馮　強(qiáng)，彭　森，劉　霞

(徐州市中心醫(yī)院，江蘇 徐州 221009)

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全自動免疫組化篩查ALK基因融合非小細(xì)胞肺癌及其病理特征

馮強(qiáng)，彭森，劉霞

(徐州市中心醫(yī)院，江蘇 徐州 221009)

摘要：目的 探討全自動免疫組化篩查間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因融合非小細(xì)胞肺癌的臨床特點及病理特征.方法 選取經(jīng)病理檢查確診的554例非小細(xì)胞肺癌組織，采用Ventana抗ALK試劑和全自動免疫組化(IHC)染色檢測ALK狀態(tài)，分析ALK基因融合非小細(xì)胞肺癌的臨床特點和病理特征.結(jié)果 本次研究的554例非小細(xì)胞肺癌患者組織中，共篩選出34例ALK陽性，占6.14%；年齡<60歲的非小細(xì)胞肺癌患者ALK陽性率8.69%，明顯高于年齡≥60歲的3.62%，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；男性患者ALK陽性率6.71%高于女性5.21%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).組織形態(tài)學(xué)方面，34例ALK陽性非小細(xì)胞肺癌中28例為肺腺癌，6例為非肺腺癌.16例實體型為主腺癌合并黏液產(chǎn)生，7例腺泡型為主腺癌，1例為乳頭型為主腺癌，4例為浸潤性黏液腺癌，4例為鱗狀細(xì)胞癌.EGFR基因突變檢測顯示：僅有1例合并該基因突變，其余均為野生型.9例IHC陽性樣本，9例ALK基因融合非小細(xì)胞肺癌，9例IHC陰性樣本經(jīng)熒光原位雜交技術(shù)檢測和RT-PCR檢測均為陰性結(jié)果，6例IHC染色可能為陽性，經(jīng)熒光原位雜交技術(shù)檢測均顯示為ALK融合陰性.結(jié)論 ALK基因融合肺癌是非小細(xì)胞肺癌一新的分子亞型，具有獨特的臨床表現(xiàn)和病理形態(tài)；Ventana抗ALK試劑和IHC染色是檢測ALK陽性非小細(xì)胞肺癌首選方法，對提高該類型肺癌的檢出率及個體化治療具有重要意義.

關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌；全自動免疫組化；間變性淋巴瘤激酶

【引用格式】馮強(qiáng)，彭森，劉霞.全自動免疫組化篩查ALK基因融合非小細(xì)胞肺癌及其病理特征[J].北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016，17(2)：209-212.

非小細(xì)胞肺癌為肺癌中最常見的一類，約占肺癌患者的80%[1].近10 a中，隨著分子病理學(xué)的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體(EGFR)突變已成為非小細(xì)胞肺癌最常見的基因改變[2].最近，該領(lǐng)域研究者又發(fā)現(xiàn)一類新亞型ALK基因融合非小細(xì)胞肺癌，對簡變性ALK抑制劑克唑替尼具有高敏感性[3]，因此，通過對ALK狀態(tài)的檢測來篩選出適合接受靶向治療的肺癌患者已成為病理學(xué)研究者的共同目標(biāo).本次研究收集了554例非小細(xì)胞肺癌樣本，采用Ventana抗ALK試劑和全自動免疫組化(IHC)染色篩選ALK陽性非小細(xì)胞肺癌，同時用RT-PCR、熒光原位雜交技術(shù)驗證，探討其臨床特點和病理特征.

1材料與方法

1.1材料

選取經(jīng)病理檢查確診的非小細(xì)胞肺癌石蠟包埋組織554份，其中包括手術(shù)切除肺葉、皮肺穿刺、轉(zhuǎn)移病灶的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本，病案室提供相關(guān)臨床資料，患者或其家屬提供預(yù)后資料.

1.2方法

1.2.1標(biāo)本處理

收集的標(biāo)本用4%甲醛溶液固定，自動脫水后用石蠟包埋，5 μm切片，行HE染色、AB-PAS特殊染色、IHC染色.其中AB-PAS特殊染色具體為：石蠟切片脫蠟至水，Schiff液和pH 2.5的愛先藍(lán)液染色，中性黏多糖顯示為紅色，酸性黏多糖顯示為藍(lán)色，兩組復(fù)合成分為紫色.IHC染色具體為：采用EnVision法染色、Ventana NexES全自動免疫組化染色系統(tǒng)和抗間變性淋巴瘤激酶(ALK)兔單抗試劑盒對ALK蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測，均有陰性和陽性對照，若腫瘤細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒即為ALK陽性.

1.2.2RT-PCR檢測

采用Qiagen純化試劑盒提取、純化石蠟組織中的RNA，用人類EML4-ALK融合基因檢測試劑盒(熒光PCR法，北京雅康博生物科技有限公司)檢測A20，E6；A20，E2；A20，E14等9種融合突變體.

1.2.3熒光原位雜交技術(shù)檢測

采用ALK雙色分離探針，該基因的3′端和5′端分別標(biāo)記紅色、綠色熒光信號.具體為：樣本先通過HE染色對癌區(qū)定位，熒光顯微鏡視野下查看200個腫瘤細(xì)胞；ALK野生型表現(xiàn)為紅綠色合并黃色信號，當(dāng)20%以上的腫瘤細(xì)胞ALK位點出現(xiàn)以下兩種信號時，可判斷為ALK重排陽性：同時存在黃色信號，紅色、綠色信號各一個，紅色、綠色信號間距大于2倍信號點寬度；同時存在黃色信號和一個紅色信號.

1.2.4EGFR基因突變檢測

采用FFPE DNA Kit石蠟包埋組織DNA提取試劑盒，抽提樣本中的DNA；采用Scorpions ARMS法檢測EGFR基因的4種突變狀態(tài)；操作嚴(yán)格按照試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說明書進(jìn)行.

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

本次研究中數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，組間比較采用χ2檢驗，以α=0.05為校驗水準(zhǔn).

2結(jié)果

2.1ALK陽性非小細(xì)胞肺癌篩選及臨床特征

本次研究的554例非小細(xì)胞肺癌組織中，共篩選出34例ALK陽性，占6.14%.554例非小細(xì)胞肺癌患者年齡25～89歲，平均(60.82±12.43)歲；34例ALK陽性患者年齡29～81歲，平均(52.41±10.80)歲.年齡<60歲的非小細(xì)胞肺癌患者ALK陽性率為8.69%(24/276)，明顯高于年齡≥60歲的3.62%(10/276)，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.388，P=0.001).男性患者ALK陽性率6.71%(23/343)高于女性5.21%(11/211)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.162，P=0.785).

2.2ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的病理形態(tài)學(xué)特征

34例ALK陽性非小細(xì)胞肺癌中82.35%(28/34)為肺腺癌，17.65%(6/34)為非肺腺癌，共32例含腺癌成分；47.05%(16/34)實體型為主腺癌合并黏液產(chǎn)生，AB-PAS特殊染色呈陽性，見圖1-A～D；7例腺泡型為主腺癌，其中3例為黏液篩狀結(jié)構(gòu)，見圖1E～F；1例為乳頭型為主腺癌，4例浸潤性黏液腺癌，見圖1-G；4例為鱗狀細(xì)胞癌，見圖1-H.

2.3ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的基因檢測情況

34例ALK陽性非小細(xì)胞肺癌行EGFR基因突變檢測，其中僅有1例合并該基因突變，其余均為野生型.9例IHC陽性樣本，見圖2-A，其中8例經(jīng)熒光原位雜交技術(shù)檢測顯示出ALK分離信號，見圖2-B，1例操作失敗.9例經(jīng)RT-PCR檢測驗證為ALK基因融合非小細(xì)胞肺癌.9例IHC陰性樣本經(jīng)熒光原位雜交技術(shù)檢測和RT-PCR檢測均為陰性結(jié)果.6例IHC染色可能為陽性，經(jīng)熒光原位雜交技術(shù)檢測均顯示為ALK融合陰性.

2.4非小細(xì)胞肺癌患者靶向治療預(yù)后情況

對34例ALK陽性非小細(xì)胞肺癌患者行為期3～58個月的隨訪，其中1例失訪，其余均有完整隨訪資料.14例患者給予靶向藥物(克唑替尼)治療1～6個療程，平均4個療程，其中11例治療后病情緩解或穩(wěn)定，治療緩解比11/14，其余3例患者分別治療2，1，4個療程后病情出現(xiàn)進(jìn)展.

3討論

繼炎性肌纖維母細(xì)胞瘤、淋巴瘤中探尋出多種類型ALK基因重排之后，近年來研究者又報道肺腺癌患者存在一種新的ALK融合基因.在非小細(xì)胞肺癌中EML4基因融合為ALK最常見的融合形式，分別由位于2P21，23的EML4，ALK基因倒位融合為新的EML4-ALK基因，同時還有TFG-ALK等類型的稀有融合，其在非小細(xì)胞肺癌病情進(jìn)展中具有相同的生物學(xué)特性，檢測出的ALK狀態(tài)也具有分子診斷及靶向治療的意義[4].目前多采用熒光原位雜交或PCR技術(shù)來檢測非小細(xì)胞肺癌的ALK狀態(tài).本次研究選用Ventana-IHC法對554例非小細(xì)胞肺癌樣本進(jìn)行檢測，共篩選出34例ALK陽性樣本，并進(jìn)一步分析其臨床特征、病理形態(tài)、治療預(yù)后情況.

非小細(xì)胞肺癌的ALK檢測方法包括熒光原位雜交技術(shù)、RT-PCR、IHC.熒光原位雜交技術(shù)對標(biāo)本前處理、腫瘤判讀有較高要求；RT-PCR對RNA提取有較高要求，引物設(shè)計難度大；IHC簡單易行，適合篩查.雖然國外認(rèn)為熒光原位雜交技術(shù)為檢測非小細(xì)胞肺癌中ALK的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，但研究者對比了非小細(xì)胞肺癌檢測方法與IHC方法ALK陽性檢出率，結(jié)果顯示兩者的假陰性率均大于20%[6]，因此需要兩種方法相互驗證.

本次研究顯示：ALK陽性非小細(xì)胞肺癌患者平均年齡約小于陰性患者10歲，男性患者比率高于女性患者.腺癌的ALK融合率明顯高于其他亞型，肺腺癌中發(fā)生率最高的腺泡亞型不常見于ALK基因融合，而多為實體型.此外，本次研究中多數(shù)病例合并程度不同的細(xì)胞內(nèi)外黏液，與相關(guān)研究結(jié)果一致[7]，進(jìn)一步證實了ALK陽性非小細(xì)胞肺癌與黏液的分泌以及實體型腺癌形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān).

相關(guān)研究顯示：非腺癌亞型非小細(xì)胞肺癌亦存在ALK基因融合，肺腺鱗癌ALK陽性率為6.1%，純鱗狀細(xì)胞癌ALK的陽性率也高達(dá)3.2%[8].本次研究中含鱗狀細(xì)胞癌成分的非小細(xì)胞肺癌表現(xiàn)為ALK彌散性強(qiáng)陽性.可見含鱗狀細(xì)胞癌成分的非小細(xì)胞肺癌同樣需要選擇性檢測ALK狀態(tài).

研究顯示：非小細(xì)胞肺癌中ALK基因融合與其他基因突變事件之間為相互獨立事件，但亦有研究認(rèn)為可合并EGFR或其他基因[9].本次研究中也發(fā)現(xiàn)1例80歲高齡患者存在腺泡為主要型態(tài)的EGFR突變或ALK基因融合，其與上述的ALK陽性非小細(xì)胞肺癌臨床病理特點不完全吻合，待進(jìn)一步收集該類病例進(jìn)行深入研究.

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【責(zé)任編輯：陳麗華】

Screen of Non-small Cell Lung Cancer with Anaplastic Lymphoma Kinase Fusion Gene by Automatic Immunohistochemical Method and Its Pathological Features

Feng Qiang，Peng Sen，Liu Xia

(CentralHospitalofXuzhou，Xuzhou221009，China)

Abstract：Objective To explore the automatic immunohistochemical method for the screen of non-small cell lung cancer with anaplastic lymphoma kinase(ALK)and its clinical pathological features.Methods 554 cases of non-small cell lung cancer diagnosed by pathological examination were enrolled in this study.The status of ALK was detected by Ventana anti ALK reagent and IHC staining，and the clinical characteristics and pathological features of ALK gene were analyzed.Results Among of 554 patients with non-small cell lung cancer，34 cases showed positive ALK(6.14%).The positive rate of the patients under 60 years old(8.69%)was significantly higher than that of the elder patients(3.62%)(P<0.01).The positive rate of male patients (6.71%)was higher than female patients(5.21%)，but the difference was not statistically significant(P>0.05).The results of tectology found that，among of 34 cases with ALK positive non-small cell lung cancer,28 cases were lung adenocarcinoma,5 cases were not lung adenocarcinoma，16 cases were solid adenocarcinoma with grume，7 cases were alveolar adenocarcinoma，1 case was papillary carcinoma，4 cases were invasive mucinous adenocarcinoma，and 4 cases were squamous cell carcinoma.EGFR gene mutation test showed that only 1 case combined with the mutation，and the rest were all wild type.Besides，9 cases were IHC positive samples，9 cases were non-small cell lung cancer with ALK gene fusion，9 cases were IHC negative samples determined by fluorescence in situ hybridization and RT-PCR detection.The other 6 cases of possible positive by IHC staining were determined to be ALK fusion negative by fluorescence in situ hybridization.Conclusion ALK gene fusion lung cancer is a new molecular subtype of non-small cell lung cancer.It has unique clinical feature and pathological morphology.Ventana anti ALK reagent and IHC staining method are the first choice for the test of ALK positive non-small cell lung cancer，which has important significance to improve the detection rate and individual treatment for this type of lung cancer.

Key words：non-small cell lung cancer；automatic immunohistochemistry；anaplastic lymphoma kinase

中圖分類號：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡介：馮強(qiáng)(1972-)，男，主任醫(yī)師，主要從事病理學(xué)研究，E-mail：3976521339@qq.com.

基金項目：江蘇省青年基金項目(BK20141026).

收稿日期：2015-09-10

文章編號：1009-4822(2016)02-0209-04

DOI：10.11713/j.issn.1009-4822.2016.02.014