于孟飛，楊　瀟，沈金花

(中南民族大學 生命科學學院，醫(yī)學生物研究所&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，武漢430074)

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MTMR14基因缺失促進小鼠成肌細胞增殖和分化

于孟飛，楊瀟，沈金花*

(中南民族大學 生命科學學院，醫(yī)學生物研究所&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，武漢430074)

摘要為研究磷酸肌醇磷酸酶肌管相關(guān)蛋白14(MTMR14)在骨骼肌發(fā)生中的作用，通過組織切片和細胞培養(yǎng)技術(shù)研究了MTMR14敲除對骨骼肌的組織結(jié)構(gòu)、成肌細胞分化和增殖的影響.結(jié)果表明：MTMR14敲除小鼠的腓腸肌和比目魚肌的結(jié)構(gòu)較同窩野生型小鼠產(chǎn)生了明顯變化，MTMR14敲除小鼠的成肌細胞的分化和增殖成肌小管過程較野生型顯著加快. MTMR14基因敲除后小鼠肌管細胞中平均細胞核數(shù)顯著增加.故MTMR14基因缺失/敲除導致骨骼肌組織結(jié)構(gòu)異常，干擾了骨骼肌肌肉發(fā)生過程中的成肌細胞的增殖和分化.

關(guān)鍵詞成肌細胞；肌管相關(guān)蛋白14；增殖；分化；骨骼肌發(fā)生

Deficiency ofMTMR14 Promoted the Proliferation and Differentiation of Mouse Myoblasts

YuMengfei,YangXiao,ShenJinhua*

(Institute for Medical Biology & Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plant Germplasm in Wuling Area of China, College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan, 430074, China)

AbstractTo investigate the role of myotubularin related protein 14 (MTMR14), a novel phosphoinositide phosphatase, in regulating myogenesis, the effects ofMTMR14 depletion on the structure, myoblast differentiation and proliferation were evaluated using tissue biopsy and cell culture techniques. The results demonstrated that the structures of both gastrocnemius and soleus muscles inMTMR14-depleted mice were different from their wild type (WT) littermates. Compared to the WT control, the myoblast ofMTMR14-depleted mice showed accelerated proliferation and differentiation into myotubes in culture. The depletion ofMTMR14 also induced an increase of the number of nuclei in myotubes. In conclusion, the deficiency/depletion ofMTMR14 led to the abnormal structure of skeletal muscles, and disrupted the proliferation and differentiation of myoblasts during skeletal myogenesis.

Keywordsmyoblast; MTMR14; differentiation; proliferation; skeletal myogenesis

骨骼肌在許多生理活動中發(fā)揮重要作用，如運動的發(fā)起、能量動態(tài)平衡和全身的代謝.機體衰老和疾病也與骨骼肌組織結(jié)構(gòu)和/或功能異常相關(guān)[1, 2].骨骼肌肌肉的正確形成(也稱肌肉發(fā)生)是一個受到精細調(diào)控的復雜過程，如成肌細胞周期的退出、肌肉細胞特異性蛋白的表達、細胞變形和融合成肌管細胞等多個環(huán)節(jié)[3, 4].肌管相關(guān)蛋白14(MTMR14)是一種肌肉特異性肌醇磷酸酶，MTMR14基因突變在多個物種中會引起肌肉疾病，如人、小鼠和斑馬魚等[5].本課題前期發(fā)現(xiàn)MTMR14基因敲除小鼠骨骼肌更易疲勞[6].最近研究發(fā)現(xiàn)MTMR14表達量隨年齡增長而下降，MTMR14蛋白的流失通過影響Ca2+平衡而加速骨骼肌的衰老進程[7]. 所以MTMR14在骨骼肌肌肉形成過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用.

多個單核成肌細胞融合成為多核的肌管細胞是骨骼肌肌肉發(fā)生過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8].成肌細胞的融合不僅發(fā)生在動物機體發(fā)育過程中，也發(fā)生在成年個體中.因為肌管細胞中細胞核的積累對骨骼肌的生長和再生過程是一個必要條件.延時成像和電鏡觀察體外培養(yǎng)的成肌細胞發(fā)現(xiàn)：成肌細胞的融合是一個高度有序的連續(xù)過程，它涉及細胞之間的相互識別、粘附、對齊、細胞膜融合和形態(tài)變化等一系列細胞特異性事件[9]. 成肌細胞早期分化受到干擾或增強均能影響骨骼肌肌管細胞的形成和生長.故肌管細胞形成或生長發(fā)生改變是由于成肌細胞早期分化或融合過程改變所致.

本課題最新研究發(fā)現(xiàn)：小鼠MTMR14基因缺失能引起胚胎成纖維細胞自噬和增殖增強[10]. 故MTMR14基因的缺失或敲除對成肌細胞的增殖/融合和/或它們早期分化過程的影響成為本研究的關(guān)注焦點.本研究分別建立了源于野生型和MTMR14基因敲除小鼠的胚胎成肌細胞系，并分別比較了這兩株細胞系的增殖速度、融合比率和單個肌管細胞中細胞核的平均數(shù)，結(jié)果表明：MTMR14缺失小鼠來源的胚胎成肌細胞較野生型生長速度更快，MTMR14基因缺失還加速了成肌細胞的分化.

1材料與方法

1.1材料和儀器

MTMR14雜合小鼠由美國凱斯西儲大學瞿成奎教授提供.MTMR14基因敲除小鼠的繁殖、飼喂和基因型鑒定均參照文獻[6].所有動物分籠飼養(yǎng)于控溫、控濕的動物房中，采用12 h間隔性光照制度(8:00 AM～8:00 PM光照)，自由采食、飲水，動物實驗均符合中南民族大學動物福利和使用委員會的相關(guān)要求和規(guī)定.蘇木精-伊紅(北京索萊寶)，多聚甲醛、Abam(Sigma,美國)，Han′s F10培養(yǎng)液(Biowest,法國)，DMEM、二抗、胰酶、胎牛血清(Gibco,美國)，eMyHC抗體(DSHB,美國)，成纖維生長因子(Peprotech,美國).

切片機(RM2235,德國Leica)，顯微鏡(LSM710,德國蔡氏)，CO2培養(yǎng)箱(INC108,德國Memmert)，生物安全柜(HR40-IIA2,中國海爾).

1.2病理分析

野生型和MTMR14敲除小鼠的腓腸肌和比目魚肌分別以橫向和縱向作10 μm切片，并用蘇木精-伊紅染色[11].染色后的切片經(jīng)封片后，用數(shù)碼相機拍照并用NIS-Elements Ar 3.0軟件進行分析.通過分析骨骼肌中部區(qū)域的3個不同部位面積來確定骨骼肌橫截面積(CSAs)，并以150根肌纖維的CSAs平均值來代表腓腸肌/比目魚肌的數(shù)值.

1.3小鼠胚胎成肌細胞的分離和培養(yǎng)

采用酶消化法培養(yǎng)小鼠胚胎成肌細胞[12].將發(fā)育至5～7 d的小鼠胚胎的四肢骨骼肌用剪刀分離，在37℃含有1.5 IU /mL膠原蛋白酶、2.4 IU /mL中性蛋白酶和2.5 mM CaCl2的酶消化液中消化30 min，1000 r/min離心5 min后，用含有20%胎牛血清，2.5 ng/mL基礎(chǔ)成纖維生長因子和1% ABAM的Han′s F-10培養(yǎng)液重懸細胞，再放入37.5℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.4成肌細胞增殖

成肌細胞在體外培養(yǎng)24，48 h后，采用MTT法進行活細胞計數(shù)[13]. 先將成肌細胞以3×104/mL接種到96孔板中，每孔100 μL，在完全培養(yǎng)基下培養(yǎng)5 d. 24 , 48 h后，用含有10 μL重組MTT的DMEM代替完全培養(yǎng)基.培養(yǎng)2 h后，用含有100 μL MTT溶解液的DMEM換液.在570 nm波長下檢測細胞吸光度.用連接24，48 h細胞吸光度直線的斜率來表示成肌細胞增殖率.為確保成肌細胞的純度，野生型和MTMR14敲除小鼠來源的成肌細胞MTMR14基因mRNA表達經(jīng)PCR檢測合格后，再進行MTT檢測.

1.5免疫熒光

胚胎肌球蛋白重鏈蛋白基因簇(eMyHC+)是人和小鼠非常保守的骨骼肌發(fā)育分化的標記分子[14].表達通過改良的免疫熒光法進行eMyHC+的分化的成肌細胞計數(shù)[15].培養(yǎng)的成肌細胞經(jīng)含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液室溫固定后，用含有0.25% Triton X-100室溫通透細胞膜10 min.再用含有1%牛血清白蛋白和0.1% Tween-20的磷酸緩沖液進行封閉再用1︰200抗eMyHC抗體在4℃下過夜雜交，用1︰1000的抗兔的FITC標記的二抗37℃雜交2 h，用DAPI染細胞核，用激光共聚焦顯微鏡檢測相應(yīng)的熒光強度.

1.6成肌細胞分化

為了誘導成肌細胞分化，在細胞匯合度達到80%時，細胞培養(yǎng)液換成含2%馬血清和1% ABAM的DMEM.為了使肌管和細胞核可視，先用4%多聚甲醛固定正在分化的成肌細胞10 min，再在室溫條件下用吉姆薩染色.由NIH ImageJ軟件分析統(tǒng)計細胞核總數(shù)和肌管內(nèi)細胞核總數(shù).分化指數(shù)=采用胚胎肌球蛋白重鏈蛋白基因陽性細胞數(shù)/全部成肌細胞核數(shù)量×100%.當成肌細胞內(nèi)具有2個以上的細胞核時，則為肌管細胞.融合指數(shù)=肌管細胞中細胞核數(shù)/全部成肌細胞核數(shù).每個肌管細胞平均細胞核數(shù)=所有肌管細胞核數(shù)/肌管細胞數(shù).

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2結(jié)果

2.1MTMR14基因缺失導致腓腸肌細胞核數(shù)增加

前期研究發(fā)現(xiàn)MTMR14缺失能破壞肌肉細胞內(nèi)Ca2+動態(tài)平衡引起重癥肌無力.為檢驗MTMR14基因缺失能否引起骨骼肌結(jié)構(gòu)改變，分別對野生型和MTMR14敲除小鼠腓腸肌進行縱橫切片.如圖1所示，MTMR14敲除小鼠腓腸肌纖維橫截面積同野生型小鼠之間無顯著差異.但MTMR14敲除小鼠腓腸肌細胞核數(shù)較野生型小鼠顯著性增加(p<0.05)，說明MTMR14基因在骨骼肌形成中發(fā)揮調(diào)控作用.

WT:野生型; KO:敲除型;a) 野生型橫切; b) 敲除型橫切; c) 野生型縱切;d) 敲除型縱切;e) 腓腸肌橫切截面積(n=5); f) 每個腓腸肌肌管細胞平均細胞核數(shù)(n=10);*p< 0.05圖1　MTMR14敲除對小鼠腓腸肌的影響Fig.1　Effects of MTMR14 deletion on mouse extensor digitorum longus muscles

2.2MTMR14基因缺失導致比目魚肌細胞核數(shù)增加

為了進一步確認MTMR14基因在骨骼肌形成過程中的調(diào)控作用，檢測了MTMR14基因敲除對另一種骨骼肌，比目魚肌的影響.如圖2中比目魚肌橫切所示，MTMR14缺失小鼠比目魚肌較同窩野生型小鼠之間顯著增加(p<0.05).同時，MTMR14基因缺失小鼠比目魚肌細胞核數(shù)較野生型小鼠也顯著增加(p<0.05).這些結(jié)果同上面提到的腓腸肌中的結(jié)果相類似.這些結(jié)果進一步證明MTMR14在肌肉發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用.

WT: 野生型; KO: 敲除型a) 野生型橫切; b) 敲除型橫切; c) 野生型縱切; d) 敲除型縱切;e) 腓腸肌橫切截面積(n=5); f) 每個腓腸肌肌管細胞平均細胞核數(shù)(n=10);*p< 0.05 圖2　MTMR14敲除對小鼠比目魚肌的影響Fig.2　Effects of MTMR14 deletion on mouse soleus muscles

2.3MTMR14基因缺失促進成肌細胞增殖

為進一步闡明MTMR14基因調(diào)控肌肉的機制，采用MTT法檢測了MTMR14基因?qū)Τ杉〖毎鲋车挠绊?，成肌細胞分別來源于野生型和MTMR14敲除小鼠胎鼠的骨骼肌(腓腸肌).如圖3a所示，在MTMR14敲除小鼠中，MTMR14基因mRNA表達水平顯著下降(p<0.05)，證明MTMR14基因被成功敲除.如圖3b所示，成肌細胞體外培養(yǎng)24, 48 h后，MTMR14基因缺失均顯著加快了成肌細胞的增殖速度.說明MTMR14在骨骼肌增殖中發(fā)揮重要調(diào)控作用.

WT:野生型; KO: 敲除型; n=4, *p< 0.05 圖3　MTMR14敲除對小鼠成肌細胞中MTMR14 mRNA表達(a)和成肌細胞增殖(b)的影響Fig.3　Effects of MTMR14 deficiency on the expression of MTMR14 mRNA(a) and proliferation of mouse myoblasts (b)

2.4MTMR14基因缺失加快成肌細胞分化并破壞成肌細胞融合

由于成肌細胞能分化成肌管細胞，為深入探究MTMR14基因在肌肉發(fā)生過程中的作用，檢測了MTMR14基因缺失對成肌細胞分化成肌管細胞的影響.如圖4a所示，體外培養(yǎng)的成肌細胞被誘導分化成肌管細胞，肌管細胞在其胞質(zhì)中表達綠色eMyHC蛋白.成肌細胞經(jīng)誘導培養(yǎng)24 h后，MTMR14基因敲除組中分化的成肌細胞所占總細胞數(shù)的百分比顯著高于野生型小鼠組(圖4b,p<0.01).但成肌細胞經(jīng)誘導培養(yǎng)48 h后，MTMR14基因敲除組和野生型組之間分化的肌管細胞占總細胞數(shù)百分比之間無顯著差異(p> 0.05).說明MTMR14基因缺失能加快成肌細胞分化成為肌管細胞.

成肌細胞融合是骨骼肌形成過程中的一個重要過程，MTMR14基因敲除對成肌細胞融合過程的影響如圖4c所示.成肌細胞經(jīng)誘導分化24 h后，MTMR14缺失組中成肌細胞的融合率顯著高于野生型組(p<0.01).但成肌細胞經(jīng)誘導分化48 h后，敲除組與對照組之間的成肌細胞融合率無顯著差異(p>0.05).與此相似，MTMR14基因缺失亦導致肌管細胞中細胞核平均數(shù)顯著高于野生型(圖4d，p<0.05)，說明MTMR14基因缺失能引起肌管細胞中細胞核平均數(shù)異常和融合過程加快.

WT: 野生型; KO: 敲除型; n = 4, *p< 0.05, **p< 0.01a) MTMR14缺失對小鼠成肌細胞分化的影響; b) MTMR14缺失對體外培養(yǎng)的小鼠成肌細胞分化的影響;c) MTMR14缺失對體外培養(yǎng)的小鼠成肌細胞融合的影響; d) MTMR14缺失對小鼠單個肌管細胞中細胞核數(shù)量的影響.圖4　MTMR14缺失對小鼠成肌細胞分化成肌管細胞的影響Fig.4　Effects of MTMR14 deficiency on the differentiation of mouse myoblasts into myotubes

3討論

本研究結(jié)果證實：MTMR14基因缺失不僅能引起骨骼肌(腓腸肌和比目魚肌)結(jié)構(gòu)異常，還能促進成肌細胞的增殖速度.同時，MTMR14基因缺失能加速成肌細胞向肌管細胞分化和肌管細胞平均細胞核數(shù)增加.這些結(jié)果表明MTMR14基因?qū)趋兰⌒纬删哂兄匾{(diào)控作用.

MTMR14基因缺失可通過破壞骨骼肌細胞內(nèi)Ca2+平衡導致肌肉耐疲勞度下降和恢復所需時間延長[6]. 為闡明其機制，我們首先采用組織切片對MTMR14敲除小鼠骨骼肌(腓腸肌和比目魚肌)進行了分析.結(jié)果顯示MTMR14基因敲除對兩種骨骼肌的平均橫截面積均無影響.但MTMR14敲除小鼠肌管細胞平均細胞核數(shù)較野生型顯著增加.這些改變是導致MTMR14敲除小鼠易疲勞和肌肉耐力恢復慢的原因.提示MTMR14基因參與了骨骼肌的肌肉發(fā)生過程.

肌肉發(fā)生是一個受嚴格調(diào)控的復雜過程，它包含細胞周期的退出、生肌蛋白的表達、細胞粘附和融合成合胞體肌纖維等多個過程[16, 17].MTMR14敲除小鼠肌管形成和/或生長的改變是由成肌細胞早期的增殖和/或分化發(fā)生改變而引起的.MTMR14基因的缺失會加速成肌細胞的增殖速度，這些改變會導致成肌細胞增殖時間和/或成肌細胞融合成肌管細胞所需時間縮短，使成肌細胞提早退出細胞周期和未成熟肌管的形成.因此，加速的成肌細胞增殖、分化和縮短的融合成肌管等這三個事件解釋了MTMR14基因缺失小鼠骨骼肌力量下降、肌肉恢復事件延長和易疲勞性[6]，以及其對鍛煉引起的肌肉損傷更敏感的原因[7].

綜上，MTMR14在成肌細胞分化和融合過程中發(fā)揮重要作用.MTMR14基因的缺失或敲除會破壞骨骼肌細胞的正常形成過程，并最終導致骨骼肌結(jié)構(gòu)異常. 反之，結(jié)構(gòu)異常的骨骼肌會導致動物機體骨骼肌在功能水平上的異常和/或下降. 然而，MTMR14基因缺失引起骨骼肌組織結(jié)構(gòu)和功能異常的信號傳導機制仍不清楚，亟待深入研究.

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中圖分類號Q253; Q28

文獻標識碼A

文章編號1672-4321(2016)01-0034-05

基金項目國家自然科學基金面上資助項目(81170227); 湖北省自然科學基金重點資助項目(2012FFA028)

作者簡介于孟飛(1982-)，男，講師，博士，研究方向：心律不齊，E-mail:65556248@qq.com

收稿日期2015-09-25*通訊作者沈金花(1975-)，女，教授，博士，研究方向：肌肉發(fā)生和相關(guān)疾病的機制，E-mail：shenjinhua2013@163.com