氯霉素對(duì)毛竹幼苗色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及葉綠素?zé)晒獾挠绊?/h1>
2016-04-27 10:26吳興波陳登舉馬元丹溫國(guó)勝張汝民浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地浙江臨安311300
浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào) 2016年2期
吳興波，陳登舉，馬元丹，高 巖，溫國(guó)勝，張汝民（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）
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氯霉素對(duì)毛竹幼苗色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及葉綠素?zé)晒獾挠绊?/p>
吳興波，陳登舉，馬元丹，高巖，溫國(guó)勝，張汝民
（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）
摘要：為了探討抗生素對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，以3年生毛竹Phyllostachys edulis實(shí)生苗為材料，用Yaxin-1161型非調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x和JIP-test數(shù)據(jù)分析方法，研究了采用不同濃度氯霉素（CAP）對(duì)其葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?。結(jié)果表明：氯霉素處理后，毛竹幼苗葉片葉綠素a,葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低（P＜0.05）；捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過初級(jí)醌受體（QA）的其他電子受體的效率（ET0/TR0）。用于電子傳遞的量子產(chǎn)額（ET0/ABS），最大光化學(xué)效率（φ(P0)）和吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)（PIABS）均顯著下降（P＜0.05），表明氯霉素具有抑制毛竹幼苗光合性能的作用。圖1表3參29
關(guān)鍵詞：植物學(xué)；毛竹；氯霉素；色素；葉綠素?zé)晒?/p>
毛竹Phyllostachys edulis是集經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益于一體的竹種之一。中國(guó)有毛竹林270萬hm2，占全國(guó)竹林總面積的64.1%，是中國(guó)南方重要的森林資源［1］。目前，關(guān)于毛竹的研究多集中在其快速生長(zhǎng)的機(jī)制［2］、施肥對(duì)其生長(zhǎng)及光合生理的影響［3-4］以及環(huán)境因子對(duì)其光合生理特性的影響［1］等方面。近年來，環(huán)境中抗生素的問題越來越引起人們的重視。醫(yī)用和獸用抗生素的大量使用造成了抗生素在環(huán)境中廣泛的暴露，抗生素被有機(jī)體吸收的很少，大部分又被有機(jī)體排放到自然環(huán)境中［5］。研究表明：一些抗生素對(duì)環(huán)境中的水藻和高等植物有顯著的毒害作用［6-7］。植物體內(nèi)發(fā)出的葉綠素?zé)晒庑盘?hào)包含了十分豐富的光合作用信息，并且其特性又極易隨外界環(huán)境條件而變化［8］，快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析技術(shù)（JIP-test）可以根據(jù)植物體內(nèi)發(fā)出的葉綠素?zé)晒庑盘?hào)，方便、快速和無損傷地分析逆境脅迫下光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的功能變化，包括反應(yīng)中心、電子供體側(cè)放氧復(fù)合體（OEC）和受體側(cè)等的變化［9-10］。本研究以3年生毛竹實(shí)生苗為研究對(duì)象，測(cè)定了氯霉素（CAP）處理后葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的變化，通過JIP-test研究了氯霉素對(duì)毛竹幼苗的傷害機(jī)制。
1 材料和方法
1.1試驗(yàn)材料
供試材料為3年生毛竹實(shí)生苗，2012年5月中旬，選取株高1 m左右，生長(zhǎng)良好，無病蟲害的毛竹移入花盆（直徑25 cm）中，放入日光溫室中進(jìn)行緩苗培養(yǎng)。氯霉素購(gòu)自Sigma公司，用去離子水與無水乙醇溶解氯霉素，配成0.1 mol·L-1的母液備用，試驗(yàn)所需濃度加去離子水稀釋，最終溶液（含對(duì)照）中含有體積分?jǐn)?shù)為0.1%無水乙醇和0.01%吐溫-20。
1.2氯霉素處理
待幼苗適應(yīng)生長(zhǎng)1個(gè)月后，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的植株，于2012年6月置于人工氣候箱：溫度為光照25 ℃/黑暗20℃；光照條件為光照14 h/黑暗10 h（光照強(qiáng)度為800 μmol·m-2·s-1）；相對(duì)濕度為（60±3）%，適應(yīng)培養(yǎng)24 h。選取連體的3個(gè)枝條上的9片健康一致的葉片，葉片隔片選取，選取葉子3片·枝條-1，1片置于10 mL 5 mmol·L-1氯霉素［6］的試管內(nèi)，第2片置于10 mL 10 mmol·L-1氯霉素的試管內(nèi)，第3片置于含等量去離子水的試管內(nèi)，作為對(duì)照（ck）。所選葉片浸在試驗(yàn)濃度的溶液中處理5 min［11］，24 h后進(jìn)行色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的測(cè)定。
1.3色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定
將0.2 g剪碎的毛竹葉片置于帶蓋的試管中，加5 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮，室溫下遮光萃取至樣品完全變白后，分別在470，646和663 nm處測(cè)定其光密度值，按Lichtenthaler［12］的方法計(jì)算葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
1.4快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的測(cè)定
采用非調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x（Yaxin-1161型，雅欣理儀科技有限公司）進(jìn)行快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的測(cè)定。測(cè)定前暗適應(yīng)10 min，選取葉肉部分用3 000 μmol·m-2·s-1飽和藍(lán)閃光照射1 s，以10 μs（2 ms之前）和1 ms（2 ms之后）的間隔記錄熒光信號(hào)，測(cè)得葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)。每片葉子分上中下3部分分別進(jìn)行測(cè)定，做3次重復(fù)（3個(gè)枝條），測(cè)得的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線采用JIP-test進(jìn)行分析。
1.5葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)分析
依照STRASSER等［12］提出的能量流動(dòng)模型，天線色素吸收的能量（ABS）其中一小部分主要以熱能和熒光（F）的形式耗散掉，大部分則被反應(yīng)中心（RC）所捕獲（TR），在反應(yīng)中心激發(fā)能被轉(zhuǎn)化為還原能，將初級(jí)醌受體（QA）還原為QA-，QA-又可以被重新氧化，從而產(chǎn)生電子傳遞（ET）用于固定二氧化碳或其他途徑，以此為基礎(chǔ)發(fā)展起來的數(shù)據(jù)處理就被稱為JIP-test。根據(jù)JIP-test公式［13-14］進(jìn)行計(jì)算得到的部分參數(shù)見表1。
表1 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（OJIP）的參數(shù)Table 1 Formulae and glossary of terms for the analysis of the fluorescence transient OJIP
1.6數(shù)據(jù)分析
采用OriginPro 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、方差分析和作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1不同濃度的氯霉素處理后毛竹幼苗葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化
從表2可以看出：氯霉素對(duì)毛竹葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有顯著的影響（P＜0.05），5 mmol·L-1氯霉素處理24 h后，毛竹葉片類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對(duì)照相比無顯著差異，葉綠素a，葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及葉綠素a/b與對(duì)照相比分別降低了16.8%，7.5%，14.0%和9.1%。10 mmol·L-1氯霉素處理后，葉綠素a，葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及葉綠素a/b分別比對(duì)照下降了27.5%，11.9%，22.9% 和17.5%，類胡蘿卜素下降了8.6%。
表2 氯霉素處理后毛竹幼苗葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）Table 2 Changes of pigment content in the seedling leaves of Phyllostachys edulis under CAP treatment（mean±SE）
2.2氯霉素處理對(duì)快速葉綠素a熒光誘導(dǎo)曲線的影響
毛竹幼苗葉片經(jīng)過暗適應(yīng)后轉(zhuǎn)入飽和脈沖光照射，葉綠素?zé)晒庋杆偕仙?，呈現(xiàn)典型的OJIP熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（圖1A）。氯霉素處理后，葉片葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線的OJIP四相熒光值均高于對(duì)照，且隨著氯霉素濃度的增大上升越明顯；J點(diǎn)和I點(diǎn)的相對(duì)可變熒光強(qiáng)度隨著氯霉素濃度的增加而增加（圖1B）。為了更好地反映O-J-I-P曲線各相所代表植物所處的狀態(tài)，作了相對(duì)可變熒光強(qiáng)度差值（Δ［（Ft-F0）/（F100 ms-F0）］）的變化［15］（圖1C）。氯霉素處理后，相對(duì)可變熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了2個(gè)峰，分別在J相（1.5 ms），未知（X）相（4.7 ms），且X相對(duì)應(yīng)的峰最大，J相次之。J峰與X峰的峰值均隨著氯霉素濃度的升高而升高。
圖1 氯霉素處理后毛竹幼苗葉片葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的變化Figure 1 Variations of chlorophyll fluorescence transients in seedling leaves of Ph.edulis under CAP treatment
2.3氯霉素對(duì)毛竹幼苗比活性參數(shù)的影響
快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線還可以反映光合機(jī)構(gòu)的比活性。比活性參數(shù)可以更深入地反映植物的光合器官對(duì)光能的利用，比活性參數(shù)可以不同的基礎(chǔ)表示［9］。5 mmol·L-1氯霉素處理后（表3），TR0/CS和ET0/CS分別比對(duì)照下降了5.4%和10.1%；DI0/CS比對(duì)照上升了5.4%。ABS/RC，TR0/RC，ET0/RC和DI0/RC分別比對(duì)照上升了15.0%，7.5%，3.0%和20.7%。RC/CS比對(duì)照下降了12.8%。不同基礎(chǔ)的比活性參數(shù)和RC/CS的變化比率隨著氯霉素濃度的增大而增大，表明氯霉素濃度越高對(duì)比活性參數(shù)和單位面積的反應(yīng)中心數(shù)量的影響就越大。
2.4氯霉素對(duì)電子傳遞和光合作用性能參數(shù)的影響
ET0/ABS反映了光合機(jī)構(gòu)電子傳遞的量子產(chǎn)額或光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）實(shí)際光化學(xué)效率，主要受φP0和ET0/TR0的影響。5 mmol·L-1氯霉素處理后，φP0和ET0/TR0分別比對(duì)照下降了6.2%，4.5%，PSII的ET0/ABS比對(duì)照下降了10.7%，PIABS比對(duì)照下降了43.4%，而φP0只下降了6.2%，且φP0，ET0/TR，ET0/ABS和PIABS的變化比率均隨著氯霉素濃度的升高而增大。
表3 氯霉素處理后毛竹幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）Table 3 Variations of chlorophyll fluorescence parameters in seedling leaves of Phyllostachys edulis under CAP treatment（mean±SE）
3 討論
葉綠素作為光合作用中光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化的載體，在植物光合作用中起著關(guān)鍵性的作用。已有研究表明：干旱［16］和鹽［17］以及重金屬［18］等脅迫均會(huì)顯著影響葉片葉綠素的含量。本研究結(jié)果表明:氯霉素處理后，毛竹幼苗葉片葉綠素a，葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著降低，并且處理濃度越高，降低越明顯（表2）。這可能有兩方面的原因，一方面可能是因?yàn)槁让顾乜梢砸种迫~綠體內(nèi)70S型核糖體蛋白的合成［19］，從而抑制了葉綠素合成代謝關(guān)鍵酶的形成，抑制了其合成代謝，且氯霉素的濃度越高，抑制程度越大；另一方面可能是因?yàn)槁让顾嘏c葉綠素發(fā)生反應(yīng)而加速了葉綠素的降解。葉綠素a/b的顯著下降，表明氯霉素影響毛竹幼苗葉片聚光色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要是破壞其反應(yīng)中心色素，從而影響其光合性能［18］。
大量研究表明：OJIP曲線的形狀對(duì)一些脅迫如干旱［20］、高溫［21］、機(jī)械損傷［22］、強(qiáng)光［23］以及化學(xué)藥品［15］等很敏感。5 mmol·L-1氯霉素處理后，快速熒光誘導(dǎo)曲線仍呈現(xiàn)典型的OJIP，且四相熒光值均升高，這與氧化樂果的作用結(jié)果類似［24］。O點(diǎn)的熒光值（F0）說明植物光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）釋放的熒光量，可以理解為PSⅠ的活性［25］，F(xiàn)0上升，可能是氯霉素處理后PSⅡ遭到破壞，PSⅡ和PSⅠ間激發(fā)能的分配增強(qiáng)，更多的激發(fā)能分配給PSⅠ，促使PSⅠ的活性增強(qiáng)［26］。P點(diǎn)熒光即最大熒光Fm上升，表明有活性的反應(yīng)中心關(guān)閉的數(shù)量上升，這與RC/CS的下降相矛盾。Fm歸一化后呈下降趨勢(shì)（圖1B），這與RC/CS的下降相一致，表明歸一化能夠得到一些較為可靠的數(shù)據(jù)。φP0只反映PSⅡ反應(yīng)中心對(duì)吸收光能的捕獲效率，它無法反映整個(gè)電子傳遞鏈特別是QA下游的電子傳遞鏈對(duì)氯霉素的響應(yīng)；而光合性能指數(shù)（PIABS）不僅反映PSⅡ反應(yīng)中心對(duì)吸收光能的捕獲效率，還反映了PSⅡ有活性反應(yīng)中心的數(shù)目以及電子在PSⅡ和PSⅡ之間的傳遞，所以PIABS可以更全面地反映整個(gè)光合電子傳遞鏈的變化［9,13］。氯霉素處理后，PIABS的下降比率遠(yuǎn)大于φP0（表3），表明PIABS的下降主要與PSⅡ有活性反應(yīng)中心的數(shù)目和電子在PSⅡ和PSⅠ之間的傳遞有關(guān)。氯霉素處理后，ET0/TR0顯著下降影響到以后的電子傳遞，最終導(dǎo)致ET0/ABS下降［14］，表明PSⅡ反應(yīng)中心被破壞［27］，導(dǎo)致RC/CS顯著下降。氯霉素處理后，ABS/RC，TR0/RC，ET0/RC和DI0/RC顯著上升（表3），表明有活性的反應(yīng)中心會(huì)通過增加單位反應(yīng)中心的光合性能和增加熱耗散來保護(hù)和維持光合機(jī)構(gòu)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)來適應(yīng)氯霉素脅迫［25］。單位反應(yīng)中心的性能比對(duì)照有所提升，而氯霉素仍然會(huì)造成TR0/CS和ET0/CS的下降，即單位面積的光能利用率降低，這可能是因?yàn)閱挝幻娣e內(nèi)RC/CS減少后，單位反應(yīng)中心被迫接受更多的光能，反應(yīng)中心數(shù)量減少導(dǎo)致的光合性能的下降幅度大于單位反應(yīng)中心性能提升造成的光合性能上升幅度［28］，TR0/CS0和ET0/CS0呈顯著下降。
研究表明：植物在遭受脅迫時(shí)電子傳遞鏈特定位點(diǎn)會(huì)受到抑制［15］。氯霉素處理后，Wk差異不顯著，表明PSⅡ的供體側(cè)沒有受到明顯傷害［29］；歸一化后J相熒光仍然上升，表明氯霉素處理造成PSII受體側(cè)QA-的大量積累，QA之后QA到QB的電子傳遞鏈過程受到抑制［15］。本研究還發(fā)現(xiàn)：J峰之后還存在1個(gè)X峰，并且X峰值高于J峰，這可能是因?yàn)镼A后面的電子傳遞鏈除了QA到QB這個(gè)作用位點(diǎn)外，還存在1個(gè)氯霉素的作用位點(diǎn)，可能對(duì)PhQAQB的還原過程具有抑制作用［15］。
綜上所述，氯霉素一方面可能干擾了毛竹幼苗色素合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡，另一方面抑制了毛竹幼苗葉片的光合性能。氯霉素作用的主要位點(diǎn)可能在PSⅡ的受體側(cè)，并且隨著氯霉素濃度升高，抑制作用越大。
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Chloromycetin effects on pigment content and chlorophyll fluorescence in Phyllostachys edulis seedlings
WU Xingbo, CHEN Dengju, MA Yuandan, GAO Yan, WEN Guosheng, ZHANG Rumin
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an, 311300, Zhejiang, China）
Abstract:To determine the effects of antibiotics on plant growth, three-year-old Phyllostachys edulis seedlings were used as experimental materials.Then pigment content and chlorophyll fluorescence with different concentrations of chloromycetin（CAP）were determined using a non-modulated chlorophyll fluorometer（Yaxin-1161）and the JIP-test data analysis method.Results showed that chlorophyll a, chlorophyll b, and total chlorophyll content of the leaves significantly decreased（P＜0.05）with the CAP treatment.A significant decrease（P＜0.05）was found with the probability that a trapped exciton moved an electron into the electron transport chain beyond Quinone A（QA）（ET0/TR0）, with quantum yield for electron transport（ET0/ABS）, with maximum quantum yield for primary photochemistry（φ(P0)）, and with performance index on absorption basis（PIABS）.This suggested that CAP suppressed leaf photosynthetic characteristics.［Ch, 1 fig.3 tab.29 ref.］
Key words:botany; Phyllostachys edulis; chloromycetin; pigment content; chlorophyll fluorescence
作者簡(jiǎn)介：吳興波,從事園林植物栽培與管理研究。E-mail：dongpinglinan@163.com。通信作者：馬元丹，講師，博士，從事植物生理生態(tài)學(xué)研究。E-mail：ruminzhang@sohu.com
基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31570686, 30972397, 31270497和31270756）；浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金資助項(xiàng)目（2010FR058）
收稿日期：2015-01-12;修回日期：2015-09-21
doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.004
中圖分類號(hào)：S718.4
文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A
文章編號(hào)：2095-0756（2016）02-0209-07
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吳興波，陳登舉，馬元丹，高 巖，溫國(guó)勝，張汝民（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）
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氯霉素對(duì)毛竹幼苗色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及葉綠素?zé)晒獾挠绊?/p>
吳興波，陳登舉，馬元丹，高巖，溫國(guó)勝，張汝民
（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）
摘要：為了探討抗生素對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，以3年生毛竹Phyllostachys edulis實(shí)生苗為材料，用Yaxin-1161型非調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x和JIP-test數(shù)據(jù)分析方法，研究了采用不同濃度氯霉素（CAP）對(duì)其葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?。結(jié)果表明：氯霉素處理后，毛竹幼苗葉片葉綠素a,葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低（P＜0.05）；捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過初級(jí)醌受體（QA）的其他電子受體的效率（ET0/TR0）。用于電子傳遞的量子產(chǎn)額（ET0/ABS），最大光化學(xué)效率（φ(P0)）和吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)（PIABS）均顯著下降（P＜0.05），表明氯霉素具有抑制毛竹幼苗光合性能的作用。圖1表3參29
關(guān)鍵詞：植物學(xué)；毛竹；氯霉素；色素；葉綠素?zé)晒?/p>
毛竹Phyllostachys edulis是集經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益于一體的竹種之一。中國(guó)有毛竹林270萬hm2，占全國(guó)竹林總面積的64.1%，是中國(guó)南方重要的森林資源［1］。目前，關(guān)于毛竹的研究多集中在其快速生長(zhǎng)的機(jī)制［2］、施肥對(duì)其生長(zhǎng)及光合生理的影響［3-4］以及環(huán)境因子對(duì)其光合生理特性的影響［1］等方面。近年來，環(huán)境中抗生素的問題越來越引起人們的重視。醫(yī)用和獸用抗生素的大量使用造成了抗生素在環(huán)境中廣泛的暴露，抗生素被有機(jī)體吸收的很少，大部分又被有機(jī)體排放到自然環(huán)境中［5］。研究表明：一些抗生素對(duì)環(huán)境中的水藻和高等植物有顯著的毒害作用［6-7］。植物體內(nèi)發(fā)出的葉綠素?zé)晒庑盘?hào)包含了十分豐富的光合作用信息，并且其特性又極易隨外界環(huán)境條件而變化［8］，快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析技術(shù)（JIP-test）可以根據(jù)植物體內(nèi)發(fā)出的葉綠素?zé)晒庑盘?hào)，方便、快速和無損傷地分析逆境脅迫下光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的功能變化，包括反應(yīng)中心、電子供體側(cè)放氧復(fù)合體（OEC）和受體側(cè)等的變化［9-10］。本研究以3年生毛竹實(shí)生苗為研究對(duì)象，測(cè)定了氯霉素（CAP）處理后葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的變化，通過JIP-test研究了氯霉素對(duì)毛竹幼苗的傷害機(jī)制。
1 材料和方法
1.1試驗(yàn)材料
供試材料為3年生毛竹實(shí)生苗，2012年5月中旬，選取株高1 m左右，生長(zhǎng)良好，無病蟲害的毛竹移入花盆（直徑25 cm）中，放入日光溫室中進(jìn)行緩苗培養(yǎng)。氯霉素購(gòu)自Sigma公司，用去離子水與無水乙醇溶解氯霉素，配成0.1 mol·L-1的母液備用，試驗(yàn)所需濃度加去離子水稀釋，最終溶液（含對(duì)照）中含有體積分?jǐn)?shù)為0.1%無水乙醇和0.01%吐溫-20。
1.2氯霉素處理
待幼苗適應(yīng)生長(zhǎng)1個(gè)月后，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的植株，于2012年6月置于人工氣候箱：溫度為光照25 ℃/黑暗20℃；光照條件為光照14 h/黑暗10 h（光照強(qiáng)度為800 μmol·m-2·s-1）；相對(duì)濕度為（60±3）%，適應(yīng)培養(yǎng)24 h。選取連體的3個(gè)枝條上的9片健康一致的葉片，葉片隔片選取，選取葉子3片·枝條-1，1片置于10 mL 5 mmol·L-1氯霉素［6］的試管內(nèi)，第2片置于10 mL 10 mmol·L-1氯霉素的試管內(nèi)，第3片置于含等量去離子水的試管內(nèi)，作為對(duì)照（ck）。所選葉片浸在試驗(yàn)濃度的溶液中處理5 min［11］，24 h后進(jìn)行色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的測(cè)定。
1.3色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定
將0.2 g剪碎的毛竹葉片置于帶蓋的試管中，加5 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮，室溫下遮光萃取至樣品完全變白后，分別在470，646和663 nm處測(cè)定其光密度值，按Lichtenthaler［12］的方法計(jì)算葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
1.4快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的測(cè)定
采用非調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x（Yaxin-1161型，雅欣理儀科技有限公司）進(jìn)行快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的測(cè)定。測(cè)定前暗適應(yīng)10 min，選取葉肉部分用3 000 μmol·m-2·s-1飽和藍(lán)閃光照射1 s，以10 μs（2 ms之前）和1 ms（2 ms之后）的間隔記錄熒光信號(hào)，測(cè)得葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)。每片葉子分上中下3部分分別進(jìn)行測(cè)定，做3次重復(fù)（3個(gè)枝條），測(cè)得的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線采用JIP-test進(jìn)行分析。
1.5葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)分析
依照STRASSER等［12］提出的能量流動(dòng)模型，天線色素吸收的能量（ABS）其中一小部分主要以熱能和熒光（F）的形式耗散掉，大部分則被反應(yīng)中心（RC）所捕獲（TR），在反應(yīng)中心激發(fā)能被轉(zhuǎn)化為還原能，將初級(jí)醌受體（QA）還原為QA-，QA-又可以被重新氧化，從而產(chǎn)生電子傳遞（ET）用于固定二氧化碳或其他途徑，以此為基礎(chǔ)發(fā)展起來的數(shù)據(jù)處理就被稱為JIP-test。根據(jù)JIP-test公式［13-14］進(jìn)行計(jì)算得到的部分參數(shù)見表1。
表1 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（OJIP）的參數(shù)Table 1 Formulae and glossary of terms for the analysis of the fluorescence transient OJIP
1.6數(shù)據(jù)分析
采用OriginPro 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、方差分析和作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1不同濃度的氯霉素處理后毛竹幼苗葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化
從表2可以看出：氯霉素對(duì)毛竹葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有顯著的影響（P＜0.05），5 mmol·L-1氯霉素處理24 h后，毛竹葉片類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對(duì)照相比無顯著差異，葉綠素a，葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及葉綠素a/b與對(duì)照相比分別降低了16.8%，7.5%，14.0%和9.1%。10 mmol·L-1氯霉素處理后，葉綠素a，葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及葉綠素a/b分別比對(duì)照下降了27.5%，11.9%，22.9% 和17.5%，類胡蘿卜素下降了8.6%。
表2 氯霉素處理后毛竹幼苗葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）Table 2 Changes of pigment content in the seedling leaves of Phyllostachys edulis under CAP treatment（mean±SE）
2.2氯霉素處理對(duì)快速葉綠素a熒光誘導(dǎo)曲線的影響
毛竹幼苗葉片經(jīng)過暗適應(yīng)后轉(zhuǎn)入飽和脈沖光照射，葉綠素?zé)晒庋杆偕仙?，呈現(xiàn)典型的OJIP熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（圖1A）。氯霉素處理后，葉片葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線的OJIP四相熒光值均高于對(duì)照，且隨著氯霉素濃度的增大上升越明顯；J點(diǎn)和I點(diǎn)的相對(duì)可變熒光強(qiáng)度隨著氯霉素濃度的增加而增加（圖1B）。為了更好地反映O-J-I-P曲線各相所代表植物所處的狀態(tài)，作了相對(duì)可變熒光強(qiáng)度差值（Δ［（Ft-F0）/（F100 ms-F0）］）的變化［15］（圖1C）。氯霉素處理后，相對(duì)可變熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了2個(gè)峰，分別在J相（1.5 ms），未知（X）相（4.7 ms），且X相對(duì)應(yīng)的峰最大，J相次之。J峰與X峰的峰值均隨著氯霉素濃度的升高而升高。
圖1 氯霉素處理后毛竹幼苗葉片葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的變化Figure 1 Variations of chlorophyll fluorescence transients in seedling leaves of Ph.edulis under CAP treatment
2.3氯霉素對(duì)毛竹幼苗比活性參數(shù)的影響
快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線還可以反映光合機(jī)構(gòu)的比活性。比活性參數(shù)可以更深入地反映植物的光合器官對(duì)光能的利用，比活性參數(shù)可以不同的基礎(chǔ)表示［9］。5 mmol·L-1氯霉素處理后（表3），TR0/CS和ET0/CS分別比對(duì)照下降了5.4%和10.1%；DI0/CS比對(duì)照上升了5.4%。ABS/RC，TR0/RC，ET0/RC和DI0/RC分別比對(duì)照上升了15.0%，7.5%，3.0%和20.7%。RC/CS比對(duì)照下降了12.8%。不同基礎(chǔ)的比活性參數(shù)和RC/CS的變化比率隨著氯霉素濃度的增大而增大，表明氯霉素濃度越高對(duì)比活性參數(shù)和單位面積的反應(yīng)中心數(shù)量的影響就越大。
2.4氯霉素對(duì)電子傳遞和光合作用性能參數(shù)的影響
ET0/ABS反映了光合機(jī)構(gòu)電子傳遞的量子產(chǎn)額或光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）實(shí)際光化學(xué)效率，主要受φP0和ET0/TR0的影響。5 mmol·L-1氯霉素處理后，φP0和ET0/TR0分別比對(duì)照下降了6.2%，4.5%，PSII的ET0/ABS比對(duì)照下降了10.7%，PIABS比對(duì)照下降了43.4%，而φP0只下降了6.2%，且φP0，ET0/TR，ET0/ABS和PIABS的變化比率均隨著氯霉素濃度的升高而增大。
表3 氯霉素處理后毛竹幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）Table 3 Variations of chlorophyll fluorescence parameters in seedling leaves of Phyllostachys edulis under CAP treatment（mean±SE）
3 討論
葉綠素作為光合作用中光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化的載體，在植物光合作用中起著關(guān)鍵性的作用。已有研究表明：干旱［16］和鹽［17］以及重金屬［18］等脅迫均會(huì)顯著影響葉片葉綠素的含量。本研究結(jié)果表明:氯霉素處理后，毛竹幼苗葉片葉綠素a，葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著降低，并且處理濃度越高，降低越明顯（表2）。這可能有兩方面的原因，一方面可能是因?yàn)槁让顾乜梢砸种迫~綠體內(nèi)70S型核糖體蛋白的合成［19］，從而抑制了葉綠素合成代謝關(guān)鍵酶的形成，抑制了其合成代謝，且氯霉素的濃度越高，抑制程度越大；另一方面可能是因?yàn)槁让顾嘏c葉綠素發(fā)生反應(yīng)而加速了葉綠素的降解。葉綠素a/b的顯著下降，表明氯霉素影響毛竹幼苗葉片聚光色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要是破壞其反應(yīng)中心色素，從而影響其光合性能［18］。
大量研究表明：OJIP曲線的形狀對(duì)一些脅迫如干旱［20］、高溫［21］、機(jī)械損傷［22］、強(qiáng)光［23］以及化學(xué)藥品［15］等很敏感。5 mmol·L-1氯霉素處理后，快速熒光誘導(dǎo)曲線仍呈現(xiàn)典型的OJIP，且四相熒光值均升高，這與氧化樂果的作用結(jié)果類似［24］。O點(diǎn)的熒光值（F0）說明植物光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）釋放的熒光量，可以理解為PSⅠ的活性［25］，F(xiàn)0上升，可能是氯霉素處理后PSⅡ遭到破壞，PSⅡ和PSⅠ間激發(fā)能的分配增強(qiáng)，更多的激發(fā)能分配給PSⅠ，促使PSⅠ的活性增強(qiáng)［26］。P點(diǎn)熒光即最大熒光Fm上升，表明有活性的反應(yīng)中心關(guān)閉的數(shù)量上升，這與RC/CS的下降相矛盾。Fm歸一化后呈下降趨勢(shì)（圖1B），這與RC/CS的下降相一致，表明歸一化能夠得到一些較為可靠的數(shù)據(jù)。φP0只反映PSⅡ反應(yīng)中心對(duì)吸收光能的捕獲效率，它無法反映整個(gè)電子傳遞鏈特別是QA下游的電子傳遞鏈對(duì)氯霉素的響應(yīng)；而光合性能指數(shù)（PIABS）不僅反映PSⅡ反應(yīng)中心對(duì)吸收光能的捕獲效率，還反映了PSⅡ有活性反應(yīng)中心的數(shù)目以及電子在PSⅡ和PSⅡ之間的傳遞，所以PIABS可以更全面地反映整個(gè)光合電子傳遞鏈的變化［9,13］。氯霉素處理后，PIABS的下降比率遠(yuǎn)大于φP0（表3），表明PIABS的下降主要與PSⅡ有活性反應(yīng)中心的數(shù)目和電子在PSⅡ和PSⅠ之間的傳遞有關(guān)。氯霉素處理后，ET0/TR0顯著下降影響到以后的電子傳遞，最終導(dǎo)致ET0/ABS下降［14］，表明PSⅡ反應(yīng)中心被破壞［27］，導(dǎo)致RC/CS顯著下降。氯霉素處理后，ABS/RC，TR0/RC，ET0/RC和DI0/RC顯著上升（表3），表明有活性的反應(yīng)中心會(huì)通過增加單位反應(yīng)中心的光合性能和增加熱耗散來保護(hù)和維持光合機(jī)構(gòu)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)來適應(yīng)氯霉素脅迫［25］。單位反應(yīng)中心的性能比對(duì)照有所提升，而氯霉素仍然會(huì)造成TR0/CS和ET0/CS的下降，即單位面積的光能利用率降低，這可能是因?yàn)閱挝幻娣e內(nèi)RC/CS減少后，單位反應(yīng)中心被迫接受更多的光能，反應(yīng)中心數(shù)量減少導(dǎo)致的光合性能的下降幅度大于單位反應(yīng)中心性能提升造成的光合性能上升幅度［28］，TR0/CS0和ET0/CS0呈顯著下降。
研究表明：植物在遭受脅迫時(shí)電子傳遞鏈特定位點(diǎn)會(huì)受到抑制［15］。氯霉素處理后，Wk差異不顯著，表明PSⅡ的供體側(cè)沒有受到明顯傷害［29］；歸一化后J相熒光仍然上升，表明氯霉素處理造成PSII受體側(cè)QA-的大量積累，QA之后QA到QB的電子傳遞鏈過程受到抑制［15］。本研究還發(fā)現(xiàn)：J峰之后還存在1個(gè)X峰，并且X峰值高于J峰，這可能是因?yàn)镼A后面的電子傳遞鏈除了QA到QB這個(gè)作用位點(diǎn)外，還存在1個(gè)氯霉素的作用位點(diǎn)，可能對(duì)PhQAQB的還原過程具有抑制作用［15］。
綜上所述，氯霉素一方面可能干擾了毛竹幼苗色素合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡，另一方面抑制了毛竹幼苗葉片的光合性能。氯霉素作用的主要位點(diǎn)可能在PSⅡ的受體側(cè)，并且隨著氯霉素濃度升高，抑制作用越大。
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Chloromycetin effects on pigment content and chlorophyll fluorescence in Phyllostachys edulis seedlings
WU Xingbo, CHEN Dengju, MA Yuandan, GAO Yan, WEN Guosheng, ZHANG Rumin
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an, 311300, Zhejiang, China）
Abstract:To determine the effects of antibiotics on plant growth, three-year-old Phyllostachys edulis seedlings were used as experimental materials.Then pigment content and chlorophyll fluorescence with different concentrations of chloromycetin（CAP）were determined using a non-modulated chlorophyll fluorometer（Yaxin-1161）and the JIP-test data analysis method.Results showed that chlorophyll a, chlorophyll b, and total chlorophyll content of the leaves significantly decreased（P＜0.05）with the CAP treatment.A significant decrease（P＜0.05）was found with the probability that a trapped exciton moved an electron into the electron transport chain beyond Quinone A（QA）（ET0/TR0）, with quantum yield for electron transport（ET0/ABS）, with maximum quantum yield for primary photochemistry（φ(P0)）, and with performance index on absorption basis（PIABS）.This suggested that CAP suppressed leaf photosynthetic characteristics.［Ch, 1 fig.3 tab.29 ref.］
Key words:botany; Phyllostachys edulis; chloromycetin; pigment content; chlorophyll fluorescence
作者簡(jiǎn)介：吳興波,從事園林植物栽培與管理研究。E-mail：dongpinglinan@163.com。通信作者：馬元丹，講師，博士，從事植物生理生態(tài)學(xué)研究。E-mail：ruminzhang@sohu.com
基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31570686, 30972397, 31270497和31270756）；浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金資助項(xiàng)目（2010FR058）
收稿日期：2015-01-12;修回日期：2015-09-21
doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.004
中圖分類號(hào)：S718.4
文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A
文章編號(hào)：2095-0756（2016）02-0209-07
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