楊　莉，何浩明

(1.沭陽縣人民醫(yī)院檢驗科，江蘇宿遷 223600；2.連云港市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇連云港 222002)

?

·臨床研究·

急性髓細胞白血病患者外周血淋巴細胞亞群的檢驗分析

楊莉1，何浩明2

(1.沭陽縣人民醫(yī)院檢驗科，江蘇宿遷 223600；2.連云港市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇連云港 222002)

摘要:目的應(yīng)用流式細胞學技術(shù)檢測急性髓細胞白血病患者外周血淋巴細胞亞群的變化分析，揭示急性髓細胞白血病中外周血淋巴細胞亞群的變化規(guī)律，為臨床個體化治療累積分子機制研究資料。方法應(yīng)用流式細胞學技術(shù)檢測80例急性髓細胞白血病患者外周血淋巴細胞，應(yīng)用相應(yīng)的單克隆抗體檢測CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值及CD16+/CD56+NK細胞百分比。同時通過CD45/SSC設(shè)門分析，分別測定多種CD分子的表達率，并通過配對檢驗分析不同高表達CD分子相關(guān)性。結(jié)果急性髓細胞白血病(AML)組患者CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值及CD16+/CD56+NK細胞百分比顯著低于健康對照組，CD33、CD15、Cyt-MPO和CD64陽性表達不僅比例高，而且表達量高。配對分析表明CD33/CD15和CD33/Cyt-MPO的抗原表達有差異性。結(jié)論AML患者免疫系統(tǒng)低下，外周血CD33、CD15、CD64和Cyt-MPO的表達高。

關(guān)鍵詞:急性髓細胞白血??；淋巴細胞亞型；CD抗原

急性髓細胞白血病(AML)也稱為急性非淋巴細胞白血病(ANLL)，是一種血細胞的髓性癌積聚在骨髓中生長快速的異常白細胞干擾正常血細胞的生成，進而從骨髓進入血液取代正常血細胞，是高度異質(zhì)化的惡性血液病。AML疾病的進展十分迅速，患者如若診斷不及時或未接受治療通常幾周或幾個月的時間就可能丟失生命[1]。AML的具體病因至今并不明確，病毒感染、遺傳因素、化學物質(zhì)毒性等都可能與AML的發(fā)病有關(guān)，而機體細胞/體液免疫功能缺失，免疫監(jiān)視和免疫清除能力減弱，可能會導致癌細胞無限增殖[2-3]。因此通過檢測AML患者外周血淋巴細胞亞群分析，可判斷患者機體免疫功能狀態(tài)和細胞免疫系統(tǒng)重建的情況，采取相應(yīng)的措施預防感染。

1資料與方法

1.1一般資料收集2011年6月至2015年6月江蘇省沭陽縣人民醫(yī)院收治的80例AML患者的標本，根據(jù)臨床血常規(guī)和骨髓穿刺檢查確診，符合張之南的《血液病診斷及療效標準》[4]。80例患者(AML組)中男45例，女35例；年齡4～62歲，中位年齡19歲；根據(jù)FAB分型劃分為M0 2例，M1 10例，M2 26例，M3 21例，M4 6例，M5 8例，M6 7例。選取同期健康者80例(健康對照組)，其中男48例，女32例，年齡16～54歲、中位年齡22歲。兩組研究對象性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2試劑和儀器MultiSET免洗淋巴細胞亞群試劑盒，紅細胞裂解液，以及CD4、CD8、CD56、CD16、CD19、CD7、CD2和CD64等單克隆抗體購自美國BD公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3方法采取外周靜脈全血2 mL置于抗凝管中振搖均勻后備用。分別取50 μL抗凝全血置于FACS專用試管中，各加入20 μL CD3/CD4/CD8/CD45/CD19/CD45/CD1等標記的抗體，漩渦混勻，室溫避光放置15 min后，加入450 μL溶血素，混勻后避光放置15 min，通過流式細胞儀CD45/SSC設(shè)門對10 000個細胞進行檢測，通過FACS Diva軟件分析細胞的免疫表型和表達強度。

2結(jié)果

2.1淋巴細胞亞群檢測結(jié)果AML組與健康對照組比較，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+均明顯低于健康對照組(P<0.05)；CD19+B淋巴細胞百分比AML組明顯高于健康對照組(P<0.05)；而AML組CD16+/CD56+NK細胞百分比明顯低于健康對照組(P<0.05)。見表1。

2.2不同CD分子在AML患者中的表達80例AML患者中CD抗原表達各不相同，其中以Cyt-MPO、CD38、CD33和CD64表達率較高(表2)，將表達百分比超過60.0%作為高表達患者，則Cyt-MPO(68.8%)、CD38(71.2%)、CD64(32.5%)和CD33(73.8%)為高陽性表達，提示這些CD分子在AML診斷上可能有直接診斷價值。

表1　　AML患者及健康對照組外周血T、B淋巴細胞和NK細胞亞群檢測結(jié)果±s)

*1:P<0.05,與健康對照組相比。

表2　　80例AML患者CD抗原表達分布[n=80，n(%)]

2.3高表達CD33與CD15、CD64和Cyt-MPO在AML患者體內(nèi)表達的相關(guān)性由表2的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)CD33、CD15、CD64和Cyt-MPO在AML患者中的表達程度較高(將表達率超過60.0%定義為陽性)，分別進行CD33與CD15、CD64及Cyt-MPO的兩兩比較，經(jīng)檢驗CD33與CD15、Cyt-MPO的抗原表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CD33與CD64之間的抗原表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3　　高表達CD33與CD15、CD64和Cyt-MPO在

3討論

AML是造血干細胞異常增生的惡性腫瘤性疾病，雖然白血病的治療已經(jīng)取得了很大的進展，但是目前AML患者的5年生存率依然較低[5]。主要是目前的治療手段不能夠徹底清除致病細胞，使得致病細胞有一定的殘留，從而引起白血病復發(fā)，這是導致白血病致死的關(guān)鍵因素[6-7]。

臨床很多研究資料的結(jié)果表明，白血病患者外周血淋巴細胞亞群異常與白血病的發(fā)病具有較為密切的相關(guān)性。淋巴細胞是構(gòu)成免疫系統(tǒng)的主要細胞，根據(jù)細胞的表面標志與功能，可將淋巴細胞分成許多不同的群體，在免疫應(yīng)答過程中經(jīng)抗原活化后進行分化和增殖，最后表達功能行使效應(yīng)，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。T淋巴細胞在腫瘤免疫中起中心調(diào)控作用。T細胞亞群是一群具有特殊標志的人胸腺中輸出細胞，執(zhí)行細胞免疫功能及免疫調(diào)節(jié)功能；其中 CD3+細胞代表 T 淋巴細胞總數(shù)；CD4+細胞為免疫應(yīng)答中的主要反應(yīng)細胞，具有增強和擴大其他免疫細胞的功能；CD8+細胞可對靶細胞產(chǎn)生細胞介導的細胞毒作用，同時對 CD4+細胞具有調(diào)節(jié)性免疫抑制作用；CD4+/CD8+的穩(wěn)定比例維持著細胞免疫反應(yīng)的平衡，只有在 CD4+/CD8+正常時才能發(fā)揮抗腫瘤作用。CD4+T淋巴細胞的減少表明患者體內(nèi)細胞免疫功能下降；CD8+T淋巴細胞的相對增加使得機體處于免疫抑制狀態(tài)，減弱白細胞清除癌變細胞的能力，使癌變細胞殘存，導致復發(fā)率上升。CD19是B細胞的標志之一，與B細胞的分化、活化、增殖以及抗體產(chǎn)生有關(guān)。由于CD45是白細胞表面的共同抗原，通過CD45/SSC設(shè)門可以得到幾乎沒有雜細胞的全部白細胞。CD33分子是髓系細胞細胞表面的跨膜受體，通常被認為是粒細胞特異性的標志[8]。CD64分布于白細胞表面，是Fc受體之一，屬于免疫球蛋白超家族的成員，是連接體液調(diào)節(jié)和細胞免疫的橋梁作用[9]。Cyt-MPO是中性粒細胞嗜天青顆粒產(chǎn)生的一種重要的過氧化物酶，可以通過催化氯化物和過氧化氫的氧化產(chǎn)生足夠的自由基，抑制NK細胞對腫瘤細胞的反應(yīng)，可以直接影響機體的免疫功能[10]。CD15是一種存在于中性粒細胞和單核細胞細胞膜表面糖蛋白的一種碳水化合物抗原。CD15不僅作為第二信使參與細胞間的信號傳導，將細胞外信息傳導至細胞質(zhì)和細胞核，而且還通過細胞黏附作用，使腫瘤細胞易于黏附在基膜上，促進癌癥的進展。

本文對AML患者和健康人的外周血淋巴細胞相關(guān)指標進行檢測，結(jié)果顯示，AML患者的CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞及CD4+/CD8+比值均明顯低于健康人，CD8+T淋巴細胞高于健康人，說明AML患者體內(nèi)的免疫功能紊亂。結(jié)果還顯示AML患者體內(nèi)的CD19水平明顯高于健康人，其原因可能是由于CD4+、CD3+T淋巴細胞的下降以及CD4+/CD8+比值的降低可以刺激B淋巴細胞增生，造成體液免疫功能亢進而導致的[7]。CD16+/CD56+是NK細胞的標志物，其表達量可能與NK細胞的功能有關(guān)。NK細胞是機體防御的天然平展，可直接殺傷腫瘤細胞或使其活性降低抑制腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。AML患者NK細胞百分比顯著降低，說明初發(fā)AML患者NK細胞功能低下，機體免疫能力下降。

本研究進一步檢測了多種CD分子，結(jié)果表明不同CD分子在同一個體的表達差異較大。CD33、CD15、Cyt-MPO和CD64陽性表達不僅比例高，而且表達量高，具有足夠的穩(wěn)定性，在AML的診斷中有著重要的意義。本研究通過配對檢驗分別比對CD33/CD15、CD33/CD64和CD33/MPO高表達的構(gòu)成差異，結(jié)果顯示CD33/CD15和CD33/Cyt-MPO的抗原表達有差異性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明兩者聯(lián)合檢驗會提高AML的診斷率。

綜上所述，AML患者免疫功能低下，CD3+、CD4+T淋巴細胞和NK細胞的表達顯著降低，在多種CD分子的檢測中，同一個對不同CD分子的表達也不相同。CD13、CD33、Cyt-MPO和CD64在AML中有著更高的陽性表達率。隨著嵌合抗原受體T細胞、NK細胞治療技術(shù)的發(fā)展，靶向性更強的治療手段會為徹底治愈AML提供思路。

參考文獻

[1]陳影.流式細胞術(shù)檢測急性髓細胞白血病免疫表型及其臨床意義[D].合肥：安徽醫(yī)科大學,2014.

[2]陸春偉,佟海俠,陸美言.急性白血病患者外周血淋巴細胞亞群和調(diào)節(jié)性T細胞的檢測及臨床意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2010,18(11):2230-2233.

[3]中華醫(yī)學會血液學分會.成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中國診療指南(2011年版)[J].中華血液學雜志,2011,32(11):804-807.

[4]張之南.血液病診斷及療效標準[M].北京：科學出版社,2007.

[5]中華醫(yī)學會血液學分會.急性髓系白血病(復發(fā)難治性)中國診療指南(2011年版)[J].中華血液學雜志,2011,32(12):887-888.

[6]范穎,任金海,郭曉玲,等.急性髓系白血病復發(fā)前后生物學標志的變化[C]// 河北省免疫學會血液免疫專業(yè)委員會第三屆年會暨河北省醫(yī)學會血液學分會青年學組第二次學術(shù)會議論文集，石家莊，2012.石家莊：河北省醫(yī)學會血液學分會，2012.

[7]許曉東,胡翠華,常乃柏,等.成人急性髓細胞白血病免疫分型特點及臨床預后分析[J].中國實驗診斷學,2010,14(3):423-426.

[8]張書芹,王光平，朱平，等.急性髓系白血病CD33+/CD34+細胞表面核酸適配體的篩選及結(jié)構(gòu)分析[J].中國實驗血液學雜志，2011，19(3):561-565.

[9]王賢，夏永泉，張葵.CD64和CD14單核細胞相關(guān)性急性髓系白血病診斷中的意義[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2013，34(2):158-159.

[10]賈明峰，席亞明，石秀娥，等.MPO、NQ01優(yōu)基因多態(tài)性與急性白血病易感性的相關(guān)研究[J].中國實驗血液學雜志，2012，20(6)：1336-1340.

(收稿日期：2016-01-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.045

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0817-03