◎付琴琴

（晉中市糧油檢測中心，山西 晉中 030600）

山藥為薯蕷科薯蕷屬植物薯蕷塊莖，為藥食同源保健食品，具有降血糖血脂、抗腫瘤、抗突變、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能[1]。學(xué)者們對本土山藥研究較多，如蛋白體內(nèi)和體外抗氧化活性[2]、免疫調(diào)節(jié)活性及對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的非競爭性抑制作用[3]。國內(nèi)學(xué)者研究主要集中于山藥種植技術(shù)、多糖提取及活性及深加工[4]等領(lǐng)域。本實驗以懷山藥（Dioscorea opposita polysaccharide，DOPS）為原料，研究其水溶性蛋白質(zhì)的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

懷山藥，產(chǎn)自河南溫縣；濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為分析純。

SPD80型凱氏定氮儀，北京三品科創(chuàng)儀器有限公司；DS-1型高速組織搗碎機，上海雙旭電子有限公司；DZKW-4型水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 測定方法

蛋白含量的測定均采用凱氏定氮法。

蛋白提取率=（提取液中蛋白濃度/山藥汁中蛋白濃度）×100%。

1.3 實驗方法

1.3.1 山藥汁樣品制取和山藥蛋白提取

懷山藥表面清洗擦凈，去皮，均漿，得到山藥汁樣品。取上述樣品10 mL于三角瓶，按一定水料比加入蒸餾水，一定溫度下提取一定時間，4 000 r/min離心10 min，取上清液。分別取10 mL山藥汁樣品和10 mL提取液進(jìn)行凱式定氮試驗。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定

蛋白含量[4]（g/mL）

式（1）中，V：消耗HCl，mL；V0：空白實驗時消耗的HCl，mL；N：HCl當(dāng)量濃度；A：固定系數(shù)，6.25；W：樣品體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥汁樣品蛋白含量測定結(jié)果

測定V為0.53 mL，V0為0.1 mL，N 為 0.01 mol/L。帶入公式（1）得山藥汁中蛋白質(zhì)含量為0.376 mg/mL。

2.2 單因素試驗

2.2.1 水料比選擇試驗

提取溫度55 ℃，提取時間60 min，水料比分別2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1和12∶1，提取1次，比較水料比對提取效果影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知水料比增大蛋白提取率也增大，水料比增至8∶1后提取率減小。水料比過低，水分加入量少，混合液黏度較高，蛋白不易析出。水料比過高，加水量多給后續(xù)濃縮增加工作量，確定水料比8∶1。

圖1 水料比對提取效果影響圖

2.2.2 提取溫度的選擇試驗

水料比6∶1，提取時間60 min，提取溫度分別為15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃和55℃，提取1次，考察提取溫度對提取效果影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨提取溫度提高蛋白提取率增大，達(dá)到35 ℃以后，提取率迅速減小。低溫條件下，蛋白質(zhì)不能充分溶于水，提取不充分；溫度升高，蛋白與水作用加強，提取率可能升高；溫度過高，蛋白結(jié)構(gòu)解體，蛋白分子變性凝固沉淀，確定提取溫度35 ℃。

圖2 提取溫度對提取效果影響圖

2.2.3 提取時間的選擇試驗

水料比6∶1，提取溫度55 ℃，依次提取30、60、90、120min和150min，提取1次，考察提取時間對提取效果影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知蛋白析出量最初隨時間增加上升，60 min后開始下降，下降幅度趨于平緩，表明開始時，蛋白析出速率快，之后降低可能與多糖、多酚等結(jié)合的蛋白還未析出；延長提取時間，細(xì)胞充分溶脹，蛋白質(zhì)易溶出；時間過長，蛋白顆粒間作用力增強，易變性凝集沉淀。確定提取時間為60 min。

圖3 提取時間對提取效果影響圖

2.2.4 提取次數(shù)的選擇試驗

水料比1∶6，提取溫度55 ℃，提取時間60 min，依次提取1、2、3、4和5次，考察提取次數(shù)對提取效果影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，提取1次蛋白提取率最高，隨著提取次數(shù)增加，提取率急劇下降，以提取1次為宜。

圖4 提取次數(shù)對提取效果影響圖

2.3 響應(yīng)面分析及提取工藝優(yōu)化

2.3.1 數(shù)學(xué)模型建立與檢驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，提取1次蛋白提取率最高，選擇水料比、提取溫度和提取時間3個因素，利用Design-Expert 7.1.6軟件中心組合設(shè)計選項，共有17個試驗點，響應(yīng)面分析因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

對17個試驗點的結(jié)果統(tǒng)計分析，得到二次回歸方程：

各變量對響應(yīng)值影響顯著程度由F檢驗判定，P值越小，顯著程度越高[5]。該試驗?zāi)Ｐ头匠蘁值13.03，P＜0.05，整體模型顯著，失擬項不顯著，說明該回歸模型可靠，與實測值擬合良好，可用于蛋白提取條件分析和預(yù)測。

2.3.2 各因素影響程度分析

F值大小可判定各因素對蛋白提取率影響程度。F值越大對指標(biāo)影響越強[6]。對個因素進(jìn)行回歸方程方差分析，結(jié)果見表2。表2中，F(xiàn)Xl=55.93，F(xiàn)X2=4.94，F(xiàn)X3=2.61，各因素影響程度順序為：水料比＞提取溫度＞提取時間。方程一次項X1回歸系數(shù)極顯著，說明水料比對蛋白提取率有極顯著影響；交互項中的X1X3項表現(xiàn)出了高度顯著水平，說明水料比和提取時間的交互作用對提取率有顯著影響。

表2 回歸方程方差分析表

2.3.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖能直觀反映各因素對響應(yīng)值影響及交互作用程度[7]。為考察交互作用對蛋白提取率影響，對模型降維分析。經(jīng)Design-Expert 7.1.6軟件分析，可得到二次方程響應(yīng)曲面圖，如圖5、圖6、圖7所示。

由圖5-7可知，在所選試驗范圍內(nèi)，各因素均有極點；曲面陡峭程度可看出水料比影響最大，提取溫度次之，提取時間影響最??；等高線圖近似橢圓形，說明因素間有一定交互作用，結(jié)果與回歸分析吻合[8]。

圖 5 Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面

圖 6 Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面

圖 7 Y=f（X1，X3）的響應(yīng)面

2.3.4 模型驗證

為驗證響應(yīng)面法的可靠性，采用最優(yōu)條件試驗，水料比8.25∶1，提取溫度35.18 ℃，提取時間60.26 min，提取次數(shù)1次，試驗重復(fù)3次，實際測得蛋白含量0.244 mg/mL，蛋白提取率64.9%，理論預(yù)測值0.253 mg/mL，蛋白提取率65.4%，相對誤差為－0.7%。

3 結(jié)論

懷山藥水溶性蛋白提取單因素試驗和響應(yīng)面試驗確定最佳工藝條件為水液料比8.25∶1，提取溫度35.18 ℃，提取時間60.26 min，提取次數(shù)1次，蛋白質(zhì)提取率可達(dá)到64.9%。

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