范紅偉　白鳳樓　李清雪　郝國(guó)榮

050011　河北省石家莊市第四醫(yī)院婦一科

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·論著·

超聲聚焦治療對(duì)外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織中VEGR、Ang-Ⅱ及MMP-2表達(dá)的影響

范紅偉白鳳樓李清雪郝國(guó)榮

050011河北省石家莊市第四醫(yī)院婦一科

【摘要】目的探討超聲聚焦治療外陰營(yíng)養(yǎng)不良的機(jī)制。方法采用免疫組化SABC法研究20例外陰營(yíng)養(yǎng)不良患者超聲治療前治療后1、3個(gè)月外陰組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管緊張素-Ⅱ (Ang-Ⅱ)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)的表達(dá)。結(jié)果患者治療后1、3個(gè)月外陰白色病變組織中VEGF、Ang-Ⅱ和MMP-2陽(yáng)性率與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但治療后1、3個(gè)月比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論聚焦超聲治療可使外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織中VEGF、Ang-Ⅱ和MMP-2的表達(dá)升高，其機(jī)制可能是通過(guò)改變外陰營(yíng)養(yǎng)不良局部神經(jīng)微血管結(jié)構(gòu)和功能使外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織恢復(fù)正常。

【關(guān)鍵詞】超聲聚焦；外陰營(yíng)養(yǎng)不良；VEGR；Ang-Ⅱ；MMP-2

外陰營(yíng)養(yǎng)不良又稱(chēng)為外陰白色病變,以外陰組織顏色減退及外陰奇癢為主要臨床特征。外陰營(yíng)養(yǎng)不良疾病依據(jù)其病理類(lèi)型不同可分為:外陰硬化性苔蘚(LS)型、外陰鱗狀細(xì)胞增生(SH)型及外陰硬化性苔蘚合并外陰鱗狀細(xì)胞增生型三種類(lèi)型。外陰白色病變?cè)谂R床上，主要以外陰奇癢及灼痛、色素減退、皮膚黏膜萎縮變薄及粗糙增厚為其特征性表現(xiàn)[1]。此疾病晚期多數(shù)伴有外陰表面皮膚的萎縮、陰道口的狹窄、性交不適等癥狀，甚至癌變。截止目前，外陰白色病變的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全明了，研究證實(shí)，具可能與微血管障礙、膠原纖維生成障礙、神經(jīng)變性及病毒感染等諸多因素有密切關(guān)聯(lián)[2]。外陰營(yíng)養(yǎng)不良疾病，應(yīng)用普通的外用藥物效果欠佳，外陰聚焦超聲治療作為一種新興的治療手段，具有起效速度快、創(chuàng)面恢復(fù)快、外陰創(chuàng)傷小、有效、安全等諸多優(yōu)點(diǎn)，可以僅作用于治療區(qū)，并且不損傷治療區(qū)鄰近的皮膚組織。極少數(shù)患者發(fā)生皮膚的淺二度燒傷、水泡及潰瘍，但經(jīng)過(guò)抗炎治療后均達(dá)到痊愈，損傷皮膚沒(méi)有形成瘢痕。外陰聚焦超聲作為一種新興技術(shù)，在臨床工作中，對(duì)外陰營(yíng)養(yǎng)不良的治療效果已得到一定的證實(shí)，且取得了顯著成果，但其作用機(jī)制至今仍未完全明了。本研究采用免疫組織化學(xué)法，檢測(cè)經(jīng)過(guò)外陰聚焦超聲治療前后，外陰營(yíng)養(yǎng)不良疾病組織中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管緊張素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在外陰營(yíng)養(yǎng)不良疾病組織中表達(dá)的變化情況，用以探討外陰聚焦超聲治療外陰營(yíng)養(yǎng)不良的機(jī)制。

1資料與方法

1.1一般資料收集2008年3月至2014年3月在石家莊市第四醫(yī)院住院的外陰營(yíng)養(yǎng)不良患者，進(jìn)行外陰超聲聚焦治療后的20例患者，年齡22～59歲，平均年齡(44±10)歲。每例患者分別于治療前及治療后1、3個(gè)月，無(wú)瘙癢癥狀，經(jīng)過(guò)患者知情同意情況下，對(duì)其原病變部位各取材1次。

1.2主要試劑與方法試劑選取：免疫組化法成套免疫組組織化學(xué)試劑盒、鼠抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單克隆抗體-天津中平科技有限公司；鼠抗人血管緊張素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)免疫組化試劑盒-北京中山生物制品有限公司；鼠抗人MMP-2免疫組化試劑盒-北京中山生物制品有限公司。方法：采用SP法，免疫組化程序按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)，甲醛固定以后石蠟包埋切片，每種病理切片5張。

1.3結(jié)果判斷VEGF、Ang-Ⅱ和鼠抗人MMP-2陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃至深棕色顆粒。采用雙盲方法進(jìn)行，采用高倍顯微鏡(×400)隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野均計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞的視野計(jì)為陰性(-)，根據(jù)選取視野中陽(yáng)性細(xì)胞的百分率判斷分為：<5% (+)，5～15% (++)，>15% (+++)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。VEGF、Ang-Ⅱ和鼠抗人MMP-2在外陰白色病變中的表達(dá)采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1治療前后外陰白色病變組織中VEGF的表達(dá)情況VEGF表達(dá)于外陰的表皮及真皮的成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和包膜中。治療前外陰白色病變組織共20例，VEGF表達(dá)陽(yáng)性者1例，陽(yáng)性率5%；治療后1個(gè)月獲取標(biāo)本10例，VEGF表達(dá)陽(yáng)性者8例(+者4例，++者4例)，陽(yáng)性率80%，兩者陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后3個(gè)月獲取標(biāo)本10例，VEGF表達(dá)陽(yáng)性者9例(+者4例，++者5例)，陽(yáng)性率90%，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與治療后1個(gè)月比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　治療前后外陰白色病變組織中VEGF的表達(dá)情況　例

注：與治療前比較，*P<0.05

2.2治療前后外陰白色病變組織中Ang-Ⅱ的表達(dá)情況Ang-Ⅱ表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜和胞漿。治療前外陰白色病變組織共20例，Ang-Ⅱ表達(dá)陽(yáng)性者2例，陽(yáng)性率10%；治療后1個(gè)月獲取標(biāo)本10例，Ang-Ⅱ表達(dá)陽(yáng)性者9例(+者5例，++者4例)，陽(yáng)性率90%，兩者陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后3個(gè)月獲取標(biāo)本10例，Ang-Ⅱ表達(dá)陽(yáng)性者9例(+者4例，++者5例)，陽(yáng)性率90%，與治療前比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與治療后1個(gè)月比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3治療前后外陰白色病變組織中MMP-2的表達(dá)情況MMP-2表達(dá)于外陰組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和

表2　治療前后外陰白色病變組織中Ang-Ⅱ的表達(dá)情況　例

注：與治療前比較，*P<0.05

胞膜之上。治療前外陰白色病變組織共20例，鼠抗人MMP-2表達(dá)陽(yáng)性者1例，陽(yáng)性率5%；治療后1個(gè)月獲取標(biāo)本10例，鼠抗人MMP-2表達(dá)陽(yáng)性者9例(+者4例，++者5例)，陽(yáng)性率90%，兩者陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后3個(gè)月獲取標(biāo)本10例，鼠抗人MMP-2表達(dá)陽(yáng)性者9例(+者4例，++者5例)，陽(yáng)性率90%，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與治療后1個(gè)月比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3　治療前后外陰白色病變組織中MMP-2的表達(dá)情況　例

注：與治療前比較，*P<0.05

3討論

外陰白色病變是指外陰組織受到外部刺激、自身免疫因素、過(guò)敏、局部營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、代謝因素，慢性損傷、感染及遺傳因素導(dǎo)致的外陰皮膚、黏膜失去正常色澤、局部瘙癢或外陰及肛周皮膚萎縮變薄、出現(xiàn)灼熱疼痛等[3]。外因鱗狀上皮細(xì)胞增生型為表皮層角化過(guò)度和角化不全，棘細(xì)胞層過(guò)度增厚；外因硬化性苔蘚早期為真皮乳頭層水腫、血管擴(kuò)張，進(jìn)一步可發(fā)展為表皮層角化，毛囊角質(zhì)栓塞，基底細(xì)胞液化變性，黑色素細(xì)胞減少，極少可以發(fā)展為浸潤(rùn)癌。近年，外陰聚焦超聲治療廣泛應(yīng)用于臨床。外陰聚焦超聲具有可穿透生物組織，作用于組織內(nèi)部，焦點(diǎn)處可集中大部分能量，使焦點(diǎn)及周?chē)M織迅速升溫，最終使病變組織變性，促進(jìn)組織重建和微循環(huán)改善，同時(shí)其具有熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和生物效應(yīng)。相關(guān)病理研究發(fā)現(xiàn)，在治療初期病變部位可出現(xiàn)充血水腫、表皮保持完整，治療后外陰上皮組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，外銀白色病變患者經(jīng)外陰聚焦超聲治療后，患者臨床癥狀具有明顯改善，同時(shí)外陰外觀、組織結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)[5]。趙建武等[5]發(fā)現(xiàn)，聚焦超聲治療兔外陰皮膚，病理和組織學(xué)改變?nèi)缦拢和怅幈砥ず驼嫫映溲[，乳頭層輕度充血水腫；外陰水腫逐步消退、組織充血水腫消退，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；外陰組織恢復(fù)正常，可見(jiàn)新生毛細(xì)血管。進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，未見(jiàn)細(xì)胞不可逆損傷本研究結(jié)果表明：外陰白色病變組織中VEGF、Ang-Ⅱ和MMP-2，在經(jīng)過(guò)外陰聚焦超聲治療1個(gè)月及3個(gè)月后，表達(dá)較治療前明顯升高。聚焦超聲治療后外陰皮膚病理恢復(fù)正常。

VEGF是1989年在牛垂體濾泡星狀細(xì)胞培養(yǎng)物中，純化分離到的一種肝素結(jié)合因子[6]，已被認(rèn)為是現(xiàn)今作用最強(qiáng)、特異性最高的調(diào)控因子之一，VEGF主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體高親和力結(jié)合后，能夠作為內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、毛細(xì)血管袢形成；與此同時(shí)，可增加微血管的通透性，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞間質(zhì)產(chǎn)生，從而促進(jìn)體內(nèi)新生血管的生成[7]。許多研究都證實(shí)VEGF還具有保護(hù)神經(jīng)與營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的作用，并且能夠促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)及雪旺細(xì)胞的分裂[8]。本研究證實(shí)，VEGF在外陰超聲聚焦治療后的外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織中的表達(dá)較未治療的外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Ang-Ⅱ可以在細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[9]。Ang-Ⅱ促進(jìn)血管生成機(jī)制如下：當(dāng)Ang-Ⅱ與血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面相結(jié)合時(shí),Ang-Ⅱ與細(xì)胞表面的肌動(dòng)蛋白(actin)相結(jié)合,從而進(jìn)一步激發(fā)血漿纖溶酶原的活性,刺激細(xì)胞中相關(guān)的蛋白水解酶(cell associated proteolytic)活性,溶解細(xì)胞間基質(zhì),使內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白活化,進(jìn)而引導(dǎo)細(xì)胞的侵襲及遷移[10],另外,Ang-Ⅱ能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有絲分裂原的活性、使細(xì)胞發(fā)生增生、形成管腔結(jié)構(gòu)等一系列改變[11]。本研究證實(shí)，Ang-Ⅱ在外陰超聲聚焦治療后的外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織中的表達(dá)較未治療的外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

MMPs與腫瘤惡性細(xì)胞的遷移、侵襲相關(guān)的ECM降解過(guò)程有著不可分割的密切關(guān)聯(lián)[12]，MMPs是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，，其中明膠酶有兩種，明膠酶A(MMP-2)可以降解Ⅳ膠原、明膠、基底膜以及多種其他類(lèi)型的膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白，它的活性可以被金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)和巨球蛋白所抑制[13]。MMPs的活性調(diào)節(jié)組織生成過(guò)程中，扮演重要作用，其在加快血管內(nèi)皮細(xì)胞形成新生的血管，同時(shí)可以通過(guò)與整合素的相互活化增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附，組織重建、炎癥及在血管生成中起很強(qiáng)的促進(jìn)作用[14,15]。MMP-2有促進(jìn)血管生成和降解細(xì)胞外基質(zhì)中的成分等作用。本研究證實(shí)，MMP-2在外陰超聲聚焦治療后的外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織中的表達(dá)較未治療的外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，外陰聚焦超聲治療外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織后，可使內(nèi)源性VEGF、Ang-Ⅱ及MMP-2的表達(dá)較前明顯升高，從而使外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織恢復(fù)正常，經(jīng)本研究證實(shí)：外陰聚焦超聲治療外陰營(yíng)養(yǎng)不良組織后，使正常的神經(jīng)、血管的結(jié)構(gòu)及功能得以維持，使外陰組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。以上研究初步證實(shí)了，在外陰聚焦超聲治療外陰營(yíng)養(yǎng)不良疾病后，外陰組織存在大分子表達(dá)水平的變化，這些理論的最終證實(shí)，也使得外陰營(yíng)養(yǎng)不良疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步明確。

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(收稿日期：2015-09-08)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 711.72

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-7386(2016)06-0893-03

通訊作者：郝國(guó)榮，050011河北省石家莊市第四醫(yī)院婦一科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.06.031

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