吳計超　黃群　孟冬冬　黃敏玉　潘思穎

[摘要]目的 探討血脂相關影響因素與廣西壯族泌尿系結(jié)石的相關性。方法 分別選取來院就診的120例壯族泌尿系結(jié)石患者與120例壯族體檢正常者列為結(jié)石組和對照組，采集兩組受檢者空腹靜脈血液3～5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（Tc）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。分析兩組人群血脂相關因素及家族史差異.并用PCR-測序技術(shù)檢測兩組人群的ApoE基因序列。結(jié)果 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），結(jié)石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。結(jié)石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。兩組人群ApoE基因的三個外顯子序列對比無突變。結(jié)論 在廣西壯族人群中，高Tc、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結(jié)石形成相關，有結(jié)石家族史的人群更易患泌尿系結(jié)石，但ApoE基因第1、2、3外顯子上未發(fā)現(xiàn)與泌尿系結(jié)石相關的基因突變。

[關鍵詞]血脂；泌尿系結(jié)石；基因

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病，在廣西壯族人群中發(fā)病率較高。泌尿系結(jié)石成因復雜，與很多因素均有關系，如遺傳、解剖、環(huán)境、性別、代謝等。其中血脂異常與泌尿系結(jié)石的關系在過去未受重視.但近年來越來越多的研究結(jié)果表明血脂異常與泌尿系結(jié)石發(fā)病密切相關。在遺傳研究方面，腎結(jié)石雙生子對照研究揭示了其遺傳度為52%-56%，反映了遺傳在泌尿系結(jié)石形成中的重要作用。本研究探討了血脂水平對廣西壯族人群泌尿系結(jié)石的影響，并研究了部分遺傳病因。

1.資料與方法

1.1一般資料 結(jié)石組的納入標準：（1）經(jīng)x射線、B超、CT等影像學檢查確診泌尿系結(jié)石；（2）父母皆為壯族，且居住本地10年以上。排除標準：（1）患有尿路畸形、尿路感染等泌尿系統(tǒng)疾病；（2）胃、腸等消化道功能疾病患者；（3）存在腎衰、腎功能不全等癥。共選人120例泌尿系結(jié)石患者參與本次研究，男性83例.女性37例；年齡11-73歲，平均（41.0_+10.5）歲。其中上尿路結(jié)石82例，占68.3%；下尿路結(jié)石17例，占14.2%；復合型結(jié)石21例，占17.5%。同時選取同期體檢正常且無泌尿系結(jié)石病史的120名正常者，納人對照組。對照組男性79例，女性41例；年齡10-70歲，平均（39.0±10.6）歲。對照組的選擇也均為壯族人群，并保證了兩組人群在年齡、性別方面差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2實驗儀器 Hitachi7600型全自動生化分析儀（日立，日本），Verity 96well PCR儀、Gene Genius凝膠成像儀（syngene，英國），3730XL測序儀（ABI，美國），HC-2518R冷凍離心機（BBI，加拿大），TGL-14G臺式高速離心機（上海醫(yī)療器械有限公司），DYY-8C電泳儀（北京六一儀器廠），H6-1電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠），XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），HS-800D數(shù)顯恒溫水浴鍋（蕪湖金瑞特計量檢測儀器有限公司），SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設備廠），100-1000 ml、20-200 ml、0.5-10 ml、0.1-0.25 ml移液器（BBI公司，加拿大）。

1.3實驗試劑 引物、Pfu DNA Polymerase高溫聚合酶、MgCl，（25 mM）、10×PCR Buffer、dNTP（10mM）、6×DNA Loading Dye、DNA marker、10×TAE、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、無乙水醇、異丙醇、丙三醇、DNA提取試劑盒。

1.4檢查及分析方法

1.4.1血脂檢查 采集受檢者空腹靜脈血液3-5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（TC）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。

1.4.2DNA提取 將分離所剩血液按DNA提取試劑盒操作.提取出的DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測濃度與純度，達到標準后放置200C冰箱保存。

1.4.3PCR擴增及基因測序 ApoE三個外顯子引物分別為：1F 5-CTCTATGCCCCACCTCCTF-3：1R5-CCCCGAGTAGCTCTCCTGA-3：2F 5-AACAAG-GCTFGGAAGGCTA-3：2R 5-CAGCACAGAAGCCT-CAGAAGA-3；3F 5-CTCACCCTGCCCACCAT-3；3R 5-CAGGCCCCCCAAGACTT-3。PCR反應體系為：1 uL模板，0.5 uL引物F，0.5 uL引物R，0.5 uLdNTP 10 mM，2.5 uL Taq Buffer，0.2 uL Taq酶（5 U/IxL），20 uL水。PCR反應條件為：95～C預變性3min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s至60 s，經(jīng)35個循環(huán)后在72℃下延伸10 min。所得產(chǎn)物經(jīng)1.5%TAE瓊脂糖電泳，以確定PCR擴增是否有效，電泳條件為150 V、100 mA 20 min。PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒，于測序儀上完成測序（此步驟由上海生工生物工程股份有限公司完成）。

1.5統(tǒng)計學方法 使用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗.計數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用x2檢驗，檢驗水準：a=0.05，雙側(cè)檢驗。

2.結(jié)果

2.1兩組血脂及相關指標的比較 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），結(jié)石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。見表1。

2.2兩組人群家族史對比 結(jié)石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。即結(jié)石組相較于對照組，其家族中一級親屬患泌尿系結(jié)石的風險更高.有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結(jié)石。

2.3兩組人群ApoE基因?qū)Ρ?對240個樣本ApoE基因的三個外顯子進行PCR后測序，結(jié)果顯示，結(jié)石組和對照組的堿基序列均無突變。將所得序列與NCBI公布的ApoE序列對比.并未發(fā)現(xiàn)差異。PCR后電泳結(jié)果見圖1，測序結(jié)果見圖2。

3.討論

泌尿系結(jié)石的發(fā)病率與復發(fā)率均較高，給患者增加經(jīng)濟負擔的同時，也讓患者承受了極大的痛苦，因此，明確其病因尤為重要。尿路結(jié)石病因復雜，可能涉及代謝、解剖、感染、環(huán)境、社會、遺傳、飲食等多個方面。其中，血脂代謝與泌尿系結(jié)石的相關性研究已取得一定的進展.但研究結(jié)果并不完全一致。國外Masterson等通過泌尿系結(jié)石患者大樣本回訪研究，認為血脂譜中高TG、LDL-C水平與泌尿系結(jié)石的發(fā)生不相關，僅HDL-C水平降低與之有關。國內(nèi)柴東岳等通過結(jié)石組與對照組為1：2配比的對照研究，認為高TC、TG、LDL-C、低HDL-C水平與泌尿系結(jié)石顯著相關，并且低HDL-C血癥和高LDL-C血癥是上尿路結(jié)石患者發(fā)病的獨立危險因素。因此本研究在廣西壯族人群中進行血脂與泌尿系結(jié)石的相關性研究，并加入了載脂蛋白的因素，結(jié)果顯示，高TC、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結(jié)石的產(chǎn)生相關，而LDL-C、ApoA、ApoB水平與泌尿系結(jié)石不相關。

幾乎所有研究均確認了低HDL水平與泌尿系結(jié)石的關系。低HDL-C引起泌尿系結(jié)石的原因，可能是結(jié)石患者存在逆向轉(zhuǎn)運膽固醇功能障礙.導致流人肝臟的游離脂肪酸減少，流人腎臟等肝外器官的游離脂肪酸增加.然后從以下幾個方面導致結(jié)石形成：血脂升高產(chǎn)生的氧化應激，導致腎小管上皮細胞的損害成為尿路結(jié)石形成的起始環(huán)節(jié)：脂類排泄增多參與結(jié)石形成，其中糖脂是結(jié)石的主要脂類：腎小管的脂肪浸潤引起Na+/H+交換體（NHE3）減少，尿液酸化，從而誘發(fā)草酸鈣、尿酸鹽結(jié)晶的形成。此外，也有研究者認為，進入腎臟的游離脂肪酸增加會引起NADP-NADPH介導的5-磷酸核糖向磷酸核糖焦磷酸的嘌呤從頭合成亢進，引起尿酸生成增加，并且TG降解生成的部分游離脂肪酸再酯化進人其他組織的過程，也會使尿酸生成增加。本次實驗中關于TC和LDL-C的結(jié)果與部分文獻報道不同.可能的原因是決定腎臟脂肪浸潤的關鍵因素在于HDL-C水平，而TC、HDL-C受飲食及肝代謝的影響較大，此外，環(huán)境、生活習慣、民族差異也可能對結(jié)果存在影響。

載脂蛋白E是一種重要膽固醇載體，在體內(nèi)起到運輸脂類及膽固醇的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)石組中載脂蛋白E和TC的水平要高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，提示進入腎臟的膽固醇增多與結(jié)石的形成有關。有研究提示膽固醇具有促進結(jié)石成核作用，并且膽固醇在血管和內(nèi)皮下沉積過多，會致使濾過膜屏障損壞，其具體的分子生物學機制，有待進一步研究證實。

本實驗顯示，泌尿系結(jié)石患者家族中一級親屬患泌尿系結(jié)石的風險更高，有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結(jié)石，說明了遺傳在結(jié)石發(fā)病中的重要作用。近年已發(fā)現(xiàn)很多基因與泌尿系結(jié)石存在關系，其中研究較多的是OPN基因、Klotho基因和VDR基因，而關于載脂蛋白E與泌尿系結(jié)石的關系研究較少。載脂蛋白E與血脂代謝的關系毋庸置疑，血脂異常又與泌尿系結(jié)石關系緊密，故我們推測載脂蛋白E的基因多態(tài)性與泌尿系結(jié)石存在一定的關系。Qian等在維吾爾族人群中發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E的E3/4和E4分別為泌尿系結(jié)石患者的易感基因型和易感等位基因。但是本次實驗在廣西壯族人群中未發(fā)現(xiàn)與泌尿系結(jié)石相關的ApoE基因突變點，這似與Qian等的結(jié)論存在差異。有兩種可能，其一E4突變點可能位于第四外顯子和非編碼序列上；其二，這種差異可能為種族和地域差異所致。

綜上所述.血甘油三酯、總膽固醇與廣西壯族人群泌尿系結(jié)石的產(chǎn)生存在一定的關系.是否可以通過控制上述臨床指標促進結(jié)石的清除、降低復發(fā)的風險，有待下一步大樣本臨床研究和基礎機制研究。基因篩查對一些復發(fā)性結(jié)石確有一定診斷意義，并根據(jù)病因合理指導治療。但我們并未在載脂蛋白E基因的前三個外顯子上發(fā)現(xiàn)如Qian所報道的基因突變，對于基因篩查指標的選擇仍需要大量的實驗研究。

吳計超　黃群　孟冬冬　黃敏玉　潘思穎

[摘要]目的 探討血脂相關影響因素與廣西壯族泌尿系結(jié)石的相關性。方法 分別選取來院就診的120例壯族泌尿系結(jié)石患者與120例壯族體檢正常者列為結(jié)石組和對照組，采集兩組受檢者空腹靜脈血液3～5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（Tc）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。分析兩組人群血脂相關因素及家族史差異.并用PCR-測序技術(shù)檢測兩組人群的ApoE基因序列。結(jié)果 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），結(jié)石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。結(jié)石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。兩組人群ApoE基因的三個外顯子序列對比無突變。結(jié)論 在廣西壯族人群中，高Tc、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結(jié)石形成相關，有結(jié)石家族史的人群更易患泌尿系結(jié)石，但ApoE基因第1、2、3外顯子上未發(fā)現(xiàn)與泌尿系結(jié)石相關的基因突變。

[關鍵詞]血脂；泌尿系結(jié)石；基因

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病，在廣西壯族人群中發(fā)病率較高。泌尿系結(jié)石成因復雜，與很多因素均有關系，如遺傳、解剖、環(huán)境、性別、代謝等。其中血脂異常與泌尿系結(jié)石的關系在過去未受重視.但近年來越來越多的研究結(jié)果表明血脂異常與泌尿系結(jié)石發(fā)病密切相關。在遺傳研究方面，腎結(jié)石雙生子對照研究揭示了其遺傳度為52%-56%，反映了遺傳在泌尿系結(jié)石形成中的重要作用。本研究探討了血脂水平對廣西壯族人群泌尿系結(jié)石的影響，并研究了部分遺傳病因。

1.資料與方法

1.1一般資料 結(jié)石組的納入標準：（1）經(jīng)x射線、B超、CT等影像學檢查確診泌尿系結(jié)石；（2）父母皆為壯族，且居住本地10年以上。排除標準：（1）患有尿路畸形、尿路感染等泌尿系統(tǒng)疾??；（2）胃、腸等消化道功能疾病患者；（3）存在腎衰、腎功能不全等癥。共選人120例泌尿系結(jié)石患者參與本次研究，男性83例.女性37例；年齡11-73歲，平均（41.0_+10.5）歲。其中上尿路結(jié)石82例，占68.3%；下尿路結(jié)石17例，占14.2%；復合型結(jié)石21例，占17.5%。同時選取同期體檢正常且無泌尿系結(jié)石病史的120名正常者，納人對照組。對照組男性79例，女性41例；年齡10-70歲，平均（39.0±10.6）歲。對照組的選擇也均為壯族人群，并保證了兩組人群在年齡、性別方面差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2實驗儀器 Hitachi7600型全自動生化分析儀（日立，日本），Verity 96well PCR儀、Gene Genius凝膠成像儀（syngene，英國），3730XL測序儀（ABI，美國），HC-2518R冷凍離心機（BBI，加拿大），TGL-14G臺式高速離心機（上海醫(yī)療器械有限公司），DYY-8C電泳儀（北京六一儀器廠），H6-1電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠），XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），HS-800D數(shù)顯恒溫水浴鍋（蕪湖金瑞特計量檢測儀器有限公司），SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設備廠），100-1000 ml、20-200 ml、0.5-10 ml、0.1-0.25 ml移液器（BBI公司，加拿大）。

1.3實驗試劑 引物、Pfu DNA Polymerase高溫聚合酶、MgCl，（25 mM）、10×PCR Buffer、dNTP（10mM）、6×DNA Loading Dye、DNA marker、10×TAE、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、無乙水醇、異丙醇、丙三醇、DNA提取試劑盒。

1.4檢查及分析方法

1.4.1血脂檢查 采集受檢者空腹靜脈血液3-5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（TC）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。

1.4.2DNA提取 將分離所剩血液按DNA提取試劑盒操作.提取出的DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測濃度與純度，達到標準后放置200C冰箱保存。

1.4.3PCR擴增及基因測序 ApoE三個外顯子引物分別為：1F 5-CTCTATGCCCCACCTCCTF-3：1R5-CCCCGAGTAGCTCTCCTGA-3：2F 5-AACAAG-GCTFGGAAGGCTA-3：2R 5-CAGCACAGAAGCCT-CAGAAGA-3；3F 5-CTCACCCTGCCCACCAT-3；3R 5-CAGGCCCCCCAAGACTT-3。PCR反應體系為：1 uL模板，0.5 uL引物F，0.5 uL引物R，0.5 uLdNTP 10 mM，2.5 uL Taq Buffer，0.2 uL Taq酶（5 U/IxL），20 uL水。PCR反應條件為：95～C預變性3min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s至60 s，經(jīng)35個循環(huán)后在72℃下延伸10 min。所得產(chǎn)物經(jīng)1.5%TAE瓊脂糖電泳，以確定PCR擴增是否有效，電泳條件為150 V、100 mA 20 min。PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒，于測序儀上完成測序（此步驟由上海生工生物工程股份有限公司完成）。

1.5統(tǒng)計學方法 使用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗.計數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用x2檢驗，檢驗水準：a=0.05，雙側(cè)檢驗。

2.結(jié)果

2.1兩組血脂及相關指標的比較 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），結(jié)石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。見表1。

2.2兩組人群家族史對比 結(jié)石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。即結(jié)石組相較于對照組，其家族中一級親屬患泌尿系結(jié)石的風險更高.有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結(jié)石。

2.3兩組人群ApoE基因?qū)Ρ?對240個樣本ApoE基因的三個外顯子進行PCR后測序，結(jié)果顯示，結(jié)石組和對照組的堿基序列均無突變。將所得序列與NCBI公布的ApoE序列對比.并未發(fā)現(xiàn)差異。PCR后電泳結(jié)果見圖1，測序結(jié)果見圖2。

3.討論

泌尿系結(jié)石的發(fā)病率與復發(fā)率均較高，給患者增加經(jīng)濟負擔的同時，也讓患者承受了極大的痛苦，因此，明確其病因尤為重要。尿路結(jié)石病因復雜，可能涉及代謝、解剖、感染、環(huán)境、社會、遺傳、飲食等多個方面。其中，血脂代謝與泌尿系結(jié)石的相關性研究已取得一定的進展.但研究結(jié)果并不完全一致。國外Masterson等通過泌尿系結(jié)石患者大樣本回訪研究，認為血脂譜中高TG、LDL-C水平與泌尿系結(jié)石的發(fā)生不相關，僅HDL-C水平降低與之有關。國內(nèi)柴東岳等通過結(jié)石組與對照組為1：2配比的對照研究，認為高TC、TG、LDL-C、低HDL-C水平與泌尿系結(jié)石顯著相關，并且低HDL-C血癥和高LDL-C血癥是上尿路結(jié)石患者發(fā)病的獨立危險因素。因此本研究在廣西壯族人群中進行血脂與泌尿系結(jié)石的相關性研究，并加入了載脂蛋白的因素，結(jié)果顯示，高TC、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結(jié)石的產(chǎn)生相關，而LDL-C、ApoA、ApoB水平與泌尿系結(jié)石不相關。

幾乎所有研究均確認了低HDL水平與泌尿系結(jié)石的關系。低HDL-C引起泌尿系結(jié)石的原因，可能是結(jié)石患者存在逆向轉(zhuǎn)運膽固醇功能障礙.導致流人肝臟的游離脂肪酸減少，流人腎臟等肝外器官的游離脂肪酸增加.然后從以下幾個方面導致結(jié)石形成：血脂升高產(chǎn)生的氧化應激，導致腎小管上皮細胞的損害成為尿路結(jié)石形成的起始環(huán)節(jié)：脂類排泄增多參與結(jié)石形成，其中糖脂是結(jié)石的主要脂類：腎小管的脂肪浸潤引起Na+/H+交換體（NHE3）減少，尿液酸化，從而誘發(fā)草酸鈣、尿酸鹽結(jié)晶的形成。此外，也有研究者認為，進入腎臟的游離脂肪酸增加會引起NADP-NADPH介導的5-磷酸核糖向磷酸核糖焦磷酸的嘌呤從頭合成亢進，引起尿酸生成增加，并且TG降解生成的部分游離脂肪酸再酯化進人其他組織的過程，也會使尿酸生成增加。本次實驗中關于TC和LDL-C的結(jié)果與部分文獻報道不同.可能的原因是決定腎臟脂肪浸潤的關鍵因素在于HDL-C水平，而TC、HDL-C受飲食及肝代謝的影響較大，此外，環(huán)境、生活習慣、民族差異也可能對結(jié)果存在影響。

載脂蛋白E是一種重要膽固醇載體，在體內(nèi)起到運輸脂類及膽固醇的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)石組中載脂蛋白E和TC的水平要高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，提示進入腎臟的膽固醇增多與結(jié)石的形成有關。有研究提示膽固醇具有促進結(jié)石成核作用，并且膽固醇在血管和內(nèi)皮下沉積過多，會致使濾過膜屏障損壞，其具體的分子生物學機制，有待進一步研究證實。

本實驗顯示，泌尿系結(jié)石患者家族中一級親屬患泌尿系結(jié)石的風險更高，有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結(jié)石，說明了遺傳在結(jié)石發(fā)病中的重要作用。近年已發(fā)現(xiàn)很多基因與泌尿系結(jié)石存在關系，其中研究較多的是OPN基因、Klotho基因和VDR基因，而關于載脂蛋白E與泌尿系結(jié)石的關系研究較少。載脂蛋白E與血脂代謝的關系毋庸置疑，血脂異常又與泌尿系結(jié)石關系緊密，故我們推測載脂蛋白E的基因多態(tài)性與泌尿系結(jié)石存在一定的關系。Qian等在維吾爾族人群中發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E的E3/4和E4分別為泌尿系結(jié)石患者的易感基因型和易感等位基因。但是本次實驗在廣西壯族人群中未發(fā)現(xiàn)與泌尿系結(jié)石相關的ApoE基因突變點，這似與Qian等的結(jié)論存在差異。有兩種可能，其一E4突變點可能位于第四外顯子和非編碼序列上；其二，這種差異可能為種族和地域差異所致。

綜上所述.血甘油三酯、總膽固醇與廣西壯族人群泌尿系結(jié)石的產(chǎn)生存在一定的關系.是否可以通過控制上述臨床指標促進結(jié)石的清除、降低復發(fā)的風險，有待下一步大樣本臨床研究和基礎機制研究?；蚝Y查對一些復發(fā)性結(jié)石確有一定診斷意義，并根據(jù)病因合理指導治療。但我們并未在載脂蛋白E基因的前三個外顯子上發(fā)現(xiàn)如Qian所報道的基因突變，對于基因篩查指標的選擇仍需要大量的實驗研究。

吳計超　黃群　孟冬冬　黃敏玉　潘思穎

[摘要]目的 探討血脂相關影響因素與廣西壯族泌尿系結(jié)石的相關性。方法 分別選取來院就診的120例壯族泌尿系結(jié)石患者與120例壯族體檢正常者列為結(jié)石組和對照組，采集兩組受檢者空腹靜脈血液3～5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（Tc）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。分析兩組人群血脂相關因素及家族史差異.并用PCR-測序技術(shù)檢測兩組人群的ApoE基因序列。結(jié)果 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），結(jié)石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。結(jié)石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。兩組人群ApoE基因的三個外顯子序列對比無突變。結(jié)論 在廣西壯族人群中，高Tc、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結(jié)石形成相關，有結(jié)石家族史的人群更易患泌尿系結(jié)石，但ApoE基因第1、2、3外顯子上未發(fā)現(xiàn)與泌尿系結(jié)石相關的基因突變。

[關鍵詞]血脂；泌尿系結(jié)石；基因

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病，在廣西壯族人群中發(fā)病率較高。泌尿系結(jié)石成因復雜，與很多因素均有關系，如遺傳、解剖、環(huán)境、性別、代謝等。其中血脂異常與泌尿系結(jié)石的關系在過去未受重視.但近年來越來越多的研究結(jié)果表明血脂異常與泌尿系結(jié)石發(fā)病密切相關。在遺傳研究方面，腎結(jié)石雙生子對照研究揭示了其遺傳度為52%-56%，反映了遺傳在泌尿系結(jié)石形成中的重要作用。本研究探討了血脂水平對廣西壯族人群泌尿系結(jié)石的影響，并研究了部分遺傳病因。

1.資料與方法

1.1一般資料 結(jié)石組的納入標準：（1）經(jīng)x射線、B超、CT等影像學檢查確診泌尿系結(jié)石；（2）父母皆為壯族，且居住本地10年以上。排除標準：（1）患有尿路畸形、尿路感染等泌尿系統(tǒng)疾病；（2）胃、腸等消化道功能疾病患者；（3）存在腎衰、腎功能不全等癥。共選人120例泌尿系結(jié)石患者參與本次研究，男性83例.女性37例；年齡11-73歲，平均（41.0_+10.5）歲。其中上尿路結(jié)石82例，占68.3%；下尿路結(jié)石17例，占14.2%；復合型結(jié)石21例，占17.5%。同時選取同期體檢正常且無泌尿系結(jié)石病史的120名正常者，納人對照組。對照組男性79例，女性41例；年齡10-70歲，平均（39.0±10.6）歲。對照組的選擇也均為壯族人群，并保證了兩組人群在年齡、性別方面差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2實驗儀器 Hitachi7600型全自動生化分析儀（日立，日本），Verity 96well PCR儀、Gene Genius凝膠成像儀（syngene，英國），3730XL測序儀（ABI，美國），HC-2518R冷凍離心機（BBI，加拿大），TGL-14G臺式高速離心機（上海醫(yī)療器械有限公司），DYY-8C電泳儀（北京六一儀器廠），H6-1電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠），XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），HS-800D數(shù)顯恒溫水浴鍋（蕪湖金瑞特計量檢測儀器有限公司），SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設備廠），100-1000 ml、20-200 ml、0.5-10 ml、0.1-0.25 ml移液器（BBI公司，加拿大）。

1.3實驗試劑 引物、Pfu DNA Polymerase高溫聚合酶、MgCl，（25 mM）、10×PCR Buffer、dNTP（10mM）、6×DNA Loading Dye、DNA marker、10×TAE、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、無乙水醇、異丙醇、丙三醇、DNA提取試劑盒。

1.4檢查及分析方法

1.4.1血脂檢查 采集受檢者空腹靜脈血液3-5 ml，分離血清后采用日立7600全自動生化分析儀進行總膽固醇（TC）、血三酰甘油（TG）、血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血漿載脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）測定。

1.4.2DNA提取 將分離所剩血液按DNA提取試劑盒操作.提取出的DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測濃度與純度，達到標準后放置200C冰箱保存。

1.4.3PCR擴增及基因測序 ApoE三個外顯子引物分別為：1F 5-CTCTATGCCCCACCTCCTF-3：1R5-CCCCGAGTAGCTCTCCTGA-3：2F 5-AACAAG-GCTFGGAAGGCTA-3：2R 5-CAGCACAGAAGCCT-CAGAAGA-3；3F 5-CTCACCCTGCCCACCAT-3；3R 5-CAGGCCCCCCAAGACTT-3。PCR反應體系為：1 uL模板，0.5 uL引物F，0.5 uL引物R，0.5 uLdNTP 10 mM，2.5 uL Taq Buffer，0.2 uL Taq酶（5 U/IxL），20 uL水。PCR反應條件為：95～C預變性3min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s至60 s，經(jīng)35個循環(huán)后在72℃下延伸10 min。所得產(chǎn)物經(jīng)1.5%TAE瓊脂糖電泳，以確定PCR擴增是否有效，電泳條件為150 V、100 mA 20 min。PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒，于測序儀上完成測序（此步驟由上海生工生物工程股份有限公司完成）。

1.5統(tǒng)計學方法 使用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗.計數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用x2檢驗，檢驗水準：a=0.05，雙側(cè)檢驗。

2.結(jié)果

2.1兩組血脂及相關指標的比較 兩組人群TG、TC、HDL-C和血漿ApoE比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），結(jié)石組TG、TC和血漿ApoE水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組。見表1。

2.2兩組人群家族史對比 結(jié)石組有家族史33人，占27.5%（33/120），對照組有家族史14人，占11.7%（14/120），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。即結(jié)石組相較于對照組，其家族中一級親屬患泌尿系結(jié)石的風險更高.有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結(jié)石。

2.3兩組人群ApoE基因?qū)Ρ?對240個樣本ApoE基因的三個外顯子進行PCR后測序，結(jié)果顯示，結(jié)石組和對照組的堿基序列均無突變。將所得序列與NCBI公布的ApoE序列對比.并未發(fā)現(xiàn)差異。PCR后電泳結(jié)果見圖1，測序結(jié)果見圖2。

3.討論

泌尿系結(jié)石的發(fā)病率與復發(fā)率均較高，給患者增加經(jīng)濟負擔的同時，也讓患者承受了極大的痛苦，因此，明確其病因尤為重要。尿路結(jié)石病因復雜，可能涉及代謝、解剖、感染、環(huán)境、社會、遺傳、飲食等多個方面。其中，血脂代謝與泌尿系結(jié)石的相關性研究已取得一定的進展.但研究結(jié)果并不完全一致。國外Masterson等通過泌尿系結(jié)石患者大樣本回訪研究，認為血脂譜中高TG、LDL-C水平與泌尿系結(jié)石的發(fā)生不相關，僅HDL-C水平降低與之有關。國內(nèi)柴東岳等通過結(jié)石組與對照組為1：2配比的對照研究，認為高TC、TG、LDL-C、低HDL-C水平與泌尿系結(jié)石顯著相關，并且低HDL-C血癥和高LDL-C血癥是上尿路結(jié)石患者發(fā)病的獨立危險因素。因此本研究在廣西壯族人群中進行血脂與泌尿系結(jié)石的相關性研究，并加入了載脂蛋白的因素，結(jié)果顯示，高TC、TG、ApoE水平及低HDL-C水平與泌尿系結(jié)石的產(chǎn)生相關，而LDL-C、ApoA、ApoB水平與泌尿系結(jié)石不相關。

幾乎所有研究均確認了低HDL水平與泌尿系結(jié)石的關系。低HDL-C引起泌尿系結(jié)石的原因，可能是結(jié)石患者存在逆向轉(zhuǎn)運膽固醇功能障礙.導致流人肝臟的游離脂肪酸減少，流人腎臟等肝外器官的游離脂肪酸增加.然后從以下幾個方面導致結(jié)石形成：血脂升高產(chǎn)生的氧化應激，導致腎小管上皮細胞的損害成為尿路結(jié)石形成的起始環(huán)節(jié)：脂類排泄增多參與結(jié)石形成，其中糖脂是結(jié)石的主要脂類：腎小管的脂肪浸潤引起Na+/H+交換體（NHE3）減少，尿液酸化，從而誘發(fā)草酸鈣、尿酸鹽結(jié)晶的形成。此外，也有研究者認為，進入腎臟的游離脂肪酸增加會引起NADP-NADPH介導的5-磷酸核糖向磷酸核糖焦磷酸的嘌呤從頭合成亢進，引起尿酸生成增加，并且TG降解生成的部分游離脂肪酸再酯化進人其他組織的過程，也會使尿酸生成增加。本次實驗中關于TC和LDL-C的結(jié)果與部分文獻報道不同.可能的原因是決定腎臟脂肪浸潤的關鍵因素在于HDL-C水平，而TC、HDL-C受飲食及肝代謝的影響較大，此外，環(huán)境、生活習慣、民族差異也可能對結(jié)果存在影響。

載脂蛋白E是一種重要膽固醇載體，在體內(nèi)起到運輸脂類及膽固醇的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)石組中載脂蛋白E和TC的水平要高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，提示進入腎臟的膽固醇增多與結(jié)石的形成有關。有研究提示膽固醇具有促進結(jié)石成核作用，并且膽固醇在血管和內(nèi)皮下沉積過多，會致使濾過膜屏障損壞，其具體的分子生物學機制，有待進一步研究證實。

本實驗顯示，泌尿系結(jié)石患者家族中一級親屬患泌尿系結(jié)石的風險更高，有家族史人群比沒有家族史人群更易患泌尿系結(jié)石，說明了遺傳在結(jié)石發(fā)病中的重要作用。近年已發(fā)現(xiàn)很多基因與泌尿系結(jié)石存在關系，其中研究較多的是OPN基因、Klotho基因和VDR基因，而關于載脂蛋白E與泌尿系結(jié)石的關系研究較少。載脂蛋白E與血脂代謝的關系毋庸置疑，血脂異常又與泌尿系結(jié)石關系緊密，故我們推測載脂蛋白E的基因多態(tài)性與泌尿系結(jié)石存在一定的關系。Qian等在維吾爾族人群中發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E的E3/4和E4分別為泌尿系結(jié)石患者的易感基因型和易感等位基因。但是本次實驗在廣西壯族人群中未發(fā)現(xiàn)與泌尿系結(jié)石相關的ApoE基因突變點，這似與Qian等的結(jié)論存在差異。有兩種可能，其一E4突變點可能位于第四外顯子和非編碼序列上；其二，這種差異可能為種族和地域差異所致。

綜上所述.血甘油三酯、總膽固醇與廣西壯族人群泌尿系結(jié)石的產(chǎn)生存在一定的關系.是否可以通過控制上述臨床指標促進結(jié)石的清除、降低復發(fā)的風險，有待下一步大樣本臨床研究和基礎機制研究?；蚝Y查對一些復發(fā)性結(jié)石確有一定診斷意義，并根據(jù)病因合理指導治療。但我們并未在載脂蛋白E基因的前三個外顯子上發(fā)現(xiàn)如Qian所報道的基因突變，對于基因篩查指標的選擇仍需要大量的實驗研究。