王金淼,姜　濤,戚　峰,劉　彤，王鵬志（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普通外科，天津　300052）

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抑制microRNA-21表達(dá)降低HCT-116細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的實(shí)驗(yàn)研究

王金淼,姜濤,戚峰,劉彤，王鵬志
（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普通外科，天津300052）

摘要目的：探討抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116 microRNA-21表達(dá)降低結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力作用機(jī)制。方法:應(yīng)用表達(dá)反義microRNA-21的質(zhì)粒miRZip21轉(zhuǎn)染HCT-116細(xì)胞，檢測(cè)microRNA-21的變化，TargetScan和PicTar等工具篩選與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因，實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后靶基因mRNA的變化，Western blot檢測(cè)靶基因蛋白表達(dá)變化，平皿劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察抑制microRNA-21與否HCT-116細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力。結(jié)果:篩選出4種與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的microRNA-21靶基因：TIMP-3，RECK，BMPRⅡ和PCDH17；miRZip21質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT-116后，micro-RNA 21表達(dá)水平下降約40%，靶基因TIMP-3和RECK的mRNA及靶蛋白表達(dá)上升明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；平皿劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制microRNA-21后，HCT-116細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。結(jié)論:抑制microRNA-21的表達(dá)能夠減弱HCT-116細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

關(guān)鍵詞結(jié)腸癌；侵襲；轉(zhuǎn)移；microRNA-21；質(zhì)粒

Experimental research on reducing invasion and metastasis ability of HCT-116 by inhibiting microRNA-21 expression

WANG Jin-miao,JIANG Tao，QI Feng，LIU Tong，WANG Peng-zhi
（Department of General Surgery，General Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China）

Abstract Objective:To explore the effect on invasion and metastasis of HCT-116 colon cancer cell by downregulating the microRNA-21 expression.Methods:After plasmid miRZip21,miRZipTManti-microRNA-21expression lentivector ,was used to transfect HCT-116,the expression of microRNA-21 was assessed.The microRNA-21 target genes associated with invasion and metastasis were predicted by TargetScan and PicTar.The mRNA and protein of taget genes were detected by qRT-PCR and Western blot respectively.The ability of migration and invasion of HCT-116 after transfection were detected by the Scratch assay and Transwell assay.Results:TIMP-3,RECK,BMPRⅡand PCDH17 were the gene targets associated with invasion and metastasis;After the cells were transfected with plasmid miRZip21，the microRNA-21 level descended to about 60%，the mRNA and protein level of TIMP-3 and RECK increased significantly(P <0.05);Significant reduction of invasion and migration were observed in anti -microRNA -21 -transfected HCT -116(P <0.05).Conclusion:Inhabiting the microRNA-21 expression can lessen the invasive and metastatic ability of HCT-116 cells.

Key words colonic cancer;invasion;metastasis;microRNA-21;plasmid

近年來(lái)隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌是一個(gè)多步驟、多階段、多基因參與的遺傳性疾病，這些基因參與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。microRNA是近年來(lái)分子生物學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，是一類新發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA[1]，成熟的microRNA能夠識(shí)別特定的目標(biāo)mRNA,對(duì)靶mRNA進(jìn)行降解或抑制翻譯來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)過(guò)程[2]。microRNA-21在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞均出現(xiàn)異常表達(dá)，參與調(diào)控多種抑癌基因，提示microRNA-21作為一個(gè)致癌microRNA，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[3-4]。而當(dāng)前對(duì)結(jié)腸癌microRNA-21的研究較少，其對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制尚不清楚，因此通過(guò)調(diào)節(jié)microRNA-21的水平，探討其在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的機(jī)制，有可能深入了解結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為結(jié)腸癌的診斷、治療及預(yù)后提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象和主要試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料miRZip21（Catalog#MZIP21-AA-1）（美國(guó)SBI公司）；CS-CDF-CG-PRE（Leti3）（本實(shí)驗(yàn)室保存）；感受態(tài)細(xì)胞DH5α（Catalog#CB101）（天根生化科技（北京）有限公司）；人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)）用含有10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37℃、50%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.1.2主要試劑高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；限制性內(nèi)切酶：EcoRⅠ（Catalog#R0101S），BamHⅠ（Catalog#R0136S），XhoI（Catalog#R0146S），AgeI（Catalog#R0552S）（NEB，美國(guó)）；Gene Poter3000試劑盒（Invitrogen Corporation，美國(guó)）；2×Taq PCR MaserMix和無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；TIMP-3、BMPRⅡ、PCDH17多克隆抗體及RECK單克隆抗體（SantaCurz，美國(guó)）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體和辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；Go TaqqPCR Master Mix（Promega，美國(guó)）；免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法試劑盒（武漢博士德生物公司）。

1.2研究方法

1.2.1質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)染將2 μL質(zhì)粒DNA加入到裝有DH5α感受態(tài)細(xì)胞的EP管混勻，冰浴30min，預(yù)加熱至42℃，90 s，冰浴2 min，加入600 μL LB培養(yǎng)液，37℃，185 r/min溫育90 min，轉(zhuǎn)移至含抗生素LB板，37℃培養(yǎng)，取質(zhì)粒菌落接種于LB AMP+液體培養(yǎng)基3 mL，37℃，185 r/min，培養(yǎng)14 h，按說(shuō)明書(shū)使用高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒進(jìn)行目的質(zhì)粒提取，質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證大量提取目的質(zhì)粒，置于-20℃凍存。使用GenePORTER 3000試劑盒轉(zhuǎn)染高度表達(dá)microRNA-21的HCT-116細(xì)胞。細(xì)胞分為3組：實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染miRZip21組）、對(duì)照組（轉(zhuǎn)染Leti3組）和空白對(duì)照組，各組細(xì)胞鋪入6孔板每組轉(zhuǎn)染3孔，質(zhì)粒miRZip21組及Leti3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP（綠色熒光免疫標(biāo)記）表達(dá)程度,流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 HCT-116細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后microRNA-21表達(dá)水平取液氮下腫瘤細(xì)胞250 mg，加Trizol液充分研磨，加酚仿室溫靜置、離心，加75%乙醇反復(fù)洗滌沉淀，離心取上清液。紫外吸收測(cè)定法檢測(cè)RNA濃度和純度符合要求，后用甲醛變形瓊脂凝膠電泳法檢測(cè)總RNA完整性，采用寡聚3′端引物Oligo （dT）15和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，micro RNA-21引物序列，上游：5′-CGGGATCCTGG GGTTCGATCTTAACAGGC-3′，下游：5′-CGGAATTC CCACAATGCAGCTTAGTTTTCC-3′，原始數(shù)據(jù)（Ct值）采用2-ΔΔCt法[5]計(jì)算microRNA-21的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 RT-PCR及Western blot檢測(cè)靶基因表達(dá)水平運(yùn)用TargetScan和PicTar等工具篩選出4種與轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的microRNA-21靶基因：基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子3（TIMP-3）、伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白（RECK）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白II型受體（BMPRII）和原鈣粘蛋白17 （PCDH17），使用商品化Trizol分別提取質(zhì)粒miRZip21組和未處理組HCT-116細(xì)胞總RNA，利用紫外吸收測(cè)定法檢測(cè)RNA濃度和純度，后用甲醛變形瓊脂凝膠電泳法檢測(cè)總RNA完整性，采用寡聚3′端引物Oligo（dT）15和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，microRNA-21靶基因引物序列，TIMP-3,上游：5′-CAGTGCTCTGCTCTGTCC-3′，下游：5′-CCCCTACTTTCCATTTTG-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度352 bp）；BMPR-II，上游：5′-GAAGGTGAAGGTCGG AGTC-3′,下游：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度225 bp）；RECK，上游：5′-AGTGTGTGTGCTGCCTAC-3′，下游：5′-TTCCAGAA CTGTTATTGGC-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度264bp）；PCDH17，上游5′-ATTCCTTCATTTGGTTAC-3′，下游：5′-TTG CTGTTTCTACACTGG-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度349 bp）。GAPDH（內(nèi)參基因）上游：5′-GAAGGTGAAGGTCGG AGTC-3′，下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，采用蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)靶基因蛋白表達(dá)水平。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)用marker筆在6孔板背后均勻劃?rùn)M線，間距大約2～3 cm，橫穿過(guò)板孔，每孔至少穿過(guò)2條，在相應(yīng)板孔內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，用100 μL槍頭垂直于背后的橫線劃痕，劃痕寬度約3 mm，37℃PBS清洗細(xì)胞3次，更換無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于0、24、48、72、96 h鏡下測(cè)量劃痕寬度，比較各組間劃痕愈合的差異。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干，于每Transwell小室中加入50 μL含10 g/L的BSA無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃，30 min，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌2遍，用10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至5×105/mL，在Transwell下室內(nèi)加入10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基600 μL，上室內(nèi)加入含腫瘤細(xì)胞的無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基懸浮液200 μL，上室內(nèi)細(xì)胞數(shù)為1×105，置于5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)48 h，將Transwell置于蘇木素染色液中3 min，清水浸洗3遍，濕棉簽擦去微孔膜上層的基質(zhì)膠，倒置顯微鏡200倍視野下計(jì)數(shù)移至微孔膜下層每視野的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)4個(gè)高倍視野。

2　結(jié)果

2.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果miRZip21和Leti3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT-116細(xì)胞48 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)，結(jié)果均發(fā)出綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染成功。流式細(xì)胞儀檢測(cè)miRZip21質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率為17.57%，本實(shí)驗(yàn)室保存空白質(zhì)粒Leti3為19.65%（圖1），兩者之間無(wú)明顯差異，說(shuō)明質(zhì)粒本身具有良好轉(zhuǎn)染性。

圖1　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率Fig 1 Transfection efficacy of plasmid

2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HCT-116細(xì)胞microRNA-21表達(dá)水平轉(zhuǎn)染48 h后，miRZip21組與Leti3組、空白組比較，micoRNA-21表達(dá)降低約40%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），Leti3組與空白組無(wú)明顯差異（P>0.05），結(jié)果顯示體外轉(zhuǎn)染質(zhì)粒miRZip21可以一定程度抑制microRNA-21表達(dá)（表1）。

表1　microRNA-21在各組細(xì)胞間的表達(dá)水平(±s)Tab 1 The expression level of microRNA-21 in each group(±s)

表1　microRNA-21在各組細(xì)胞間的表達(dá)水平(±s)Tab 1 The expression level of microRNA-21 in each group(±s)

分組　　△Ct值　2-△Ct　　△△Ct　 2－△△Ct　 F　 P miRZip21組　-6.783±0.047 110.253±3.411　 0.669　 0.629 Leti3組　-7.360±0.066 164.390±7.429　 0.060　 0.959 16.934 0.003未處理組　-7.420±0.191 172.273±23.216 0　 1

2.3 microRNA-21靶基因mRNA和蛋白表達(dá)水平質(zhì)粒miRZip21轉(zhuǎn)染后TIMP-3的mRNA和蛋白表達(dá)分別是轉(zhuǎn)染前的2.3倍和3.5倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；RECK的mRNA和蛋白表達(dá)分別上調(diào)2.6倍和1.9倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；BMPRII的mRNA和蛋白表達(dá)差異不顯著（P >0.05）；PCDH17的mRNA和蛋白表達(dá)差異不顯著（P>0.05），表明microRNA-21對(duì)靶基因存在mRNA和蛋白兩個(gè)層面影響（圖2）。

圖2　靶基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平Fig 2 The expression levels of mRNA and protein of target genes

2.4劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：24 h后可見(jiàn)細(xì)胞向劃痕中間遷移，96 h后可見(jiàn)未處理細(xì)胞將劃痕鋪滿，而轉(zhuǎn)染miRZip21質(zhì)粒的細(xì)胞劃痕部位仍有一定間隙。因此轉(zhuǎn)染miRZip21質(zhì)粒的細(xì)胞雖仍有遷移性，但與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比遷移能力減弱。

圖3　各組HCT-116細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力Fig 3 The metastasis ability of HCT-116 in each group

2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)染質(zhì)粒miRZip21組與未轉(zhuǎn)染組相比，侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明抑制microRNA-21后，HCT-116細(xì)胞侵襲能力明顯減弱（表2）。

表2　各組HCT-116細(xì)胞侵襲結(jié)果Tab 2 The invasion result of HCT-116 cell in each group

3　討論

目前認(rèn)為microRNA的前體和成熟體在很多物種之間具有高度保守性，表明microRNA-21在基因表達(dá)調(diào)控上發(fā)揮著重要作用[3]。microRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮作用根據(jù)其作用模式不同可分為3種形式，一種為microRNA與靶基因mRNA不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制mRNA的翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性，以線蟲(chóng)lin-4為代表[6]。在抑制microRNA翻譯中，microRNA主要作用位點(diǎn)為靶mRNA的3′UTR區(qū)（非編碼區(qū)），通過(guò)改變靶mRNA上核糖體密度或特異性降解新合成的多肽來(lái)達(dá)到抑制mRNA翻譯的目的。第2種以擬南芥microRNA-171為代表[7]，作用時(shí)與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式和功能與siRNA相似，最后切割靶mRNA，從而使mRNA的表達(dá)水平降低。第3種以let-7為代表[8]，它具有以上兩種作用模式，如果與靶基因完全互補(bǔ)結(jié)合，直接切割mRNA；當(dāng)與靶基因不完全結(jié)合時(shí)，其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。microRNA-21對(duì)靶基因即屬于第3種形式，對(duì)mRNA和蛋白層面發(fā)揮著雙重調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)HCT-116細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染抑制microRNA-21后，發(fā)現(xiàn)TIMP-3和RECK基因的mRNA和蛋白都有不同程度的表達(dá)上調(diào)，證實(shí)microRNA-21確實(shí)存在兩個(gè)層面的調(diào)節(jié)，可能同時(shí)存在對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的干擾和降解作用。而Fujita等[9]預(yù)測(cè)NFIB為microRNA -21的靶基因，對(duì)microRNA-21進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)NFIB蛋白顯著提高，而NFIB的mRNA表達(dá)不變，提示microRNA-21對(duì)其作用發(fā)生在mRNA的翻譯階段，而不是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄階段。Asangani[10]對(duì)10種結(jié)腸癌細(xì)胞microRNA-21與PCDD4的mRNA及蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)microRNA-21與PDCD4蛋白水平存在顯著的負(fù)相關(guān)，而與PDCD4的mRNA無(wú)顯著關(guān)系，表明對(duì)靶基因的調(diào)控作用于蛋白水平。因此，microRNA-21對(duì)靶基因的調(diào)控模式存在差異，但其對(duì)靶基因調(diào)控差異的機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

結(jié)直腸腫瘤中microRNA-21的表達(dá)上調(diào)，多與臨床病理分期差、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)[11]，我們前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)microRNA-21在結(jié)腸癌患者中與臨床病理分期差有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)從預(yù)測(cè)的靶基因中選擇與抑制腫瘤遷移和侵襲有關(guān)的基因：TIMP-3、RECK、BMPRII和PCDH17進(jìn)行研究。研究顯示消化道腫瘤患者組織中這4種轉(zhuǎn)移抑制蛋白出現(xiàn)表達(dá)異常[12-14]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制結(jié)腸癌細(xì)胞microRNA-21的表達(dá)后，TIMP-3和RECK升高明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而B(niǎo)MPRII和PCDH17升高的幅度并不顯著。

劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell顯示抑制microRNA-21表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的遷移性和侵襲性明顯抑制，這意味著腫瘤細(xì)胞降解基質(zhì)的能力下降，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子的功能得到增強(qiáng)，證實(shí)microRNA-21在結(jié)腸腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，也表明針對(duì)microRNA-21的基因治療存在可行性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成果取得為進(jìn)一步行體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)腫瘤的體內(nèi)特征如腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、血管形成等諸方面進(jìn)行研究奠定基礎(chǔ)。

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（2015-06-07收稿）

作者簡(jiǎn)介王金淼（1987-），男，碩士在讀，研究方向：普通外科；通信作者：戚峰，E- mail：qf@medmail.com.cn。

基金項(xiàng)目天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（08JCYBJC08100）

文章編號(hào)1006－8147（2016）01-0013-04

中圖分類號(hào)R735.3+5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A