蘇建偉　蔣旗　黃桂柳　鄧志華　胡高裕　周喜漢　王統(tǒng)華

[摘要]目的 探討苦參堿對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞化療藥物敏感性及自噬水平的影響。方法 分別采用濃度為0.5mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml苦參堿作用于結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8/VCR，分別在24 h、48 h，采用CCK-8法檢測(cè)苦參堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8及其耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR的抑制作用，并計(jì)算出抑制率：運(yùn)用Western Blotting檢測(cè)自噬相關(guān)基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)苦參堿作用耐藥細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果在苦參堿作用24 h和48 h后，HCT-8細(xì)胞增殖的抑制作用隨著苦參堿濃度的增加而增強(qiáng)，苦參堿對(duì)HCT-8細(xì)胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。對(duì)各組細(xì)胞的凋亡率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，采用苦參堿的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率大大高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。在苦參堿應(yīng)用24 h后，HCT-8/VCR細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了自噬泡。Western Blotting檢測(cè)顯示隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達(dá)水平也隨之增強(qiáng)。結(jié)論苦參堿能夠提高結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的自噬水平，逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR的多藥耐藥性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

[關(guān)鍵詞]苦參堿；結(jié)腸癌；耐藥細(xì)胞化療藥物敏感型；自噬水平

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率一直居高不下。結(jié)腸癌患者死亡率高的主要原因是化療過(guò)程中細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性。結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等作用及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致化療藥物的敏感性降低，從而產(chǎn)生耐藥性。常見(jiàn)的耐藥途徑如抗凋亡、藥物靶點(diǎn)或代謝酶改變、自噬及結(jié)腸癌細(xì)胞過(guò)度增殖等都是化療藥物產(chǎn)生抗藥性的主要機(jī)制。許多學(xué)者對(duì)多藥耐藥性的抑制劑進(jìn)行了長(zhǎng)久的探索，近年來(lái)中醫(yī)藥抗腫瘤作用的研究備受關(guān)注，尤其在逆轉(zhuǎn)化療耐藥方面?？鄥A是由豆科植物類提取的生物堿，具有抗腫瘤、抗肝纖維化、治療病毒性肝炎、心肌炎等作用，但在結(jié)腸癌自噬方面研究相對(duì)較少。本研究觀察苦參堿對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的化療藥物敏感性及自噬水平的影響，旨在為臨床應(yīng)用苦參堿干預(yù)腫瘤機(jī)理提供依據(jù)。

1.資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、電熱干燥箱、高壓蒸汽消毒器、冰箱、液氮容器、濾器、真空泵、顯微鏡、天平、高速低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、勻漿器、電泳儀、電泳槽、微波爐、平底燒瓶、凝膠成像儀等儀器。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1CCK-8法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8/VCR、HCT-8細(xì)胞，按細(xì)胞傳代方法制備細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將2組細(xì)胞接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)組加入化療藥長(zhǎng)春新堿及5-FU、阿霉素（ADM），空白對(duì)照及陰性組加等體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)一段時(shí)問(wèn)后觀察細(xì)胞株的耐藥情況。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)苦參堿干預(yù)后HCT-8/VCR細(xì)胞藥敏性的變化 根據(jù)耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR的多藥耐藥性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.制備HCT-8/VCR+Ma細(xì)胞。各取1瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8/VCR及HCT-8/VCR+Ma細(xì)胞，每組分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制濃度效應(yīng)曲線.求回歸方程.得出50%抑制濃度（IC50）。計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)：逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/Ma作用后耐藥細(xì)胞IC50。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)苦參堿作用耐藥細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8/VCR及HCT-8細(xì)胞，將2組細(xì)胞接種于6孔板，每組細(xì)胞分別設(shè)2個(gè)組：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組中加入上述適宜濃度的Ma，對(duì)照組不經(jīng)任何處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，實(shí)驗(yàn)組加人不同濃度的化療藥長(zhǎng)春新堿.對(duì)照組中的耐藥組加入同濃度、等量長(zhǎng)春新堿，對(duì)照組的親本細(xì)胞組不做任何處理作為陰性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出細(xì)胞用FCM法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4Western Blotting檢測(cè)自噬相關(guān)基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá) 取處于生長(zhǎng)期的HCT-8/VCR，分到2個(gè)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)48 h，1瓶為實(shí)驗(yàn)組，加人無(wú)毒性濃度的Ma.1瓶為陰性對(duì)照組.加人等量培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用RIPI細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白質(zhì)樣品，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。之后對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、SDS-PAGE電泳、封閉與雜交，最后曝光鑒定自噬相關(guān)基因的表達(dá)。

1.2.5MDC法檢測(cè)單用長(zhǎng)春新堿或苦參堿或者兩者聯(lián)合應(yīng)用后自噬囊泡的形成 按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，干預(yù)48 h后，用PBS洗2次，加適量0.05mmo]/L的MDC染液于37℃溫育1 h.4%多聚甲醛固定15 min.棄甲醛晾干后.熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬囊泡的形成情況，計(jì)數(shù)，拍照。

1.3評(píng)價(jià)指標(biāo) （1）在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（optical density，OD）值，計(jì)算5個(gè)復(fù)孔平均OD值.計(jì)算Ma作用48 h后對(duì)HCT-8/VCR、HCT-8細(xì)胞的抑制率（inhibition rate，IR）。計(jì)算公式：IR（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）]×100%。不同濃度的抑制率分別為5個(gè)復(fù)孔細(xì)胞抑制率的平均值；（2）對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率分別為6個(gè)孔細(xì)胞凋亡率的平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組方差齊性采用t檢驗(yàn)，兩組方差不齊采用t檢驗(yàn)。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩兩比較采用q檢驗(yàn)（Newman-Keuls法），檢驗(yàn)水準(zhǔn)：a=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2.結(jié)果

2.1苦參堿的不同濃度對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞增殖的抑制率 在苦參堿作用24 h和48 h后，苦參堿對(duì)HCT-8細(xì)胞增殖有抑制作用且其抑制作用會(huì)隨著苦參堿濃度的增加而增強(qiáng)。與濃度為0.5 mg/ml相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表1。

2.2FCM檢測(cè)苦參堿作用后兩組細(xì)胞HCT-8/VCR的凋亡率比較 運(yùn)用FCM方法對(duì)各組細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn).采用苦參堿的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率大大高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），說(shuō)明苦參堿可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)表2。

2.3Western Blotting檢測(cè)結(jié)果 在苦參堿應(yīng)用24 h后，HCT-8/VCR細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了帶有細(xì)胞器的泡狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)確認(rèn)為自噬泡。Western Blotting檢測(cè)顯示隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達(dá)水平也隨之增強(qiáng)。

3.討論

近年來(lái)有關(guān)中醫(yī)藥治療肝癌的研究取得較大進(jìn)展，成為臨床實(shí)驗(yàn)研究熱點(diǎn)之一，中藥因其低毒、高效與多階段性作用的優(yōu)勢(shì)，已在腫瘤化療耐藥逆轉(zhuǎn)方法的研究中逐步受到重視?？鄥A（Matrine）是一種從我國(guó)傳統(tǒng)中藥苦參、廣豆根中提取的生物堿。前期研究表明苦參堿對(duì)結(jié)腸癌患者的恢復(fù)有促進(jìn)作用.它可以使hTERT表達(dá)下調(diào).抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和端粒酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究運(yùn)用苦參堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8/VCR進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有抗腫瘤的藥理活性，能抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、增殖、誘導(dǎo)其凋亡及向正常細(xì)胞分化。苦參堿作用24 h和48 h，HCT-8細(xì)胞增殖的抑制作用隨著苦參堿濃度的增加而增強(qiáng).對(duì)HCT-8細(xì)胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。運(yùn)用FCM方法對(duì)各組細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，采用苦參堿的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率大大高于對(duì)照組，說(shuō)明苦參堿可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。在苦參堿應(yīng)用24 h后，HCT-8/VCR細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了帶有細(xì)胞器的泡狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)確認(rèn)為自噬泡?？鄥A是一類獨(dú)特的生物堿，具有抗肝纖維化、抗腫瘤、治療病毒性肝炎、心肌炎等作用，近年來(lái)其抗腫瘤作用的研究備受關(guān)注，尤其在逆轉(zhuǎn)化療耐藥方面。自噬在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用。自噬可以使結(jié)腸癌細(xì)胞的適應(yīng)凋亡刺激、耐受侵襲性以及營(yíng)養(yǎng)缺乏的能力提高，在某種程度下會(huì)引起結(jié)腸癌的發(fā)生。有研究證實(shí)：在早期和進(jìn)展期結(jié)腸癌中關(guān)鍵蛋白LC3和Beclin-1表達(dá)升高，使結(jié)直腸癌核心部位細(xì)胞可以耐受營(yíng)養(yǎng)缺乏和缺氧。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的主要途徑，是促進(jìn)患者化療成功的重要因素。在大多數(shù)情況下，自噬與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性密切相關(guān)，抑制自噬就可以增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高患者的化療效果。以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在LC3細(xì)胞形態(tài)學(xué)、染色等方面苦參堿能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生自噬。我們用Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達(dá)水平也隨之增強(qiáng)，與上述文獻(xiàn)結(jié)果相一致。本研究對(duì)苦參堿在結(jié)腸癌自噬方面也進(jìn)行了分析，為臨床應(yīng)用苦參堿干預(yù)腫瘤機(jī)理提供依據(jù)，但此次研究仍存在樣本例數(shù)較少等諸多不足，有必要擴(kuò)大樣本例數(shù)進(jìn)一步觀察。

綜上所述，苦參堿能夠提高結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的自噬水平，逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR的多藥耐藥性，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞的增殖，為臨床應(yīng)用苦參堿抗腫瘤提供理論依據(jù)。

蘇建偉　蔣旗　黃桂柳　鄧志華　胡高?！≈芟矟h　王統(tǒng)華

[摘要]目的 探討苦參堿對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞化療藥物敏感性及自噬水平的影響。方法 分別采用濃度為0.5mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml苦參堿作用于結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8/VCR，分別在24 h、48 h，采用CCK-8法檢測(cè)苦參堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8及其耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR的抑制作用，并計(jì)算出抑制率：運(yùn)用Western Blotting檢測(cè)自噬相關(guān)基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)苦參堿作用耐藥細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果在苦參堿作用24 h和48 h后，HCT-8細(xì)胞增殖的抑制作用隨著苦參堿濃度的增加而增強(qiáng)，苦參堿對(duì)HCT-8細(xì)胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。對(duì)各組細(xì)胞的凋亡率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，采用苦參堿的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率大大高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。在苦參堿應(yīng)用24 h后，HCT-8/VCR細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了自噬泡。Western Blotting檢測(cè)顯示隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達(dá)水平也隨之增強(qiáng)。結(jié)論苦參堿能夠提高結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的自噬水平，逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR的多藥耐藥性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

[關(guān)鍵詞]苦參堿；結(jié)腸癌；耐藥細(xì)胞化療藥物敏感型；自噬水平

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率一直居高不下。結(jié)腸癌患者死亡率高的主要原因是化療過(guò)程中細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性。結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等作用及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致化療藥物的敏感性降低，從而產(chǎn)生耐藥性。常見(jiàn)的耐藥途徑如抗凋亡、藥物靶點(diǎn)或代謝酶改變、自噬及結(jié)腸癌細(xì)胞過(guò)度增殖等都是化療藥物產(chǎn)生抗藥性的主要機(jī)制。許多學(xué)者對(duì)多藥耐藥性的抑制劑進(jìn)行了長(zhǎng)久的探索，近年來(lái)中醫(yī)藥抗腫瘤作用的研究備受關(guān)注，尤其在逆轉(zhuǎn)化療耐藥方面?？鄥A是由豆科植物類提取的生物堿，具有抗腫瘤、抗肝纖維化、治療病毒性肝炎、心肌炎等作用，但在結(jié)腸癌自噬方面研究相對(duì)較少。本研究觀察苦參堿對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的化療藥物敏感性及自噬水平的影響，旨在為臨床應(yīng)用苦參堿干預(yù)腫瘤機(jī)理提供依據(jù)。

1.資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、電熱干燥箱、高壓蒸汽消毒器、冰箱、液氮容器、濾器、真空泵、顯微鏡、天平、高速低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、勻漿器、電泳儀、電泳槽、微波爐、平底燒瓶、凝膠成像儀等儀器。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1CCK-8法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8/VCR、HCT-8細(xì)胞，按細(xì)胞傳代方法制備細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將2組細(xì)胞接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)組加入化療藥長(zhǎng)春新堿及5-FU、阿霉素（ADM），空白對(duì)照及陰性組加等體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)一段時(shí)問(wèn)后觀察細(xì)胞株的耐藥情況。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)苦參堿干預(yù)后HCT-8/VCR細(xì)胞藥敏性的變化 根據(jù)耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR的多藥耐藥性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.制備HCT-8/VCR+Ma細(xì)胞。各取1瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8/VCR及HCT-8/VCR+Ma細(xì)胞，每組分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制濃度效應(yīng)曲線.求回歸方程.得出50%抑制濃度（IC50）。計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)：逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/Ma作用后耐藥細(xì)胞IC50。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)苦參堿作用耐藥細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8/VCR及HCT-8細(xì)胞，將2組細(xì)胞接種于6孔板，每組細(xì)胞分別設(shè)2個(gè)組：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組中加入上述適宜濃度的Ma，對(duì)照組不經(jīng)任何處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，實(shí)驗(yàn)組加人不同濃度的化療藥長(zhǎng)春新堿.對(duì)照組中的耐藥組加入同濃度、等量長(zhǎng)春新堿，對(duì)照組的親本細(xì)胞組不做任何處理作為陰性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出細(xì)胞用FCM法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4Western Blotting檢測(cè)自噬相關(guān)基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá) 取處于生長(zhǎng)期的HCT-8/VCR，分到2個(gè)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)48 h，1瓶為實(shí)驗(yàn)組，加人無(wú)毒性濃度的Ma.1瓶為陰性對(duì)照組.加人等量培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用RIPI細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白質(zhì)樣品，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。之后對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、SDS-PAGE電泳、封閉與雜交，最后曝光鑒定自噬相關(guān)基因的表達(dá)。

1.2.5MDC法檢測(cè)單用長(zhǎng)春新堿或苦參堿或者兩者聯(lián)合應(yīng)用后自噬囊泡的形成 按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，干預(yù)48 h后，用PBS洗2次，加適量0.05mmo]/L的MDC染液于37℃溫育1 h.4%多聚甲醛固定15 min.棄甲醛晾干后.熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬囊泡的形成情況，計(jì)數(shù)，拍照。

1.3評(píng)價(jià)指標(biāo) （1）在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（optical density，OD）值，計(jì)算5個(gè)復(fù)孔平均OD值.計(jì)算Ma作用48 h后對(duì)HCT-8/VCR、HCT-8細(xì)胞的抑制率（inhibition rate，IR）。計(jì)算公式：IR（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）]×100%。不同濃度的抑制率分別為5個(gè)復(fù)孔細(xì)胞抑制率的平均值；（2）對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率分別為6個(gè)孔細(xì)胞凋亡率的平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組方差齊性采用t檢驗(yàn)，兩組方差不齊采用t檢驗(yàn)。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩兩比較采用q檢驗(yàn)（Newman-Keuls法），檢驗(yàn)水準(zhǔn)：a=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2.結(jié)果

2.1苦參堿的不同濃度對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞增殖的抑制率 在苦參堿作用24 h和48 h后，苦參堿對(duì)HCT-8細(xì)胞增殖有抑制作用且其抑制作用會(huì)隨著苦參堿濃度的增加而增強(qiáng)。與濃度為0.5 mg/ml相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表1。

2.2FCM檢測(cè)苦參堿作用后兩組細(xì)胞HCT-8/VCR的凋亡率比較 運(yùn)用FCM方法對(duì)各組細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn).采用苦參堿的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率大大高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），說(shuō)明苦參堿可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)表2。

2.3Western Blotting檢測(cè)結(jié)果 在苦參堿應(yīng)用24 h后，HCT-8/VCR細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了帶有細(xì)胞器的泡狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)確認(rèn)為自噬泡。Western Blotting檢測(cè)顯示隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達(dá)水平也隨之增強(qiáng)。

3.討論

近年來(lái)有關(guān)中醫(yī)藥治療肝癌的研究取得較大進(jìn)展，成為臨床實(shí)驗(yàn)研究熱點(diǎn)之一，中藥因其低毒、高效與多階段性作用的優(yōu)勢(shì)，已在腫瘤化療耐藥逆轉(zhuǎn)方法的研究中逐步受到重視。苦參堿（Matrine）是一種從我國(guó)傳統(tǒng)中藥苦參、廣豆根中提取的生物堿。前期研究表明苦參堿對(duì)結(jié)腸癌患者的恢復(fù)有促進(jìn)作用.它可以使hTERT表達(dá)下調(diào).抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和端粒酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究運(yùn)用苦參堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8/VCR進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有抗腫瘤的藥理活性，能抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、增殖、誘導(dǎo)其凋亡及向正常細(xì)胞分化?？鄥A作用24 h和48 h，HCT-8細(xì)胞增殖的抑制作用隨著苦參堿濃度的增加而增強(qiáng).對(duì)HCT-8細(xì)胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。運(yùn)用FCM方法對(duì)各組細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，采用苦參堿的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率大大高于對(duì)照組，說(shuō)明苦參堿可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。在苦參堿應(yīng)用24 h后，HCT-8/VCR細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了帶有細(xì)胞器的泡狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)確認(rèn)為自噬泡?？鄥A是一類獨(dú)特的生物堿，具有抗肝纖維化、抗腫瘤、治療病毒性肝炎、心肌炎等作用，近年來(lái)其抗腫瘤作用的研究備受關(guān)注，尤其在逆轉(zhuǎn)化療耐藥方面。自噬在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用。自噬可以使結(jié)腸癌細(xì)胞的適應(yīng)凋亡刺激、耐受侵襲性以及營(yíng)養(yǎng)缺乏的能力提高，在某種程度下會(huì)引起結(jié)腸癌的發(fā)生。有研究證實(shí)：在早期和進(jìn)展期結(jié)腸癌中關(guān)鍵蛋白LC3和Beclin-1表達(dá)升高，使結(jié)直腸癌核心部位細(xì)胞可以耐受營(yíng)養(yǎng)缺乏和缺氧。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的主要途徑，是促進(jìn)患者化療成功的重要因素。在大多數(shù)情況下，自噬與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性密切相關(guān)，抑制自噬就可以增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高患者的化療效果。以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在LC3細(xì)胞形態(tài)學(xué)、染色等方面苦參堿能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生自噬。我們用Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達(dá)水平也隨之增強(qiáng)，與上述文獻(xiàn)結(jié)果相一致。本研究對(duì)苦參堿在結(jié)腸癌自噬方面也進(jìn)行了分析，為臨床應(yīng)用苦參堿干預(yù)腫瘤機(jī)理提供依據(jù)，但此次研究仍存在樣本例數(shù)較少等諸多不足，有必要擴(kuò)大樣本例數(shù)進(jìn)一步觀察。

綜上所述，苦參堿能夠提高結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的自噬水平，逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR的多藥耐藥性，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞的增殖，為臨床應(yīng)用苦參堿抗腫瘤提供理論依據(jù)。