2014-12-28