李健，李巖，高興祥，房鋒，李美*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南 250100；2. 濟(jì)寧市兗州區(qū)農(nóng)業(yè)局，山東 濟(jì)寧 272100)

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馬唐生防菌厚垣孢鐮刀菌ZC201301的生物學(xué)特性研究

李健1，李巖2，高興祥1，房鋒1，李美1*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南 250100；2. 濟(jì)寧市兗州區(qū)農(nóng)業(yè)局，山東 濟(jì)寧 272100)

摘要：厚垣孢鐮刀菌ZC201301對(duì)雜草馬唐具有良好的生物防效，本研究通過(guò)單次單因子法對(duì)菌株ZC201301的基本生物學(xué)特性進(jìn)行了進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，菌株ZC201301最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基為PDA和CAJ培養(yǎng)基，最適生長(zhǎng)溫度為25～30℃，最適生長(zhǎng)pH值為6～8；菌株ZC201301在多種培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢，最適產(chǎn)孢培養(yǎng)基為馬唐汁液培養(yǎng)基，日光燈照射對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響不顯著，但是對(duì)產(chǎn)孢有一定抑制作用；菌絲生長(zhǎng)最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為硝酸銨；菌落生長(zhǎng)需要充足氧氣，氣/液小于1∶1時(shí)菌絲生長(zhǎng)受到抑制。濕度是影響ZC201301發(fā)揮生防效果的重要因子，環(huán)境濕度小于60%時(shí)生防效果下降顯著。以上結(jié)果說(shuō)明，該菌適宜培養(yǎng)，這對(duì)于其生防菌劑的制備及在田間條件下存活有重要意義。

關(guān)鍵詞：馬唐；厚垣孢鐮刀菌；生物除草劑；生物學(xué)特性

馬唐(Digitariasanguinalis)是禾本科一年生惡性雜草，廣泛分布于熱帶和溫帶地區(qū)[1]，危害小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)等30多種作物，是世界上分布最為廣泛的18種惡性雜草之一[2]。馬唐環(huán)境適應(yīng)能力極強(qiáng)，生長(zhǎng)期與作物較為一致，易同作物競(jìng)爭(zhēng)消耗地力[3-4]。近年來(lái)，馬唐的大量發(fā)生對(duì)我國(guó)黃淮海玉米產(chǎn)量造成了嚴(yán)重影響[5]。目前對(duì)于馬唐的防治主要是采取化學(xué)手段，但是化學(xué)藥劑的大規(guī)模使用不僅對(duì)環(huán)境和食品安全造成了影響，同時(shí)也導(dǎo)致了抗性馬唐的產(chǎn)生[6]，這都為馬唐的有效防控造成了困難。同時(shí)，由化學(xué)防控導(dǎo)致的環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，生物防治及其他非化學(xué)防控手段日益受到學(xué)者的重視[7]。

馬唐的生物防治研究開(kāi)展較早，國(guó)外有報(bào)道利用彎孢霉(Curvulariaintermedia)[8]及馬唐黑粉菌(Ustilagosynthersmae)[3]作為馬唐生防菌劑。海南大學(xué)利用新月彎孢霉(Curvularialunata)菌株MT-011[9]，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)利用畫(huà)眉草彎孢霉(Curvulariaeragrostidis)[10]，浙江師范大學(xué)利用彎孢型炭疽菌(Colletotrichumhanaui)菌株[11]進(jìn)行了馬唐防治研究，均取得一定效果。本研究所用菌株為厚垣孢鐮刀菌ZC201301，為本科室前期篩選得到的一株馬唐生防菌，前期測(cè)定表明該菌種孢子懸浮液噴霧處理對(duì)苗期馬唐具有非常好的防控效果，馬唐感病后很快干枯死亡，同時(shí)該菌也可使其他雜草感病，對(duì)反枝莧(Amaranthusretroflexus)、狗尾草(Setariaviridis)等雜草表現(xiàn)出一定的防控效果[12]。

優(yōu)化培養(yǎng)條件以獲得最佳生防因子是生防菌應(yīng)用的前提[13-14]。因此本研究以前期篩選得到的馬唐生防菌ZC201301為材料，通過(guò)對(duì)其多個(gè)基本生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以明確其最佳培養(yǎng)和產(chǎn)孢條件，為其下一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

本研究所用菌株為厚垣孢鐮刀菌ZC201301(專利公開(kāi)號(hào)：CN104250620A)，2014年由本實(shí)驗(yàn)室采集并保存。

本研究所用培養(yǎng)基基本配方如下,馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水定容至1000 mL；馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA):馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，水定容至1000 mL；胡蘿卜培養(yǎng)基(CA):胡蘿卜200 g，瓊脂20 g，水定容至1000 mL；水瓊脂培養(yǎng)基(WA):瓊脂20 g，水定容至1000 mL；馬唐汁液培養(yǎng)基(CAJ):馬唐汁液 200 g，瓊脂20 g，水定容至1000 mL；1×, 2×, 4×, 10×, 20×CAJ培養(yǎng)基為原始馬唐汁液培養(yǎng)基稀釋相應(yīng)倍數(shù)。

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母浸膏1 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，K2HPO41 g，瓊脂20 g，水定容至1000 mL；氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖20 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，K2HPO41 g，瓊脂20 g，水定容至1000 mL。

1.2影響菌株ZC201301菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢等因子的測(cè)定

1.2.1培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基活化保存的菌株，5 d后，在菌落的邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，接種到各供試培養(yǎng)基上，7 d后測(cè)量菌落直徑；并收集菌絲，80℃烘箱烘烤2 h后稱量菌絲干重(下同)；3 mL無(wú)菌水清洗菌落表面孢子，收集后血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算產(chǎn)孢量(下同)。

1.2.2溫度共設(shè)置 15，20，25，28，30，35℃ 6個(gè)處理，參照1.2.1的方法PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株ZC201301，放置于設(shè)置為不同溫度的培養(yǎng)箱內(nèi)，接菌后7 d，統(tǒng)計(jì)菌落直徑和菌絲重量。

1.2.3培養(yǎng)和光照時(shí)間以篩選出的PDA和CAJ培養(yǎng)基為產(chǎn)孢培養(yǎng)基，進(jìn)行不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)孢量影響的測(cè)定，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為接種后2，3，5，7，14 d，收集孢子，分別計(jì)算產(chǎn)孢量。以篩選出的產(chǎn)孢量最大的CAJ培養(yǎng)基為產(chǎn)孢培養(yǎng)基，測(cè)定光照條件對(duì)菌株產(chǎn)孢量的影響，光照條件設(shè)置為連續(xù)黑暗、連續(xù)光照、黑暗/光照交替(8 h/16 h、12 h/12 h、16 h/8 h)5個(gè)處理，接菌后7 d，收集孢子，分別計(jì)算產(chǎn)孢量。

1.2.4pH值將PDA培養(yǎng)基滅菌后調(diào)制成不同pH值，設(shè)置的pH值為4，5，6，7，8，9這6個(gè)處理，參照1.2.1的方法，25℃，黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，統(tǒng)計(jì)菌落直徑和菌絲重量。

1.2.5碳氮源在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別添加相應(yīng)量(20 g/L)葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖等5種碳源，觀察并統(tǒng)計(jì)菌落生長(zhǎng)情況；在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別添加相應(yīng)量(1 g/L)硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鈣、硝酸銨、硫酸銨等5種氮源，25℃，黑暗條件下培養(yǎng)7 d，觀察并統(tǒng)計(jì)菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.6氣/液以100 mL 液體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過(guò)采用不同容積的三角瓶達(dá)到氣/液體積比為1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4這4個(gè)處理。25℃，150 r/min，黑暗條件下?lián)u菌培養(yǎng)72 h，過(guò)濾收集所有菌絲，烘干后稱量菌絲重量。以上實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3環(huán)境濕度對(duì)菌株ZC201301致病力的影響

25℃，黑暗條件下，ZC201301菌株在CAJ培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，收集孢子并配制成濃度為1×108個(gè)/mL的孢子懸浮液(含0.1%吐溫80)。將孢子懸浮液用手持小噴壺噴施于2～3葉期的馬唐植株上，黑暗條件下放于不同濕度人工氣候箱內(nèi)；25℃，黑暗培養(yǎng)48 h后持續(xù)光照，14 d后稱量植株鮮重，計(jì)算鮮重抑制率。以噴施0.1%吐溫80植株為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

1.4數(shù)據(jù)分析

鮮重抑制率(fresh weight inhibition rate，F(xiàn)WIR)的計(jì)算公式: FWIR(%)=[(對(duì)照平均鮮重-處理平均鮮重)/對(duì)照平均鮮重]×100。利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA和GLM分析不同處理間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1菌株ZC201301在不同培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢差異

結(jié)果(表1)表明，菌株ZC201301在PDA和CAJ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最高，培養(yǎng)7 d后菌落直徑分別達(dá)到7.91和7.55 cm，氣生菌絲量PDA培養(yǎng)基最多，約為CAJ培養(yǎng)基氣生菌絲量的6倍；但最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基為CAJ培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后其產(chǎn)孢量約為PDA培養(yǎng)基的167倍。

表1　菌株ZC201301在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢數(shù)量

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)，同行數(shù)據(jù)后的不同字母表示在 0.05 水平上差異顯著，下同。

Note: The values in the table are the average value of the standard error (n=3), and the different letters within the same row indicate that the difference is significant at the 0.05 level. The same below.

由表1可以看出，菌株ZC201301的最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基為CAJ培養(yǎng)基。為了利用盡量少的培養(yǎng)材料獲得較高的分生孢子產(chǎn)量，我們進(jìn)一步降低CAJ培養(yǎng)基內(nèi)的馬唐數(shù)量研究其對(duì)產(chǎn)孢的影響，由表2可以看出，CAJ培養(yǎng)基稀釋兩倍(2×)情況下其產(chǎn)孢量不受影響，而當(dāng)稀釋倍數(shù)繼續(xù)加大，菌株ZC201301的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量受到顯著影響。

表2　不同馬唐含量CAJ培養(yǎng)基上菌株ZC201301的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢數(shù)量

2.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株ZC201301產(chǎn)孢的影響

以PDA和CAJ培養(yǎng)基為產(chǎn)孢培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)菌株ZC201301的產(chǎn)孢量。由表3可以看出，菌株ZC201301在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢較慢，產(chǎn)孢量在培養(yǎng)7 d時(shí)基本達(dá)到最大量3.3×107個(gè)，而該菌株在CAJ培養(yǎng)基上較短時(shí)間內(nèi)就能夠產(chǎn)生大量孢子，培養(yǎng)7 d后其產(chǎn)孢量已經(jīng)達(dá)到583.9×107個(gè)。

2.3光照時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢量的影響

以CAJ培養(yǎng)基為產(chǎn)孢培養(yǎng)基，研究光照時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)菌株ZC201301產(chǎn)孢量的影響。由表4可以看出，連續(xù)黑暗條件下產(chǎn)孢量最高，光照對(duì)產(chǎn)孢量有一定抑制作用，且隨著光照時(shí)間的增長(zhǎng)抑制作用更為明顯；另一方面光照時(shí)間的變化對(duì)于菌株氣生菌絲的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。

2.4培養(yǎng)溫度對(duì)菌株ZC201301生長(zhǎng)的影響

由表5可以看出，菌株ZC201301在PDA培養(yǎng)基上的最適生長(zhǎng)溫度在25～30℃，當(dāng)培養(yǎng)溫度≤20℃和>30℃時(shí)生長(zhǎng)速率和氣生菌絲產(chǎn)生量均受到明顯抑制。

2.5pH值對(duì)菌株ZC201301生長(zhǎng)的影響

由表6可以看出，菌株ZC201301在CAJ培養(yǎng)基上的最適生長(zhǎng)pH值為6～8，當(dāng)培養(yǎng)基pH值<6和>8時(shí)生長(zhǎng)速率和氣生菌絲產(chǎn)生量均受到明顯抑制。

表3　不同培養(yǎng)時(shí)間菌株ZC201301產(chǎn)孢量

表4　光照時(shí)長(zhǎng)對(duì)菌株ZC201301生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

表5　溫度對(duì)菌株ZC201301生長(zhǎng)的影響

表6　pH值對(duì)菌株ZC201301生長(zhǎng)的影響

表7　不同氣/液比值對(duì)菌株ZC201301生長(zhǎng)的影響

2.6氣/液對(duì)菌株ZC201301生長(zhǎng)的影響

圖1　菌株ZC201301在含不同碳氮源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率Fig.1　Growth rate of strain ZC201301 in different carbon and nitrogen sources　　　A:葡萄糖 Glucose;B:麥芽糖 Maltose;C:可溶性淀粉 Soluble starch;D:乳糖 Lactose;E:蔗糖 Sucrose;F:硝酸鈉 NaNO3;G:硝酸鉀 KNO3;H:硝酸鈣 Ca(NO3)2;I:硫酸銨 (NH4)2SO4;J:硝酸銨 NH4NO3. 不同字母表示在0.05 水平上差異顯著(n=3)。Different letters indicate that the difference is significant at the 0.05 level (n=3).

由表7可以看出，菌株ZC201301在氣/液為1∶0.5和1∶1時(shí)菌絲重量大，而當(dāng)氣/液為1∶2和1∶4時(shí)，菌株ZC201301生長(zhǎng)受限。

2.7碳氮源對(duì)菌株ZC201301生長(zhǎng)的影響

由圖1可以看出，菌株ZC201301最佳碳源為葡萄糖，但該菌株對(duì)碳源的要求不嚴(yán)格，在不同碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)差異不顯著；最佳氮源為硫酸銨，其對(duì)銨態(tài)氮源的利用好于硝態(tài)氮源。

2.8接種環(huán)境濕度對(duì)菌株ZC201301致病力的影響

濕度是限制菌株ZC201301發(fā)揮生防功能的重要限制因子。由表8可以看出，菌株ZC201301需要在較高的濕度下才能夠?qū)е埋R唐發(fā)病死亡，而當(dāng)接菌的環(huán)境濕度為60%時(shí)，其生防效果迅速下降。當(dāng)濕度為30%時(shí)，其鮮重抑制率僅為18.6%。

表8　不同濕度對(duì)菌株ZC201301生長(zhǎng)的影響

3討論

生防效果好、作物安全性高和易于工業(yè)化生產(chǎn)是真菌除草劑是否能夠開(kāi)發(fā)應(yīng)用的3個(gè)基本要素[15]。我們通過(guò)前期試驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證了菌株ZC201301對(duì)馬唐、反枝莧等雜草具有良好的生防效果，同時(shí)對(duì)小麥、玉米、大豆等作物安全。

本研究發(fā)現(xiàn)，菌株ZC201301能夠在多種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其可利用培養(yǎng)基范圍較廣，對(duì)培養(yǎng)材料的要求較為寬泛。菌株ZC201301最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基為馬唐汁液(CAJ)培養(yǎng)基，其在CAJ培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量迅速，培養(yǎng)7 d后其產(chǎn)孢量已經(jīng)達(dá)到PDA培養(yǎng)基的167倍。通過(guò)進(jìn)一步的研究，我們發(fā)現(xiàn)將CAJ培養(yǎng)基內(nèi)的馬唐量減少一倍，對(duì)其基本生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量沒(méi)有顯著影響。菌株ZC201301在25～30℃和pH 6～8條件下均能正常生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，其菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢所需溫度、酸堿度等范圍較廣，在多種環(huán)境條件下均能生長(zhǎng)；菌株ZC201301對(duì)碳源利用差異較小，該菌株較廣的環(huán)境適應(yīng)能力和較寬的生長(zhǎng)條件不僅有助于其工業(yè)化生產(chǎn)，而且對(duì)于其后期施用后在田間條件下存活和擴(kuò)展有重要意義。進(jìn)一步的篩選發(fā)現(xiàn)，接種前期的環(huán)境濕度是影響菌株ZC201301發(fā)揮生防效果的重要影響因子。當(dāng)環(huán)境濕度小于60%時(shí)，其生防效果顯著下降，而當(dāng)環(huán)境濕度小于30%時(shí)，其致病力受影響較大。

CAJ培養(yǎng)基以雜草馬唐為制作材料，雜草馬唐獲取方便，成本低廉，這些都是進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)的有利條件。同時(shí)，不同于先前發(fā)現(xiàn)的馬唐灰梨孢類生防菌[12]，菌株ZC201301產(chǎn)孢不需要光照等因素的誘導(dǎo)，而且長(zhǎng)時(shí)間的光照會(huì)影響其孢子的產(chǎn)生，這也可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化后期發(fā)酵生產(chǎn)條件，節(jié)約成本。綜合以上研究，菌株ZC201301符合雜草生防真菌要易于工業(yè)化生產(chǎn)的多個(gè)生物學(xué)條件，具有開(kāi)發(fā)為微生物除草劑的潛力，但是使用過(guò)程中要注意環(huán)境濕度。

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The biological characteristics ofDigitariasanguinalispathogenFusariumchlamydosporumstrain ZC201301

LI Jian1, LI Yan2, GAO Xing-Xiang1, FANG Feng1, LI Mei1*

1.InstituteofPlantProtection,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Ji’nan250100,China; 2.TheAgricultureBureauofYanzhou,Jining272100,China

Abstract:Fusarium chlamydosporum strain ZC201301 showed high herbicidal activity towards Digitaria sanguinalis. In the present study, the ‘single factor at a time’ method was used to determine biological characteristics of ZC201301. It was found that the optimal mycelial growth media were potato dextrose agar (PDA) and crabgrass leaf juice (CAJ), and the optimal temperature for mycelia growth ranged from 25 to 30℃. The optimal initial pH for culture media was 6-8. Strain ZC201301 can sporulate in a variety of media, but the optimal sporulation medium was CAJ. Mycelial growth did not differ significantly in fluorescent light from that in the dark, but darkness was beneficial for sporulation. The optimal carbon sources for mycelium growth was glucose, and the best nitrogen source was NH4NO3. Oxygen is essential for mycelial growth, and mycelial growth was inhibited when the liquid/gas ratio was less than 1∶1. The herbicidal activity of strain ZC201301 was sensitive to relative humidity, and was significantly decreased when humidity was less than 60%. These results indicate the strain ZC201301 is amenable to propagation, which is important for the preparation of bio-control agents and for their survival under field conditions.

Key words:Digitaria sanguinalis; Fusarium chlamydosporum; bioherbicides; biological characteristics

*通信作者

Corresponding author. E-mail: limei9909@163.com

作者簡(jiǎn)介：李健(1986-)，男，山東臨沂人，助理研究員，博士。E-mail：lijian910@163.com

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金(ZR2015CQ014)和國(guó)家863計(jì)劃(2011AA10A206)資助。

收稿日期：2015-08-28；改回日期：2015-11-09

DOI：10.11686/cyxb2015374

http://cyxb.lzu.edu.cn

李健，李巖，高興祥，房鋒，李美. 馬唐生防菌厚垣孢鐮刀菌ZC201301的生物學(xué)特性研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(3): 234-239.

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