高　毅，穆春暉，刁志虹，李　敏，王雙雙，楊　琳(⒈河北省中醫(yī)院口腔科,河北 石家莊 05007；.北京市東城區(qū)第一人民醫(yī)院口腔科，北京 0000；3.河北省石家莊市第一醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 0500)

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·論著·

補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞BMP2表達(dá)及TRPV5/TRPV6通道影響的實(shí)驗(yàn)研究

高毅1，穆春暉2，刁志虹3*，李敏1，王雙雙1，楊琳1(⒈河北省中醫(yī)院口腔科,河北 石家莊 050017；2.北京市東城區(qū)第一人民醫(yī)院口腔科，北京 100010；3.河北省石家莊市第一醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050011)

[摘要]目的觀察補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1細(xì)胞)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)表達(dá)及TRPV5/TRPV6通道的影響，探討補(bǔ)腎活血固齒方成骨的作用機(jī)制。方法按體表面積折算等效劑量的補(bǔ)腎活血固齒方灌胃大鼠，制備含藥血清；等劑量生理鹽水灌胃大鼠，制備無(wú)藥血清作為對(duì)照。用10%含藥血清、無(wú)藥血清分別培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞24、48、72 h，RT-PCR法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞BMP2、TRPV5/TRPV6 mRNA的表達(dá)。結(jié)果含藥血清組MC3T3-E1細(xì)胞的BMP2、TRPV6 mRNA表達(dá)量較無(wú)藥血清組增加(P<0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)有逐漸增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。含藥血清組和無(wú)藥血清組MC3T3-E1細(xì)胞中均未檢測(cè)到TRPV5 mRNA的表達(dá)。結(jié)論補(bǔ)腎活血固齒方可能是通過(guò)鈣離子通道TRPV6上調(diào)BMP2的表達(dá)、誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的。

[關(guān)鍵詞]牙周疾?。谎a(bǔ)腎活血固齒方；實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.009

牙周炎是以牙周袋形成、袋壁炎癥、牙槽骨進(jìn)行性吸收和破壞、牙齒松動(dòng)為主要癥狀的口腔常見(jiàn)病、多發(fā)病，牙周炎不僅導(dǎo)致成人牙齒過(guò)早喪失，并可誘發(fā)各種全身性疾病，嚴(yán)重影響其健康。中醫(yī)運(yùn)用中藥，尤其是補(bǔ)腎中藥治療牙周炎引起的牙齒松動(dòng)有著悠久歷史。根治牙周炎的關(guān)鍵是通過(guò)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用阻止牙槽骨吸收或促進(jìn)牙槽骨的再生，成骨細(xì)胞在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用。成骨細(xì)胞表達(dá)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)是骨修復(fù)中最主要的誘導(dǎo)因子，其亞型BMP2的誘導(dǎo)成骨能力較為明顯，BMP2通過(guò)Smads和p38MAPK信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)多種特異性成骨因子如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)，產(chǎn)生相應(yīng)蛋白分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，使細(xì)胞外基質(zhì)礦化，進(jìn)而完成成骨。鈣離子通道TRPV5/TRPV6通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量的變化，激活p38MAPK通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。本研究采用中藥血清體外培養(yǎng)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1細(xì)胞)，觀察補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)細(xì)胞BMP2及TRPV5/TRPV6通道表達(dá)的影響，探討補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)成骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制，旨在為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康雄性SD系大鼠20只，體質(zhì)量280～300 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：冀醫(yī)動(dòng)管字號(hào)1312020)。飼養(yǎng)條件：室溫保持在18～25 ℃，空氣流通，12 h維持光照，動(dòng)物在籠中自由攝食飲水。

1.2中藥制備淫羊藿15 g、補(bǔ)骨脂15 g、熟地黃10 g、當(dāng)歸10 g、丹參10 g、知母10 g、甘草3 g。藥物加10倍量蒸餾水煎煮1.5 h過(guò)濾，加同量蒸餾水重煎1.5 h過(guò)濾，合并濾液濃縮至150 mL裝袋備用(含生藥量 0.487 g/mL)。

1.3細(xì)胞株小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14 (MC3T3-E1 Subclone14)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù) (ATCC CRL-2594)。

1.4主要試劑和儀器α-MEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胎牛血清(PAA Laboraties GmbH)，葉酸(Amresco)， β-疏基乙醇(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，肌醇(北京索萊寶科技股份有限公司)，胰酶(Amresco)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine totraacetic acid,EDTA)(天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)公司)，戊巴比妥(華北制藥股份有限公司)，TAE緩沖液(Solarbio公司)，溴化乙錠(ethidium bromide,EB)(Solarbio公司)，瓊脂糖(Solarbio公司)，Trizol(Solarbio公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)，PCR SuperMix擴(kuò)增試劑盒(Invitrogen公司)，100 bp DNA Ladder(TANGEN)。HF240二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)，BSC-1100ⅡA2生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，TE2000-U熒光倒置顯微鏡(NiKon)，B40型醫(yī)用低速離心機(jī)(安新縣白洋離心機(jī)廠)，D-37520高速離心機(jī)(Thermo ELECTRON CORPORATION)，HKA-A2450-230精密電子天平(BEL Engineering)，DDY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，一體化凝膠成像分析儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)，96孔PCR儀(Applied Biosystems)。

1.5血清制備20只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為含藥血清組和無(wú)藥血清組，每組10只。含藥血清組的血清制備：補(bǔ)腎活血固齒方經(jīng)煎制后，按體表面積折算等效劑量，0.487 g(生藥)/kg(體質(zhì)量)計(jì)算用藥量。SD大鼠10只每日灌胃2次，連續(xù)灌胃7 d，第7天第2次灌胃后間隔2 h再次灌胃，末次灌胃1 h后，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心20 min，取上清，56 ℃水浴滅活30 min，抽濾除菌后，-20 ℃保存?zhèn)溆?。無(wú)藥血清組的血清來(lái)自等劑量生理鹽水灌胃的大鼠，灌胃操作及血清制備方法同前。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于α-MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 g/L鏈霉素)，5% CO2，95%濕度，恒溫37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，1周左右細(xì)胞基本鋪滿瓶底后傳代。吸去原培養(yǎng)液，PBS溶液清洗2遍，0.25%胰酶1 mL，37 ℃消化1 min，鏡下觀察細(xì)胞收縮，變圓，α-MEM培養(yǎng)基1.5 mL終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其懸浮，移至離心管，1 000 r/min離心5 min，吸去上清液，加入適量α-MEM培養(yǎng)基，混懸細(xì)胞，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞30 000個(gè)。

1.7RT-PCR法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞中BMP2、TRPV5/TRPV6 mRNA的表達(dá)

1.7.1分組按“1.6”方法培養(yǎng)細(xì)胞2 d后分別換用含藥血清(培基含10%含藥血清)和無(wú)藥血清(培基含10%無(wú)藥血清)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，分別檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)MC3T3-E1細(xì)胞BMP2、TRPV5/TRPV6 mRNA的表達(dá)。

1.7.2細(xì)胞總RNA的提取每瓶細(xì)胞，倒掉培基，PBS洗2遍，加入Trizol試劑1 mL，吹打混勻細(xì)胞，加入大EP管，冰上靜置10 min。加入氯仿200 μL，劇烈振蕩12 s，冰上靜置3 min,4 ℃，12 000 r/min離心15 min。吸取上層無(wú)色液相加入新的EP管中。新EP管加入500 μL異丙醇，混勻，冰上靜置10 min。12 000 r/min離心10 min，棄上清。EP管中加入1 mL 75%乙醇，振蕩使沉淀懸浮，靜置1 min。9 000 r/min離心10 min。吸干剩余乙醇。白色透明狀沉淀加入去核酶水20 μL，吹打混勻即為提取的總RNA，-20 ℃保存。

1.7.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分別取各樣品總RNA 5 μg，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得溶液即為cDNA，置冰浴待用。

1.7.4擴(kuò)增反應(yīng)TRPV5、TRPV6、BMP2、GAPDH引物序列及反應(yīng)條件，見(jiàn)表1。

表1　TRPV5、TRPV6、BMP2、GAPDH引物序列及反應(yīng)條件

1.7.5產(chǎn)物檢測(cè)PCR產(chǎn)物1 μL與5×100 bp DNA Ladder 5μL混勻加入瓊脂糖膠孔， 110 mV電壓電泳40 min，自動(dòng)凝膠成像分析儀進(jìn)行輝度掃描并觀察拍照，QuatityOne軟件進(jìn)行輝度值比較。以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算TRPV5、TRPV6、BMP2的相對(duì)含量，結(jié)果以TRPV5、TRPV6、BMP2條帶灰度值占GAPDH條帶灰度值的百分率表示mRNA的表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料比較分別采用t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1RT-PCR法檢測(cè)BMP2 mRNA表達(dá)2組MC3T3-E1細(xì)胞中均有BMP2 mRNA表達(dá)，且表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)有增加趨勢(shì)，但組內(nèi)24、48、72 h之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而含藥血清組24、48、 72 h BMP2 mRNA表達(dá)量均較無(wú)藥血清組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表22組不同時(shí)間BMP2 mRNA表達(dá)比較

Table 2BMP2 mRNA expression level at different time

points in two groups

組別培養(yǎng)時(shí)間24h48h72hFP無(wú)藥血清組0.040±0.0270.044±0.0210.048±0.0270.1520.861含藥血清組0.081±0.0360.088±0.0180.098±0.0150.7120.506t 2.2323.8973.965P 0.0490.0030.003

2.2RT-PCR法檢測(cè)TRPV5/TRPV6 mRNA表達(dá)2組MC3T3-E1細(xì)胞中均無(wú)TRPV5 mRNA表達(dá)。2組MC3T3-E1細(xì)胞中均有TRPV6 mRNA表達(dá)，且表達(dá)量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸增加趨勢(shì)，但組內(nèi)24、48、72 h之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而含藥血清組24、48和72 h TRPV6 mRNA表達(dá)量均較無(wú)藥血清組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表32組不同時(shí)間TRPV6 mRNA表達(dá)比較

Table 3TRPV6 mRNA expression level at different time

points in two groups

組別培養(yǎng)時(shí)間24h48h72hFP無(wú)藥血清組0.094±0.0310.106±0.0230.115±0.0290.8570.444含藥血清組0.292±0.0690.301±0.0420.311±0.0360.2080.815t 6.4129.97510.380P 0.0000.0000.003

3討論

“血清藥理學(xué)”由田代真一于1988年提出，原理是使用中藥或中藥復(fù)方給動(dòng)物灌服一定時(shí)間后采集、分離動(dòng)物血清，用含有藥物成分的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法[1]。該方法可有效防止中藥制劑自身理化性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，反映中藥在胃腸道內(nèi)的消化吸收、生物轉(zhuǎn)化、產(chǎn)生藥效的真實(shí)過(guò)程，克服了中藥制劑的體內(nèi)代謝物或機(jī)體反應(yīng)物等有效成分引起的假陰性和機(jī)體非吸收物的體外作用造成的假陽(yáng)性[2]，客觀模擬了藥物與機(jī)體的相互作用，代表了藥物在體內(nèi)產(chǎn)生作用的真正有效成分。

BMPs是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的重要細(xì)胞因子[3]。BMPs可以誘導(dǎo)前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)未定型和定型的成骨細(xì)胞經(jīng)過(guò)趨化、分裂、分化等過(guò)程，不可逆的分化成骨[4]。BMPs的亞型BMP2的誘導(dǎo)成骨能力較為明顯，研究表明BMP2通過(guò)Smads和p38MAPK信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞分化，BMP2與Ⅱ型受體(type Ⅱ bone morphogenetic protein receptor,BMPR-Ⅱ)結(jié)合后磷酸化Ⅰ型受體(BMPR-Ⅰ)，磷酸化的BMPR-Ⅰ進(jìn)一步磷酸化與BMPs特異作用的Smads蛋白，Smads蛋白進(jìn)入細(xì)胞核后通過(guò)增加特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)促進(jìn)ALP合成，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[5-6]。BMP2也可以與BMPR-Ⅰ形成復(fù)合體，復(fù)合體與橋蛋白作用，介導(dǎo)下游信號(hào)分子TAB1的活化，活化的TAB1激活TAK1信號(hào)途徑，TAK1信號(hào)途徑進(jìn)而激活p38MAPK通路，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)ALP[7-8]。ALP是骨形成所必需的酶，ALP 的表達(dá)標(biāo)志成骨細(xì)胞分化的開(kāi)始，ALP活性是成骨細(xì)胞功能及分化程度的指標(biāo)[9-10]。ALP表達(dá)升高是啟動(dòng)礦化的必備條件，作用是水解磷酸酯為沉積羥基磷灰石提供必要的磷酸，水解焦磷酸鹽，解除其對(duì)礦物質(zhì)形成的抑制作用，從而促進(jìn)羥磷灰石的形成，促進(jìn)細(xì)胞成熟、鈣化[11-12]。本研究結(jié)果顯示，含藥血清和無(wú)藥血清培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞均有BMP2 mRNA表達(dá)，含藥血清BMP2 mRNA表達(dá)量較無(wú)藥血清高。表明含藥血清可顯著地增加BMP2 mRNA的表達(dá)水平。因此，認(rèn)為補(bǔ)腎活血固齒方可通過(guò)提高BMP2 mRNA表達(dá)水平誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化。

TRPV5/TRPV6通道是高選擇性鈣離子通道，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度較低時(shí)，鈣離子通過(guò)該通道進(jìn)入細(xì)胞，參與多種信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞的分化、成熟以及骨的形成[13]。Hoenderop等[14]研究表明，TRPV5/TRPV6通道通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量的變化，調(diào)節(jié)p38MAPK信號(hào)通路，最終調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖及骨代謝；p38MAPK通路可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化過(guò)程中ALP的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟。本研究發(fā)現(xiàn)含藥血清和無(wú)藥血清培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞中均有TRPV6 mRNA表達(dá)，且表達(dá)量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，含藥血清組的表達(dá)量較無(wú)藥血清高(P<0.05)；而含藥血清及無(wú)藥血清培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞中均未檢測(cè)到TRPV5 mRNA的表達(dá)。李富春等[15]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠成骨細(xì)胞分化過(guò)程中 TRPV5/TRPV6 通道均有不同程度陽(yáng)性表達(dá)，且TRPV5/TRPV6 的表達(dá)隨誘導(dǎo)分化時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)。van der Eerden等[16]在人股骨分離的成骨細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到TRPV5 mRNA。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果相符，但這些結(jié)果無(wú)法確定TRPV5通道在MC3T3-E1細(xì)胞中不存在，TRPV5 mRNA的表達(dá)是否存在窗口期或者需要特定的激活條件，需要進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血固齒方可提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞中BMP2、TRPV6 mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)而通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和骨代謝。

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(本文編輯：許卓文)

The experimental study of effects of Bushen Huoxue Guchi formula on BMP2 and TRPV5/TRPV6 channels expressions in MC3T3-E1 cells

GAO Yi1, MU Chun-hui2, DIAO Zhi-hong3*, LI Min1,WANG Shuang-shuang1, YANG Lin1

(1.Department of Stomatology, the Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hebei Province, Shijiazhuang 050017, China; 2.Department of Stomatology,the First People′s Hospital of Beijing Dongcheng District, Beijing100010, China; 3.Department of Stomatology,the First Hospital of Shijiazhuang City,Hebei Province, Shijiazhuang 050011, China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of Bushen Huoxue Guchi Formula on bone morphogenetic protein 2(BMP2) and TRPV5/TRPV6 channel expressions, and to explore the mechanism of Bushen Huoxue Guchi Formula in bone formation. MethodsHerb-contained serum was prepared from rats by gavage with Bushen Huoxue Guchi Formula by using body surface area converted equivalent dose. Blank-contained serum as control group was prepared by gavage with normal saline. The BMP2 and TRPV5/TRPV6 mRNA expressions were detected in MC3T3-E1 cells by RT-PCR after the cells were treated with 10% herb-contained serum or blank-contained serum for 24 h, 48 h and 72 h, respectively. ResultsBMP2, TRPV6 mRNA were significantly increased in herb-contained serum treatment group compared with blank-contained serum treatment group(P<0.05). With the prolongation of time, the mRNA expression of BMP2 and TRPV6 had a gragually increased tendency, but there was no statistically significant difference(P>0.05). TRPV5 mRNA was not detected either in herb-contained serum treatment group or blank-contained serum treatment group. ConclusionBushen Huoxue Guchi Formula may upregulate BMP2 expression through TRPV6 channels to induce differentiation of osteoblast.

[Key words]periodontal diseases; Bushen Huoxue Guchi Formula; real-time polymerase chain reaction

[中圖分類(lèi)號(hào)]R781.4

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)03-0280-05

[作者簡(jiǎn)介]高毅(1965-)，女，河北行唐人，河北省中醫(yī)院主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事口腔疾病診治研究。*通訊作者。E-mail:yanjingshe651130@163.com

[基金項(xiàng)目]河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(13277730D)；河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目(2014028)

[收稿日期]2016-01-29；[修回日期]2016-03-01