許文年

(濟南軍區(qū)第四五六醫(yī)院藥械科，山東　濟南　250031)

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左旋多巴對帕金森病大鼠海馬區(qū)酪氨酸羥化酶及α-突觸核蛋白表達的影響

許文年

(濟南軍區(qū)第四五六醫(yī)院藥械科，山東濟南250031)

〔摘要〕目的探討左旋多巴(L-dopa)對帕金森病(PD)大鼠海馬區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)及α-突觸核蛋白(α-Syn)表達的影響。方法選取96只健康雄性Wistar大鼠，按隨機數(shù)字表法分為對照組、PD模型組和L-dopa干預(yù)組各32只；各組再隨機分為4 d和8 d兩個亞組，各16只。對PD模型組和L-dopa干預(yù)組大鼠皮下注射魚藤酮乳液(2 mg/kg)建立大鼠PD模型，對照組皮下注射等劑量的葵花油。造模成功后對L-dopa干預(yù)組大鼠灌胃給予L-dopa干預(yù)治療，對照組及PD模型組大鼠灌胃給予生理鹽水，各組中兩個亞組均分別持續(xù)4 d和8 d。采用Y型電迷宮試驗檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，海馬區(qū)TH和α-Syn的陽性細胞計數(shù)及表達水平的檢測分別采用免疫組化法及Western蛋白印跡法。結(jié)果PD模型組大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力顯著低于對照組，而L-dopa干預(yù)組較PD模型組明顯提升(P<0.05)；PD模型組及L-dopa干預(yù)組大鼠的TH陽性細胞數(shù)及表達水平均顯著低于對照組，L-dopa干預(yù)組高于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組的8 d亞組高于4 d亞組(P<0.05)；PD模型組及L-dopa干預(yù)組的α-Syn表達水平均顯著高于對照組，L-dopa干預(yù)組低于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組的8 d亞組低于4 d亞組(P<0.05)。結(jié)論魚藤酮可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生PD，使其學(xué)習(xí)與記憶能力顯著下降，L-dopa可通過增強海馬區(qū)的TH表達水平，抑制α-Syn的表達，從而治療PD。

〔關(guān)鍵詞〕帕金森??；左旋多巴；酪氨酸羥化酶；α-突觸核蛋白；海馬

帕金森病(PD)的發(fā)病機制與黑質(zhì)紋狀體多巴胺(DA)缺乏有關(guān)，其典型病理改變?yōu)楹谫|(zhì)多巴胺能神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)路易小體(LB)的形成。酪氨酸羥化酶(TH)是由酪氨酸合成DA過程中的關(guān)鍵限速酶，與PD密切相關(guān)〔1〕。α-突觸核蛋白(α-Syn)是LB的主要結(jié)構(gòu)成分，可抑制DA的釋放，研究顯示α-Syn與PD相關(guān)，可作為診斷PD的一種生物學(xué)標志物〔2〕。PD的臨床治療以藥物治療為主，左旋多巴(L-dopa)是目前治療PD的最重要的藥物之一，其本身無活性，須經(jīng)氨基酸脫羧酶的作用轉(zhuǎn)化為DA而發(fā)揮藥理學(xué)作用。研究顯示〔3〕，L-dopa可影響大鼠結(jié)腸TH及α-Syn的表達，研究旨在探討L-dopa對海馬區(qū)TH及α-Syn表達的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物選取96只健康雄性Wistar大鼠(由山東大學(xué)實驗動物中心提供)，月齡3~4個月，體重250~350 g，未出現(xiàn)特定病原菌級(SPF級)。于山東大學(xué)屏障環(huán)境動物實驗室自由進食喂養(yǎng)，室溫(23.0±2.0)℃，濕度50%~75%，自然光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w。

1.2實驗儀器、試劑

1.2.1儀器臺式高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，Y型電迷宮(自制)，奧林巴斯BX63全自動顯微鏡掃描系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)，電泳儀(北京華陽分析儀器廠)，凝膠成像分析系統(tǒng)(廣州易測儀器有限公司)

1.2.2試劑L-dopa(美國Sigma公司)，魚藤酮(陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司)，葵花油，兔抗TH單克隆抗體及兔抗α-Syn多克隆抗體(美國CST公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(中國中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)低分子量標準蛋白(華美生物公司)，即用型免疫組化SP試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)，快速Western blotting試劑盒(上海易利生物科技有限公司)

1.3方法

1.3.1動物分組將96只大鼠按照隨機分組方法分為對照組、PD模型組、L-dopa干預(yù)組各32只；每組再隨機分為模型制備成功后4 d、8 d兩個亞組各16只。其中8只用于免疫組化法檢測，8只用于Western印跡法檢測。

1.3.2PD動物模型制備采用頸背部皮下注射魚藤酮方法對PD模型組和L-dopa干預(yù)組大鼠制備PD模型：(1)魚藤酮乳液配制：以葵花油溶解魚藤酮配制濃度為2 mg/ml的乳液，充分震蕩混勻后避光保存。(2)皮下注射：以2 mg/kg劑量計算各只大鼠的魚藤酮乳液用量，碘伏消毒后，捏起大鼠頸背部皮膚，用1 ml注射器皮下注入。(3)造模成功大鼠篩選：觀察大鼠的行為學(xué)變化，參照相關(guān)文獻〔3〕，以行為學(xué)評分2~6分為大鼠造模成功標準。同時對照組大鼠頸背部皮下注射同劑量的葵花油。

1.3.3處理方法對L-dopa干預(yù)組大鼠給予15 mg/kg L-dopa灌胃，2次/d；對照組及PD模型組大鼠均給予2 ml的生理鹽水灌胃，2次/d，各組的兩個亞組大鼠均分別持續(xù)4 d和8 d。

1.4觀察指標

1.4.1大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力檢測將各組大鼠進行Y型電迷宮測試〔4〕，電壓為40 V，采用不固定次數(shù)隨機法(即安全區(qū)以無規(guī)則的次序變換)。學(xué)習(xí)能力：將大鼠靜置于起步區(qū)3 min后電擊，大鼠逃至安全區(qū)，燈光持續(xù)15 s后熄滅休息，45 s后重新開始下一次操作，以連續(xù)10次試驗中9次正確為達到學(xué)會標準。記憶能力：24 h后以相同方法測試大鼠記憶保存情況。

1.4.2TH和α-Syn陽性細胞計數(shù)采用免疫組化法對TH和α-Syn陽性細胞進行計數(shù)：(1)海馬組織提取：腹腔緩慢推注10%水合氯醛溶液3 ml/kg麻醉大鼠，斷頭處死。迅速打開大鼠顱腔，取出完整全腦，取海馬組織，清洗干凈后迅速放入液氮中，然后放入EP管中-80℃保存。(2)腦干標本制作：取2~3 g腦干組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)；0.3%過氧化氫封閉內(nèi)源性氧化酶20 min；1%山羊血清封閉20 min，分別加入Ⅰ抗(兔抗α-Syn多克隆抗體，兔抗TH單克隆抗體)，4℃孵育過夜；再分別加入生物素Ⅱ抗及辣根酶標記鏈霉卵白素，均于37℃孵育30 min；以上操作均用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗3次，5 min/次，后DAB顯色。(3)陽性細胞計數(shù)。從各亞組大鼠腦干標本中隨機選取不重疊的6視野進行TH及α-Syn陽性細胞計數(shù)，光鏡下陽性細胞胞漿呈棕黃色，胞核呈淺藍色或紫藍色，高倍鏡下觀察陽性細胞形態(tài)變化，進行細胞計數(shù)。

1.4.3TH和α-Syn水平測定采用Western蛋白印跡法：(1)蛋白樣品處理。取海馬組織按40 mg/kg加入蛋白裂解液，電動勻漿器勻漿，冰浴中靜置30 min，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液-20℃保存。經(jīng)蛋白定量后分裝，用4℃預(yù)冷的PBS液調(diào)蛋白濃度及SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液至上樣量一致，沸水浴加熱3~5 min，使蛋白質(zhì)充分變性；(2)上樣、電泳。將樣品冷卻至室溫后直接上樣至SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，放置電泳裝置內(nèi)，電壓設(shè)置100 V，電泳時間100 min。聚偏氟丙烯(PVDF)轉(zhuǎn)模、封閉，后參照說明書進行Ⅰ抗、Ⅱ抗孵育；(3)表達量分析。洗模，以增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，在Image J圖像分析軟件下觀察目的蛋白條件及內(nèi)參的光密度值，兩者的比值反映目的蛋白的相對水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS14.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗和χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力檢測三組大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，PD模型組大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力顯著低于對照組，而L-dopa干預(yù)組較PD模型組明顯提升(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠TH和α-Syn陽性細胞數(shù)比較PD模型組及L-dopa干預(yù)組大鼠的TH陽性細胞數(shù)均顯著低于對照組，而L-dopa干預(yù)組分別高于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組中的8 d亞組TH細胞數(shù)高于4 d亞組(P<0.05)；此外，PD模型組及L-dopa干預(yù)組的α-Syn陽性細胞數(shù)均高于對照組，而L-dopa干預(yù)組分別低于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組的8 d亞組低于4 d亞組(P<0.05)。見表2。

2.3各組大鼠腦干TH和α-Syn表達水平比較PD模型組及L-dopa干預(yù)組大鼠的TH表達水平均顯著低于對照組，而L-dopa干預(yù)組分別高于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組中的8 d亞組TH表達水平高于4 d亞組(P<0.05)；此外，PD模型組及L-dopa干預(yù)組的α-Syn表達水平均高于對照組，而L-dopa干預(yù)組分別低于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組的8 d亞組低于4 d亞組(P<0.05)。見表3。

表1　各組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力測試結(jié)果〔n=32，n(%)〕

與對照組比較：1)P<0.05；與PD模型組比較：2)P<0.05

表2　各組大鼠TH和α-Syn陽性細胞數(shù)

與對照組比較：1)P<0.05；與PD模型組比較：2)P<0.05；與8 d亞組比較：3)P<0.05，下表同

表3　各組大鼠腦干TH和α-Syn表達水平比較

3討論

PD是一種常見的錐體外系疾病，主要表現(xiàn)為運動功能異常，同時可伴隨學(xué)習(xí)、記憶能力降低等癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，約有4%~93%的PD患者在發(fā)病中晚期會呈現(xiàn)PD性癡呆，臨床表現(xiàn)為記憶力、視覺空間、認知能力等受損〔5〕，其機制可能與大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)神經(jīng)元變性有關(guān)。本研究結(jié)果與以往研究結(jié)果一致〔4〕，說明PD模型組大鼠經(jīng)魚藤酮染毒后海馬區(qū)可能發(fā)生神經(jīng)元退變，而導(dǎo)致海馬區(qū)功能受損。

目前PD的發(fā)病原因尚不明確，大部分學(xué)者認為與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和免疫異常等有關(guān)。其主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變，導(dǎo)致DA的缺乏。目前臨床上PD主要以L-dopa替代治療為主，也有越來越多的研究提出不同的治療方法〔6〕，如營養(yǎng)因子治療、干細胞移植治療等，但應(yīng)用于臨床仍面臨高費用、長期療效不確定等問題〔7〕。L-dopa本身沒有活性，其由血腦屏障進入腦內(nèi)經(jīng)過酶的催化作用合成DA而發(fā)揮效應(yīng)，TH是DA合成過程中的重要催化酶，α-Syn也是PD發(fā)生發(fā)展過程中的重要構(gòu)成成分。

本研究結(jié)果提示魚藤酮誘發(fā)大鼠產(chǎn)生PD疾病癥狀，且其可能通過抑制TH酶水平及激發(fā)α-Syn成分的產(chǎn)生而促進PD疾病的發(fā)生發(fā)展。魚藤酮是一種細胞毒性化合物，其主要生化效應(yīng)是抑制細胞呼吸鏈對氧的利用，造成內(nèi)呼吸抑制性缺氧。體外研究發(fā)現(xiàn)，魚藤酮對DA細胞的毒性作用多樣，既可增強DA細胞對其他有害因素的敏感性，又可直接誘發(fā)DA細胞凋亡，還可通過促進DA神經(jīng)元的釋放經(jīng)自身氧化作用而損傷DA神經(jīng)元〔8〕。此外，L-dopa可以通過激發(fā)TH酶水平，抑制α-Syn的產(chǎn)生而發(fā)揮治療PD的作用，顯著改善PD大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，且治療時間與療效呈正比。這與以往的研究結(jié)果相似〔3〕?？赡苁荓-dopa可通過增強TH酶水平表達，及抑制α-Syn釋放的作用，從而促進酪氨酸合成為DA及抑制體內(nèi)LB的生成，達到延緩PD發(fā)展的目的。但對于L-dopa的臨床副作用還有待進一步研究。

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〔2015-10-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號〕R749

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1556-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.009

第一作者：許文年(1971-)，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)方面的研究。