周云曉，董玲燕，趙麗娟，方　明，王進(jìn)波*

（1.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，浙江寧波　315100；2.寧波中藥制藥有限公司，浙江寧波　315806）

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姜黃提取物對畜禽病原菌的抑制作用

周云曉1，董玲燕2，趙麗娟2，方明2，王進(jìn)波1*

（1.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，浙江寧波315100；2.寧波中藥制藥有限公司，浙江寧波315806）

摘要：采用水蒸氣蒸餾法和索氏提取法提取姜黃揮發(fā)油，采用80％乙醇浸提、結(jié)晶法制備姜黃素。利用濾紙片固相擴(kuò)散法研究了3種姜黃提取物對6種畜禽病原菌的抑菌活性；利用平板涂布法研究了姜黃提取物對6種病原菌的的最低抑菌濃度。結(jié)果表明，兩種姜黃揮發(fā)油和姜黃素對畜禽病原菌具有一定抑菌活性，姜黃揮發(fā)油的抑菌效果好于姜黃素，其中水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油抑菌效果最佳。3種提取物對致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門菌、豬傷寒沙門菌、豬鏈球菌和志賀氏菌的最低抑菌濃度分別為：水蒸汽蒸餾姜黃揮發(fā)油6.25、6.25、12.5、6.25、12.5、6.25 mg·mL(-1)；索氏提取姜黃揮發(fā)油12.5、12.5、25.0、12.5、25.0、12.5 mg·mL(-1)；姜黃素50.0、100.0、50.0、25.0、100.0、50.0 mg·mL(-1)。

關(guān)鍵詞：姜黃；揮發(fā)油；姜黃素；病原菌；抑制作用

姜黃是一種傳統(tǒng)中藥，能行氣破瘀，通經(jīng)止痛。主治胸腹脹痛，肩臂痹痛，心痛難忍，產(chǎn)后血痛，瘡癬初發(fā)，月經(jīng)不調(diào)，跌打損傷等。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，姜黃具有抑制腫瘤、降低血脂、抗菌消炎、護(hù)肝利膽和防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種功效[1]。姜黃中研究最廣泛、最深入的活性成分是姜黃素，該成分作為治療許多疾病的藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，有望開發(fā)成為新型藥物。近年來，針對姜黃在畜禽飼料中的應(yīng)用已進(jìn)行了大量研究，研究表明姜黃素能夠促進(jìn)動物生長，提高動物產(chǎn)品質(zhì)量，預(yù)防和控制疾病的發(fā)生，是一種具有廣闊前景的飼料添加劑[2-3]。作為姜黃中含量最為豐富的成分，姜黃揮發(fā)油與其他植物揮發(fā)油相似，是一種由多種成分組成的天然植物精油，具有抗菌、抗氧化、抗應(yīng)激等多種生物學(xué)功能，但其在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用研究較少。本研究利用不同方法提取制備了姜黃揮發(fā)油和姜黃素，并比較了這些成分對畜禽主要病原菌的抑制作用。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門菌、豬傷寒沙門菌、豬鏈球菌、志賀氏菌由實(shí)驗(yàn)室保存。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1、酵母浸粉5g·L-1、NaCl 10 g·L-1。固體LB培養(yǎng)基中另加15 g·L-1瓊脂粉。上述培養(yǎng)基按常規(guī)方法，高壓滅菌后，置4℃冰箱保存，備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1水蒸汽蒸餾法提取姜黃揮發(fā)油

取粉碎至40目的姜黃粉末50 g，置于1 000 mL平底燒瓶中，加入適量的蒸餾水使其潤濕，水蒸氣蒸餾約4 h，收集水—姜黃揮發(fā)油餾出液，將餾出液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用石油醚（30～60℃）分次萃取，萃取液加入適量的無水硫酸鈉低溫干燥24 h后過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去石油醚，收集揮發(fā)油并稱重。

1.2.2索氏提取法提取姜黃揮發(fā)油

取粉碎至40目的姜黃粉末50 g，用濾紙包成小包放入索氏提取器中，提取瓶內(nèi)加入石油醚200 mL，然后固定在鐵架臺上，置于55～60℃恒溫水浴鍋中，同時(shí)冷凝水回流至提取器中液體無色，取出提取液，加無水硫酸鈉低溫干燥24 h過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去濾液中的石油醚，收集揮發(fā)油并稱重。

1.2.3姜黃素的提取

取粉碎至40目的姜黃粉與80％乙醇以質(zhì)量體積比1?5～1?10混合均勻，200 r·min-1，提取2 h，過濾并收集濾液，重復(fù)提取3次，將3次提取的濾液合并。濃縮至飽和，置于4℃結(jié)晶，收集晶體，得純度≥95％的精制姜黃素。

1.2.4菌體懸液及平板的制備

將供試菌分別從4℃冰箱中取出，接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上活化后，用無菌接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上分別挑取各供試菌，將細(xì)菌接種在LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h。通過平板計(jì)數(shù)法，確定菌液的稀釋度，使最后的菌懸液含量為107cfu·mL-1，待用。

1.2.5不同姜黃提取物的抑菌效果

用無菌移液槍吸取上述菌懸液200 μL于固體培養(yǎng)基表面上，用無菌涂布棒涂布均勻。用無菌鑷子夾取滅菌圓形濾紙片（直徑6 mm），分別浸于30.0 mg·mL- 1的姜黃素、姜黃揮發(fā)油（索氏提取）、姜黃揮發(fā)油（水蒸汽蒸餾）中，20 min后取出、瀝干，將上述濾紙片輕輕貼在固體平板上，每個培養(yǎng)皿貼3片，每組做3個平行。姜黃揮發(fā)油以1％的吐溫-80水溶液作為對照，姜黃素以含有等濃度二甲亞砜的蒸餾水作為對照，同時(shí)設(shè)置一個無菌濾紙片的培養(yǎng)皿作為空白對照，放入恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量，并計(jì)算抑菌圈直徑大小的平均值。

抑菌圈直徑大?。ê瑸V紙片直徑）在7～9 mm時(shí)為低度敏感抑菌作用；在10～15 mm時(shí)，為中度敏感抑菌作用；抑菌圈直徑大小>15 mm時(shí)有高度敏感抑菌作用，無抑菌圈或抑菌圈直徑<5 mm為無抑菌作用。

1.2.6姜黃提取物最低抑菌濃度的測定

用吐溫-80水溶液（1％）稀釋成不同濃度（100.0、50.0、25.0、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 mg·mL-1）的姜黃揮發(fā)油稀釋液；姜黃素以適量二甲亞砜溶解后，用蒸餾水配制成不同濃度（100.0、50.0、25.0、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 mg·mL-1）的姜黃素溶液。菌懸液與各濃度揮發(fā)油的稀釋液（或姜黃素溶液）1?1混合均勻成為混合液。取0.2 mL混合液于平板中，涂布均勻，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察菌體生長情況，生長菌體為陽性（+），不生長菌體為陰性（-），以不生長菌體的最低濃度為該成分的最低抑菌濃度（MIC）。姜黃揮發(fā)油以1 ％的吐溫-80水溶液為對照，姜黃素以含有等濃度二甲亞砜的蒸餾水為對照，每個處理重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1不同姜黃提取物的抑菌效果

不同姜黃提取物的抑菌效果見表1。

表1　不同姜黃提取物的抑菌效果　mm

本研究利用濾紙片法，分析了30.0 mg·mL-1不同姜黃提取物對致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門菌、豬傷寒沙門菌、豬鏈球菌、志賀氏菌等畜禽致病菌的抑菌效果，結(jié)果表明，姜黃揮發(fā)油對供試菌的抑菌效果明顯好于姜黃素，而且水蒸汽蒸餾提取的姜黃揮發(fā)油的抑菌效果明顯好于索氏提取的姜黃揮發(fā)油。致病性大腸桿菌對兩種姜黃揮發(fā)油均高度敏感，豬傷寒沙門氏菌和志賀氏菌對水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油也高度敏感；其余菌株對兩種姜黃揮發(fā)油均為中度敏感。致病性大腸桿菌、雞白痢沙門菌、豬傷寒沙門菌、和志賀氏菌對姜黃素低度敏感，而金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌則對姜黃素不敏感。

2.2水蒸汽蒸餾提取的姜黃揮發(fā)油對各種供試菌的最低抑菌濃度

水蒸汽蒸餾提取的姜黃揮發(fā)油對供試菌的MIC見表2。

由表2可知，水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油對致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門菌、豬傷寒沙門菌、豬鏈球菌和志賀氏菌的MIC存在差異，其中致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬傷寒沙門菌和志賀氏菌的MIC值較低，對雞白痢沙門菌和豬鏈球菌MIC值則較高。

2.3索氏提取的姜黃揮發(fā)油對各種供試菌的最低抑菌濃度

索氏提取的姜黃揮發(fā)油對供試菌的MIC見表3。

由表3可知，索氏提取的姜黃揮發(fā)油對致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬傷寒沙門菌和志賀氏菌的MIC值較低；對雞白痢沙門氏菌和豬鏈球菌的MIC值較高。由表2、3可知，索氏提取的姜黃揮發(fā)油比水蒸氣蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油的抗菌能力低。

2.4姜黃素對各種供試菌的最低抑菌濃度

姜黃素對供試菌的MIC見表4。

表2　水蒸汽蒸餾提取的姜黃揮發(fā)油對供試菌的最低抑菌濃度

表3　索氏提取的姜黃揮發(fā)油對供試菌的最低抑菌濃度

表4　姜黃素對供試菌的MIC

由表4可知，姜黃素對畜禽病原菌的MIC明顯高于姜黃揮發(fā)油，說明姜黃素的抑菌效果明顯比姜黃揮發(fā)油差。

3　討論

本研究比較了不同姜黃提取物對致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門菌、豬傷寒沙門菌、豬鏈球菌和志賀氏菌等畜禽病原菌的抑制作用，結(jié)果表明，水蒸汽蒸餾法提取的姜黃揮發(fā)油抑菌效果最好，索氏提取法提取的姜黃揮發(fā)油的抑菌效果次之，姜黃素的抑菌效果最差。

不同研究者對姜黃提取物的抗菌活性進(jìn)行探索，結(jié)果表明，姜黃揮發(fā)油和姜黃素對細(xì)菌、真菌、酵母菌等多種微生物均具有抑制作用。杜青云等研究姜黃揮發(fā)油對紅色毛癬菌等真菌的抑制作用，結(jié)果表明，姜黃揮發(fā)油對引起人類皮膚癬菌病的真菌具有極強(qiáng)的抑菌作用[4]。胡小軍等研究發(fā)現(xiàn)，石油醚提取的姜黃揮發(fā)油能夠抑制金黃色葡萄球菌、黑曲霉陽性菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的生長[5]。齊莉莉等對姜黃提取物抑菌作用的研究表明，姜黃揮發(fā)油能夠顯著抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和青霉菌的生長[6]。李曉鵬研究證明，姜黃素和姜黃揮發(fā)油對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、白地霉均有抑制作用[7]。夏承來等測定姜黃素對淋球菌的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素對淋球菌有明顯抑菌效果，其最小抑菌濃度是100 mg·mL-1[8]。本研究分析姜黃提取物對主要畜禽致病菌抑制作用，結(jié)果與上述研究結(jié)論一致，姜黃揮發(fā)油和姜黃素均具有較好抗菌效果。

本研究比較水蒸汽蒸餾提取的姜黃揮發(fā)油、索氏提取姜黃揮發(fā)油和姜黃素抑菌效果差異，測定3種提取物的MIC。結(jié)果表明，水蒸汽蒸餾提取的姜黃揮發(fā)油抑菌效率最高，索氏提取的姜黃揮發(fā)油次之，姜黃素的抑菌效率最低。姜黃揮發(fā)油與一般植物揮發(fā)油類似，其化學(xué)組成成分主要以萜類化合物為主，含有姜油烯、龍腦（2-莰醇）、水芹烯、姜黃酮、姜黃素等多種化學(xué)成分，這些化學(xué)成分均具有抑菌效果，其多種成分的組合就具有很強(qiáng)的抑菌作用。而姜黃素是1種二酮類化合物，其具有一定抗菌效果，僅為1種成分，故其抗菌能力沒有姜黃揮發(fā)油高。與水蒸汽蒸餾法獲得的姜黃揮發(fā)油相比，索氏提取的姜黃揮發(fā)油中脂溶性色素等成分的含量較高，這些色素沒有抗菌活性，因此，索氏提取的姜黃揮發(fā)油抗菌效率低于水蒸汽蒸餾提取的姜黃揮發(fā)油。

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Antimicrobial Activities of the Extracts from Curcumalonga on Livestock and Poultry Pathogenic Bacteria

ZHOU Yunxiao1,DONG Lingyan2,ZHAO Lijuan2,FANG Ming2,WANG Jinbo1*
（1.Ningbo Institute of Technology,Zhejiang University,Ningbo 315100,Zhejiang China; 2.Ningbo Traditional Chinese Pharmaceutical Co.,Ltd.,Ningbo 315806,Zhejiang China）

Abstract:The volatile oil was extracted from Curcuma longa by water steam distillation and Soxhlet method.Curcumin was extracted with 80％ ethanol.The antimicrobial activities of three turmeric extracts were determined by plate diffuse to six pathogenic bacteria.The minimum inhibitory concentration of the extracts was investigated by plate spread.The results indicated that all the 3 kinds of extracts showed antibacterial activity.Compared with the antimicrobial activity of curcumin,the volatile oils showed stronger antimicrobial activity.The minimum inhibitory concentration of Escherichia coli O157,Staphylocous aureus,Salmonella pullorum,Salmonella typhisuis,Streptococ?cus suis and Shigella Castellani was as followed.The volatile oil extracted by water steam distillation was 6.25,6.25,12.5,6.25,12.5 and 6.25 mg·mL(-1); the volatile oil extracted by Soxhlet method was 12.5,12.5,25.0,12.5,25.0 and 12.5 mg·mL(-1); curcumin was 50.0,100.0,50.0,25.0,100.0 and 50.0 mg·mL(-1).

Key words:Curcuma longa; volatile oil; curcumin; pathogenic bacteria; antimicrobial activities

*通訊作者：E-mail:178283261@qq.com。

作者簡介：周云曉（1994-），女，浙江紹興人，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取及功能。

基金項(xiàng)目：寧波市重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（2014B11005；2013C11031）

收稿日期：2016-01-23

中圖分類號：R286；S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-0084（2016）03-0044-04