王　夢(mèng)，張加玲

(山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室，太原　030001)

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熒光法測(cè)定果蔬中葉酸含量的研究

王夢(mèng)，張加玲

(山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室，太原030001)

摘要：目的：建立水果蔬菜中葉酸含量的熒光測(cè)定方法。方法：樣品經(jīng)NaOH提取后，在0.2mol/L HAc-NaAc(pH=4.76)反應(yīng)介質(zhì)中被KMnO4氧化，空白以1mol/L H2SO4作為反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行氧化，在λ(ex)=280nm、λ(em)=445nm條件下測(cè)定。結(jié)果：葉酸濃度在6.0～90μg/L范圍內(nèi)與ΔIF呈線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔIF=778.24C+1.1，r=0.9998；方法精密度為1.49%；對(duì)獼猴桃、蘋果、梨、菠菜中葉酸含量進(jìn)行測(cè)定，精密度為2.65%～9.95%，加標(biāo)回收率為86.0%～107.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.52%～8.73%。結(jié)論：本方法提取過(guò)程簡(jiǎn)單、靈敏度高、結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度高，可用于水果蔬菜中葉酸的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：葉酸；熒光法；水果蔬菜

葉酸(folic acid，VM，蝶酰谷氨酸)屬于水溶性維生素，廣泛存在于新鮮水果、蔬菜、動(dòng)物肝臟及豆類等食品中。葉酸在人體中作為一碳單位，參與人體的許多生理活動(dòng)，葉酸缺乏可導(dǎo)致生理功能低下及某些疾病，如巨幼紅細(xì)胞貧血、智力退化、新生兒神經(jīng)管畸形、骨質(zhì)疏松等癥狀[1]的發(fā)生。貧血及骨質(zhì)疏松患者、孕婦和老人應(yīng)增加葉酸的攝入量。因此食物中葉酸的測(cè)定對(duì)指導(dǎo)人們?nèi)粘ｏ嬍场㈩A(yù)防疾病發(fā)生具有重要意義。

目前，葉酸檢測(cè)的主要方法有微生物法、液相色譜法、熒光法等[2]。微生物法為葉酸檢測(cè)的經(jīng)典方法，該方法可檢測(cè)樣品的種類多，靈敏度較高，操作步驟、樣品處理簡(jiǎn)便，不需提純處理，但是檢測(cè)周期長(zhǎng)、重復(fù)性不是很好[3]?，F(xiàn)在使用較廣泛的液相色譜法，適用范圍廣、分離效果好、分析速度快、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。已有將HPLC、UPLC與質(zhì)譜/串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，同時(shí)結(jié)合同位素稀釋技術(shù)對(duì)食品和臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)[4-8]，不僅增加其檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度，還可對(duì)不同形態(tài)的葉酸進(jìn)行測(cè)定。但其儀器設(shè)備要求高，且一般都通過(guò)固相萃取小柱富集、純化，操作步驟較復(fù)雜。熒光法快速、靈敏、選擇性好，儀器簡(jiǎn)單。由于葉酸本身熒光較弱，將其氧化后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度可增加7～8倍，提高了測(cè)定的靈敏度。目前對(duì)水果蔬菜中葉酸的檢測(cè)，多是利用活性炭或高效液相色譜將葉酸分離后測(cè)定。本研究將采用直接堿性溶液提取、離心分離的方法，經(jīng)KMnO4氧化后，用熒光法檢測(cè)水果蔬菜中的葉酸含量。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

RF-540型熒光光度計(jì)(日本島津)；SC-2556型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；100μg/mL葉酸儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10mg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，用幾滴0.01mol/LNaOH溶解后，用蒸餾水定容至100mL，4℃避光冷藏，用時(shí)稀釋成不同濃度；0.2mol/L HAc-NaAc(pH=4.76)：0.2mol/L HAc和0.2mol/L NaAc按1：1(v/v)混合；0.01mol/L NaOH；0.1mol/L和1mol/L H2SO4；0.01mol/L KMnO4；1%H2O2(v/v)。

1.2工作曲線

將葉酸儲(chǔ)備液稀釋成中間液，取不同體積，用蒸餾水均補(bǔ)至3mL，使葉酸最終濃度為6、9、10、20、30、40、60、90μg/L，然后加3mL HAc-NaAc和0.5mL KMnO4進(jìn)行氧化，放置20min后，用H2O2將過(guò)量的KMnO4還原，使溶液呈無(wú)色，用蒸餾水定容至10mL。對(duì)應(yīng)空白加入等量葉酸后，以2ml H2SO4作為反應(yīng)介質(zhì)，經(jīng)過(guò)相同氧化后，在λex=280nm、λem=445nm的條件下測(cè)定葉酸氧化物和空白的熒光I和I0，ΔIF=I-I0。ΔIF與葉酸濃度在6.0～90μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔIF=778.24C+1.1，r=0.999 8。

1.3樣品提取與氧化

準(zhǔn)確稱取適量樣品，研碎，加入0.01mol/L NaOH 20～30mL，水浴加熱10min，放至室溫后加入0.1mol/L H2SO4將NaOH完全中和，定容至100mL。離心10min(4 000r/min)，取上清液≤3mL，按1.2步驟加2mL KMnO4氧化測(cè)定。

2結(jié)果與討論

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

按1.2步驟氧化葉酸，對(duì)其氧化物分別進(jìn)行熒光光譜和激發(fā)光譜掃描。從光譜圖可知：葉酸氧化物的最大激發(fā)波長(zhǎng)在280nm和360nm處，最大發(fā)射波長(zhǎng)在445nm處。本試驗(yàn)選擇280nm為激發(fā)波長(zhǎng)；葉酸氧化物的熒光強(qiáng)度是同濃度葉酸的7～8倍，因此氧化后測(cè)定靈敏度可提高7～8倍。

2.2KMnO4用量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

取等量葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入不同體積的KMnO4，放置20min后定容測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　KMnO4用量對(duì)葉酸氧化物熒光強(qiáng)度的影響

從表1可知，隨著KMnO4用量的增加，熒光強(qiáng)度逐漸降低。因此需將過(guò)量KMnO4除去，以消除其影響。綜合考慮后選用H2O2將多余的KMnO4還原。

2.3H2O2用量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

取7支10mL比色管，加入等量葉酸工作液和0.3mL 0.001mol/LKMnO4，放置20min后加入不同體積的10%H2O2，定容測(cè)定。從表2可知：隨著H2O2用量的增加，熒光強(qiáng)度先升高后降低。H2O2加入量小于0.3mL時(shí)KMnO4為過(guò)量，隨著KMnO4不斷被還原，其影響也逐漸減小，所以熒光強(qiáng)度逐漸增大；H2O2加入量為0.3mL時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大；H2O2加入量大于0.3mL時(shí)，即H2O2過(guò)量后熒光強(qiáng)度逐漸降低。因此，試驗(yàn)中H2O2不可過(guò)量，使溶液剛好呈無(wú)色即可。

表2　H2O2用量對(duì)葉酸氧化物熒光強(qiáng)度的影響

2.4反應(yīng)介質(zhì)的選擇

附圖　葉酸在不同pH反應(yīng)介質(zhì)中被氧化后的熒光強(qiáng)度

測(cè)定等量葉酸工作液在不同pH值的反應(yīng)介質(zhì)中被氧化后的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)附圖?？梢钥闯?，葉酸在不同pH的反應(yīng)介質(zhì)中被氧化，其產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度有很大不同。葉酸在HCl、HAc中氧化，產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度雖然很強(qiáng)，但兩者pH變化會(huì)引起熒光強(qiáng)度很大變化，給樣品測(cè)定時(shí)條件控制帶來(lái)困難。因此選擇HAc-NaAc(pH=4.76)緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)。

2.5HAc-NaAc緩沖液用量的選擇

向5份等量葉酸工作液中加入不同量濃度為0.2mol/mL的HAc-NaAc(pH=4.76)緩沖液，經(jīng)過(guò)相同氧化后在同一條件下測(cè)定，同時(shí)做空白。結(jié)果如表3。

表3　HAc-NaAc緩沖液用量對(duì)葉酸氧化產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的影響

可以看出，隨著緩沖液用量的增加熒光強(qiáng)度逐漸降低，加入1mL的緩沖液即可獲得較高的熒光強(qiáng)度。但考慮到樣品測(cè)定的需要，所以選擇加入3mL的緩沖液。

2.6H2SO4用量的選擇

分別測(cè)定在0.5、1.0、2.0、3.0mL H2SO4體系中葉酸被KMnO4氧化后的熒光強(qiáng)度，同時(shí)對(duì)應(yīng)做空白，結(jié)果如表4。

表4　H2SO4 用量對(duì)葉酸氧化產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的影響

從表4可以看出，加入1.0mL H2SO4就可以將葉酸氧化物的熒光破壞，考慮到測(cè)定需要，選擇加入2.0mL H2SO4破壞氧化物的熒光，得到樣品中基質(zhì)的熒光強(qiáng)度。

2.7精密度的測(cè)定

2.7.1方法精密度按1.2步驟平行測(cè)定6份濃度為60μg/L的葉酸氧化物的熒光強(qiáng)度，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.49%。

2.7.2樣品精密度取不同樣品提取液氧化，按1.2步驟測(cè)定熒光強(qiáng)度，測(cè)定結(jié)果如表5，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.65%～9.95%之間。

表5　樣品精密度試驗(yàn)(n=6)

2.8加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別于提取前向樣品中加入3個(gè)濃度的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定結(jié)果如表6，加標(biāo)回收率在86.0%～107.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.52%～8.73%之間。

表6　加標(biāo)回收率試驗(yàn)(n=6)

3結(jié)論

葉酸在pH=4.76的HAc-NaAc緩沖液中其氧化產(chǎn)物有較強(qiáng)的熒光，利用這種方法對(duì)彌猴桃、蘋果、梨、菠菜中葉酸含量進(jìn)行測(cè)定，提取過(guò)程簡(jiǎn)單、結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度均較好，可用于蔬菜水果中葉酸的定量測(cè)定?！?/p>

參考文獻(xiàn)

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(責(zé)任編輯李燕妮)

Determination of Folic Acid in Fruits and Vegetables by Fluorescence Method

WANG Meng，ZHANG Jia-ling

(DepartmentofSanitaryInspection，SchoolofPublicHealth，ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China)

Abstract：ObjectiveA quantitative method was developed for the analysis of folic acid in fruits and vegetables.MethodAfter being extracted by NaOH solution，the supernatant was oxidated by KMnO4 in 0.2mol/L HAc-NaAc(pH=4.76)，and the blank was in 1mol/L H2SO(4 ).The detection wavelengths of excitation and emission for the oxid were 280nm and 445nm respectively.ResultThe linear regression equation was ΔIF=778.24C+1.1 covering the range from 6.0～90μg/L with a correlation coefficient of 0.999 8.The method precision was 1.49%.The recoveries of spiked samples were between 86.0%～107.5% with RSD(n=6)ranging from 2.52% to 8.73%.ConclusionThis method was simple，sensitive and precise，which could be used in the quantitative detection of folic acid in fruits and vegetables.

Keywords：folic acid；fluorescence method；fruit and vegetable

通訊作者：張加玲(1961—)，女，碩士，碩士生導(dǎo)師，教授，從事衛(wèi)生檢驗(yàn)教學(xué)科研工作。

作者簡(jiǎn)介：王夢(mèng)(1989—)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品衛(wèi)生檢驗(yàn)。