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·研究快報(bào)·

Sirt1轉(zhuǎn)基因小鼠股動(dòng)脈結(jié)扎后血管新生的初步研究

李曉坤，麻曉婷，聶磊，竇永青，韓梅*(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

[關(guān)鍵詞]新生血管化,生理性；股動(dòng)脈；小鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.026

血管新生是在血管新生因子刺激下，已存在的血管通過內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖形成新血管的過程[1-3]。生理情況下，血管新生可以為組織提供更多血流，而當(dāng)其調(diào)節(jié)紊亂時(shí)會(huì)發(fā)生血管新生異常，包括血管新生過度或血管生成不足，進(jìn)而造成多種疾病，如惡性腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性心臟病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。因此，研究血管新生性疾病的治療靶點(diǎn)具有重要意義。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶[4-5]，對(duì)調(diào)節(jié)衰老、細(xì)胞存活、代謝和炎癥、腫瘤形成等起重要作用，有研究報(bào)道SIRT1在血管新生中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[6]。本研究利用野生型(wild type,WT)C57BL/6及Sirt1轉(zhuǎn)基因(Sirt1-Transgenic，Sirt1-Tg)小鼠建立下肢股動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)模型，對(duì)組織缺血后血管新生情況進(jìn)行初步研究。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，Sirt1-Tg小鼠由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)劉德培教授惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室自行繁殖培育。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于無特定病原體(specefic pathogen free,SPF)級(jí)動(dòng)物房，溫度濕度恒定的獨(dú)立通氣籠盒，清潔飲水，自由取食。環(huán)境采用12 h明暗循環(huán)，早7：00到晚7：00照明，晚7：00到次日早7：00無照明。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行。

1.2Sirt1-Tg小鼠基因型鑒定隨機(jī)選取6～8周齡Sirt1-Tg小鼠，按照雌雄比例為2∶1的方式交配[7]，自由飲水取食，孕鼠自然分娩。仔鼠出生3周后斷奶，雌雄分籠，取鼠耳基因組DNA，用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)進(jìn)行基因型鑒定。引物序列如下：上游引物 5′-CTTCAGGTCAAGGGATGGTAT-3′，下游引物 5′-GCGTGTCTATGTTCTGGGTAT-3′。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為233 bp。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 20 s、53 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s(30個(gè)循環(huán))，72 ℃ 10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果。

1.3左下肢股動(dòng)脈結(jié)扎小鼠模型建立隨機(jī)挑選8周齡的成年雄性C57BL/6(WT)小鼠及Sirt1-Tg小鼠各10只，手術(shù)全程在小動(dòng)物麻醉機(jī)下進(jìn)行，采用異氟烷持續(xù)吸入麻醉方式麻醉小鼠，取俯臥位，用透明膠帶將小鼠四肢固定于手術(shù)板上，在固定條件(室溫24 ℃、無強(qiáng)光、無噪聲)下采用血流測(cè)量?jī)xPeriCam PSI測(cè)量術(shù)前雙下肢血流灌注情況并采用激光散斑對(duì)比分析技術(shù)記錄圖像。仰臥位下，常規(guī)褪毛備皮，75%酒精消毒左下肢側(cè)，用眼科鑷提起皮膚，用剪刀從左側(cè)腹股溝到左大腿內(nèi)側(cè)沿血管走行方向縱行剪開一長(zhǎng)1～1.5 cm的切口。在解剖顯微鏡視野下，用眼科鑷鈍性分離皮下組織，刺破膜狀血管鞘，充分暴露股動(dòng)脈、股靜脈及其分支和股神經(jīng)。輕輕分離股神經(jīng)使其游離，然后將股動(dòng)脈與股靜脈分離，用彎頭眼科鑷剝離股動(dòng)脈至股動(dòng)脈分支處，防止損傷血管，用2根7號(hào)手術(shù)縫線穿過股動(dòng)脈進(jìn)行雙端結(jié)扎，上端緊靠股動(dòng)脈分支，下端距上端約5 mm，剪斷兩結(jié)扎點(diǎn)間的股動(dòng)脈[8]，縫合皮膚。再次用血流測(cè)量?jī)xPeriCam PSI測(cè)量俯臥位時(shí)小鼠雙下肢血流灌注情況，結(jié)扎側(cè)無血流灌注即為模型建造成功。分別于術(shù)后3、7、14 d進(jìn)行血流監(jiān)測(cè)分析。

2結(jié)果

2.1小鼠基因型鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，Sirt1-Tg小鼠PCR產(chǎn)物在250 bp附近可見清晰的條帶，WT小鼠無此條帶(圖1)。

2.2血流監(jiān)測(cè)激光散斑對(duì)比分析技術(shù)血流監(jiān)測(cè)顯示，結(jié)扎術(shù)前，Sirt1-Tg小鼠及WT小鼠雙下肢血流灌注信號(hào)分布均一(圖2 A,B)；左下肢股動(dòng)脈結(jié)扎后，該側(cè)肢體血流灌注信號(hào)明顯減弱甚至消失(圖2 C,D)；結(jié)扎術(shù)后3 d，左下肢顯示局部微弱的血流灌注信號(hào)(圖2 E,F)；結(jié)扎術(shù)后7 d(圖2 G,H)、14 d(圖2 I,J)Sirt1-Tg小鼠及WT小鼠左下肢血流灌注均有所恢復(fù)，但Sirt1-Tg小鼠左下肢血流灌注恢復(fù)情況明顯較WT小鼠差。

圖1Sirt1-Tg小鼠基因型鑒定

M.Marker；WT.野生型C57BL/6小鼠；1～6.Sirt1-Tg小鼠

圖2股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后2組小鼠下肢血流變化示意圖

*為小鼠左下肢，未標(biāo)示側(cè)為小鼠右下肢。血流信號(hào)圖像對(duì)應(yīng)不同的顏色：紅色表示最大血流灌注量，藍(lán)色(或深藍(lán)色)相反，黃色介于兩者之間

A.結(jié)扎術(shù)前WT小鼠;B.結(jié)扎術(shù)前Sirt1-Tg小鼠;C.術(shù)后即刻WT小鼠;D.術(shù)后即刻Sirt1-Tg小鼠;E.術(shù)后3 d WT小鼠;F.術(shù)后3 dSirt1-Tg小鼠;G.術(shù)后7 d WT小鼠;H.術(shù)后7 dSirt1-Tg小鼠;I.術(shù)后14 d WT小鼠;J.術(shù)后14 dSirt1-Tg小鼠

3討論

新生血管性疾病，無論是血管生成過度或是血管生成不足均同人類健康和疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，如血管新生過度參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，血管新生不足則會(huì)引起各種缺血性疾病。SIRT1在應(yīng)激反應(yīng)、代謝、衰老、腫瘤發(fā)生發(fā)展等多個(gè)生理病理過程中發(fā)揮重要作用[9]，有研究顯示SIRT1在腫瘤血管新生中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用[10]。本研究結(jié)果顯示Sirt1-Tg小鼠在股動(dòng)脈結(jié)扎后血流灌注恢復(fù)差。提示血管新生受到抑制，但其具體的影響機(jī)制尚須進(jìn)一步探索。缺血缺氧狀態(tài)下低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)[11]對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)影響最大，VEGF具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化功能的作用[12]，能夠促進(jìn)血管新生[13]。有研究報(bào)道，SIRT1通過下調(diào)HIF-1α表達(dá)而抑制VEGF的轉(zhuǎn)錄活性及蛋白表達(dá)，從而抑制血管新生[14]。也有研究顯示在缺氧環(huán)境下，SIRT1通過使HIF-1α發(fā)生脫乙酰作用而失活[10]。這些為后續(xù)研究提供了一定的思路。

本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于引入了Sirt1-Tg小鼠制作組織缺血-血管新生模型。初步結(jié)果提示，SIRT1可能對(duì)血管新生過程具有抑制作用，該發(fā)現(xiàn)對(duì)理解腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和缺血性損傷修復(fù)機(jī)制提供了新的觀點(diǎn)。

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(本文編輯：趙麗潔)

[中圖分類號(hào)]R331.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]B

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)03-0340-03

[作者簡(jiǎn)介]李曉坤(1991-)，女，河北平山人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事血管生物學(xué)研究。*通訊作者。E-mail：hanmei@hebmu.edu.cn

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(91439114，31471092，31271222)

[收稿日期]2015-12-23；[修回日期]2016-02-01