孫慧穎　陳悅　周默　邊雪　韓雙　白慶榮

(吉林農業(yè)大學,長春,130118)

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非洲鳳仙莖基腐病病原學及藥劑敏感性1)

孫慧穎陳悅周默邊雪韓雙白慶榮

(吉林農業(yè)大學,長春,130118)

摘要對非洲鳳仙(Impatiens wallerana Hook. f.)莖基腐病的癥狀進行了描述，結合病原形態(tài)特征、培養(yǎng)特性及rDNA-ITS序列分析結果，確定該病害由Rhizoctonia solani Kühn AG4-HG-Ⅰ融合群引起。病菌的生物學特性研究表明：菌絲較適生長溫度為25～30 ℃；菌絲生長較佳的培養(yǎng)基為OA和PSA，較佳的碳源為D-(+)麥芽糖、α-乳糖和可溶性淀粉，較佳的氮源為硝酸鉀和硝酸鈉；pH=7時菌絲生長最好；光照條件對菌絲生長無影響；菌絲致死條件為51 ℃、10 min。采用生長速率法測定了病菌對30種殺菌劑的敏感性，結果表明，病菌對≥300億個·g(-1)內生芽孢桿菌WP、1 000億個·g(-1)枯草芽孢桿菌WP、25%肟菌·50%戊唑醇WG、40%氟硅唑EC敏感性較高，對其EC(50)<1.0 mg·L(-1)，可以作為田間防治非洲鳳仙莖基腐病的首選殺菌劑。

關鍵詞非洲鳳仙；莖基腐??；病原鑒定；生物學特性；藥劑敏感性

分類號S432.1；S681.1

Pathogen Identification and Fungicides Susceptibility onImpatienswallerianaRoot and Stem Rot

Sun Huiying, Chen Yue, Zhou Mo, Bian Xue, Han Shuang, Bai Qingrong

(Jilin Agricultural University, Changchun 130118, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(3)：101-105.

We described the symptoms ofImpatienswallerianaroot and stem rot disease. Based on the morphology, cultural characteristics of the isolates and ITS sequence, we identified the pathogen asRhizoctoniasolaniKühn AG4-HG-I. The results of the biological characteristics of the pathogen showed that the suitable temperature for mycelial growth was 25 ℃-30 ℃. The optimal media for mycelial growth were OA and PSA. D-(+) Maltobiose, α-lactose，soluble starch, potassium nitrate and sodium nitrate were optimal for mycelial growth. The pH of 7 was suitable for mycelial growth. Light had no effect on mycelial growth. The lethal temperature of mycelial was 51 ℃ for 10 min. The susceptibility of the pathogen to 30 fungicides was detected by mycelial growth rate method. The pathogen was more sensitive to Endophytic Bacillus WP, Bacillus Subtilis WP, Trifloxystrobin·Tebuconazole 25%·50% WG, Flusilazole 40% EC, EC50<1.0 mg/L.

KeywordsImpatiens walleriana; Root and stem rot; Pathogen identification; Biological characteristics; Laboratory toxicity

非洲鳳仙(ImpatienswalleranaHook. f.)為鳳仙花科(Balsaminaceae)，鳳仙花屬(Impatiens)植物,俗名蘇丹鳳仙花、玻璃翠，為多年生肉質草本植物,是草花中最耐陰的品種之一，適合于涼臺、室內盆栽，也可做成吊盆等掛于窗前、樹上或用于樹蔭下的綠化材料[1-3]。非洲鳳仙原產非洲東部熱帶地區(qū),鳳仙花屬主要分布于熱帶非洲、印度、西南亞、中國南部和日本的大部分地區(qū)[4]。非洲鳳仙在北方地區(qū)多用作1年生栽培應用[5]。目前，在我國北京植物園熱帶溫室[2]以及沈陽[5]、哈爾濱[6]等地均有栽培。2013年2月，在長春市春蓮花卉基地非洲鳳仙育苗圃發(fā)現(xiàn)莖基腐病，發(fā)病率高達45%，對非洲鳳仙的生產造成嚴重危害；栽植后的植株也常常發(fā)生該病害，造成缺蔸死叢，影響其觀賞價值。本研究對該病害的癥狀進行了描述，對病原菌進行了分離與鑒定，并對病原菌的生物學特性及藥劑敏感性進行了研究，以期為該病害的診斷提供依據(jù)，為病害防控奠定基礎。

1材料與方法

1.1病害標本的采集及癥狀觀察

2013年2月中旬開始，在長春市春蓮花卉基地進行病害標本采集，并跟蹤調查，記錄病害發(fā)生特點及危害情況。

1.2病原菌的分離、純化與致病性測定

采用組織分離法對采自春蓮花卉基地的病害標本進行病原菌的分離。剪取病健交界處的病組織若干塊，大小為2 mm×2 mm，70%酒精消毒1 min，0.1%升汞消毒1 min。無菌水沖洗3次，置于PDA平板培養(yǎng)基上，每皿2～4塊，在培養(yǎng)箱內25 ℃恒溫培養(yǎng)。用滅菌的挑針，挑取單絲頂端2～3 mm，轉入PDA培養(yǎng)基上置于恒溫箱中25 ℃純化培養(yǎng)。

1年生盆栽健康植株莖基部用75%的酒精消毒，將培養(yǎng)3 d的純化菌株，打取直徑8 mm的菌餅貼到已消毒植株的莖基部，每個分離物接種5盆，以接種無菌PDA為對照，分別套袋保濕培養(yǎng)，定期觀察并記錄植株的發(fā)病情況。

1.3病原菌的培養(yǎng)學性狀及形態(tài)學觀察

觀察病原菌在培養(yǎng)基上的生長情況，菌絲、菌落及菌核的形態(tài)、色澤等。

細胞核染色：番紅O-KOH染色法[7]。將滅菌的載玻片放入PDA平板中，挑取菌絲塊放入平板中，置于培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)。待其菌絲長至載玻片1/3處，取出載玻片，放入含有番紅O-KOH染色缸中，染色1 min，在超景深顯微鏡下進行觀察，并拍照記錄。

1.4病原菌的分子生物學鑒定

以CTAB法[8]提取的菌株基因組DNA為模板，ITS4/ITS5(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)/(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)為引物進行PCR擴增，擴增的產物送至上海生物工程有限公司進行測序，并將測序所得的rDNA-ITS序列遞交GenBank，并與GenBank中核酸數(shù)據(jù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的ITS區(qū)相關序列進行同源性比較。

1.5病原菌生物學特性測定

供試菌株：FF1。

培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響：在PDA、PSA、PCA、OA、水瓊脂、玉米粉、黃瓜煎汁培養(yǎng)基上分別放置直徑為8 mm的病原菌菌餅，4次重復，25 ℃恒溫培養(yǎng)，2 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑[9]。將培養(yǎng)3 d的病原菌菌餅(直徑8 mm)，轉入滅菌的150 mL對應的上述液體培養(yǎng)基中，置于25 ℃、180 r·min-1的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。用真空抽濾機將菌絲分離后置于電熱恒溫鼓風干燥箱內，40 ℃烘干至恒質量，測其質量。

碳、氮源對病原菌菌絲生長和菌絲干質量的影響：①碳源。以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基[10]，分別稱取等質量碳素的D(+)-麥芽糖、葡萄糖、D-果糖、α-乳糖、D-木糖、可溶性淀粉替代蔗糖，配置成培養(yǎng)基。移植菌餅(直徑8 mm)到上述平板培養(yǎng)基中(15 mL·皿-1)，4次重復，25 ℃培養(yǎng)。2 d后，十字交叉法測量菌落直徑。液體培養(yǎng)，6 d后，測量菌絲干質量。②氮源。以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別稱取等質量氮素的草酸氨、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、DL-α-丙氨酸、硝酸鈉、硝酸氨氮源代替硝酸鉀，配置成培養(yǎng)基，移植菌餅(直徑8 mm)到上述平板培養(yǎng)基中(15 mL·皿-1)，4次重復，25 ℃培養(yǎng)。2 d后，十字交叉法測量菌落直徑。液體培養(yǎng)，6 d后，測量菌絲干質量。

pH對病原菌菌絲生長的影響：用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH調節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，向上述不同pH平板(15 mL·皿-1)中移入菌餅(直徑8 mm)，4次重復，25 ℃恒溫培養(yǎng)。2 d后，十字交叉法測量菌落直徑。液體培養(yǎng)，6 d后，測量菌絲干質量。

溫度對病原菌菌絲生長的影響：將直徑為8 mm的菌餅放置于PDA培養(yǎng)基平板中(15 mL·皿-1)，分別置于4、10、15、20、25、30、35、40、45 ℃下培養(yǎng)，4次重復。2 d后，十字交叉法測量菌落直徑。

光照對病原菌菌絲生長的影響：將直徑為8 mm的菌餅放置到PDA培養(yǎng)基平板(15 mL·皿-1)中，設置連續(xù)光照、光暗交替和完全黑暗3個處理，每個處理4次重復，25 ℃恒溫培養(yǎng)，2 d后，十字交叉法測量菌落直徑。液體培養(yǎng)，6 d后，測量菌絲干質量。

病原菌菌絲的致死溫度測定：將培養(yǎng)3 d的病原菌(試管)，分別放置到30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃的水浴鍋中處理10 min(預熱1 min)。水浴后立即放入冷水中降至室溫，將試管內菌絲轉入PDA平板中，置25 ℃恒溫培養(yǎng)，4次重復，3 d后根據(jù)其是否萌發(fā)確定菌絲致死范圍。然后以1 ℃為梯度更精準的確定其致死溫度[11]。

1.6室內藥劑篩選

1.6.1供試菌株及藥劑

供試菌株為FF1。試驗選用化學農藥和生物農藥共計30種。供試藥劑分別為：50%腐霉利WP(日本住友化學株式會社)；2%春雷·45%王銅WP(北興化學工業(yè)株式會社)；40%菌核凈WP、50%異菌脲WP(江西禾益化工有限公司)；10%甲霜·48%錳鋅WP(深圳諾普信農化股份有限公司)；50%腐霉利WP(宜賓川安高科農藥有限責任公司)；50%多菌靈WP(江蘇藍豐生物化工股份有限公司)；75%百菌清WP、10%苯醚甲環(huán)唑WG(先正達作物保護有限公司)；10%多抗霉素WP(績溪農華生物科技有限公司)；25%肟菌·50%戊唑醇WG(拜耳作物科學公司)；70%甲基硫菌靈WP(江蘇龍燈化學有限公司)；77%氫氧化銅WP(浙江禾本農藥化學有限公司)；30%醚菌酯WP(山東京博農化有限公司)；2.1%丁香·芹酚AS(大連永豐農藥廠)；40%氟硅唑EC(陜西恒潤化學工業(yè)有限公司)；66.5%霜霉威AS(重慶市化工研究院)；26%甲霜·6%噁霉靈AS(南京源生化工股份有限公司)；5%唑醚·55%代森聯(lián)WG、25%吡唑醚菌酯EC(巴斯夫(中國)有限公司)；12.5%硅唑·27.5%多菌靈SE(陜西恒潤化學工業(yè)有限公司)；30%噁霉靈AS(濰坊天達植保有限公司)；70%代森錳鋅WP(利民化工股份有限公司)；30%氟菌唑WP(中農住商(天津)農用化學有限公司)；50%嘧菌環(huán)胺WG(陜西上格之路生物科學有限公司)；1 000億個·g-1枯草芽孢桿菌(依天得)WP(武漢天惠生物工程有限公司)；2億個·g-1木霉菌WG(云南星耀生物制品有限公司)；2億菌落·g-1哈茨木霉菌WP(美國拜沃股份有限公司)；≥300億個·g-1內生芽孢桿菌(益微)WP(山東京青農業(yè)科技有限公司)；0.1億菌落·g-1多粘類芽孢桿菌FG(浙江省桐廬匯豐生物化工有限公司)。

1.6.2試驗方法

將每種藥劑配制成質量濃度分別為1×103、1×102、1×10、1、1×10-1、1×10-2mg·L-1的含藥平板。取直徑為8 mm的菌餅，放置于含藥平板中央，菌絲面朝下，以不加藥劑作為空白對照，每個處理3次重復。恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)2 d后，采用十字交叉法測量供試病菌在含藥培養(yǎng)基上的菌落直徑，與對照比較計算各藥劑處理對病菌的生長抑制率。查機率值與死亡率(抑制率)換算表，用最小二乘法建立毒力回歸方程，計算出各藥劑對病原菌的有效中濃度(EC50)，比較病原菌對各種藥劑的敏感程度。

抑制率=((對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-菌餅原始直徑))×100%。

2結果與分析

2.1病害癥狀

該病害主要為害非洲鳳仙幼苗的莖基部，在靠近地面的莖基部形成橢圓形或不規(guī)則的暗褐色病斑，略凹陷，水漬狀，病斑逐漸向莖基部周圍擴展，形成繞莖病斑，病部溢縮，最后葉片萎蔫枯死。當病斑繞莖一周后，幼苗逐漸枯死。潮濕時，病苗基部可見淺褐色的蛛絲網狀霉。

2.2病原菌的分離、純化與致病性

通過組織分離和單絲分離獲得培養(yǎng)性狀一致的9個分離物，分別命名為FF1、FF2、FF3、FF4、FF5、FF6、FF7、FF8、FF9。致病性測定結果表明：接種后5～7 d后表現(xiàn)的發(fā)病癥狀與田間觀察到的癥狀一致，對照植株未見異常(部分接種結果見圖1)。對發(fā)病部位進行病菌的再分離，得到與原來培養(yǎng)性狀一致的分離物，證明菌株FF1～FF9均具有致病力，為該病害的病原菌。

2.3病原菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)

菌株FF1～FF9形態(tài)特征一致，在PDA培養(yǎng)基上菌絲均匍匐生長，氣生菌絲少，菌絲呈放射狀。菌絲直徑5.54～11.48 μm，菌絲細胞多核；多為直角分枝，分枝處稍有縊縮，近分枝處有1個隔膜，不產生菌核(圖2)。菌落初期為灰白色或淡黃色，隨培養(yǎng)時間的延長，最后全菌落變?yōu)楹稚?。根?jù)病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，可鑒定該病原菌為茄立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)[12]。

A.EF1菌株接種植物發(fā)病癥狀及對照CK；B.EF9菌株接種植物發(fā)病癥狀及對照CK。

圖1非洲鳳仙莖基腐病菌的致病性測定結果

A.菌落形態(tài)；B、C.菌絲特征及細胞核染色。

2.4病原菌分子生物學鑒定

利用真菌特異性引物ITS4/ITS5對菌株FF1、FF7、FF9的rDNA-ITS進行PCR擴增，電泳檢測結果得到大小約750 bp的片段。病原菌rDNA-ITS區(qū)序列PCR產物經生物公司測序為735 bp的核苷酸序列，GenBank登錄號分別為HG934415、HG934416、HG934417。獲得的序列與GenBank中已有的序列進行Blast分析，與RhizoctoniasolaniAG4-HG-I(DQ102447、AB000007、JN254788、KF746162)的序列同源性為99%，表明分離獲得的病菌為RhizoctoniasolaniAG4-HG-I融合群。

2.5病原菌生物學測定

2.5.1不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

由表1可知，非洲鳳仙莖基腐病菌在7種培養(yǎng)基中均能生長，在OA培養(yǎng)基中生長最快，在水瓊脂培養(yǎng)中生長較慢，在5%顯著水平上存在顯著性差異。菌絲在PDA中生長量最大，在水瓊脂中生長量最小。

表1　培養(yǎng)基對非洲鳳仙莖基腐病菌菌絲生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5.2不同碳源對病原菌菌絲生長的影響

由表2可知，非洲鳳仙莖基腐病菌在7種不同碳源培養(yǎng)基中均可以生長，但其生長速度和生長量不同，在以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)中生長較快，以D-木糖為碳源的培養(yǎng)基生長較慢，在5%顯著水平上存在顯著性差異。在以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長量最大，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)中菌絲生長量最小。

表2　碳源對非洲鳳仙莖基腐病菌菌絲生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5.3不同氮源對病原菌菌絲生長的影響

由表3可知，病原菌在7種不同氮源培養(yǎng)基中均能生長，在硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)中生長較快，在L-苯丙氨酸為氮源的培養(yǎng)基中生長較慢。病原菌在硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長量最大，在L-天冬氨酸為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長量最低。

表3　氮源對非洲鳳仙莖基腐病菌菌絲生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5.4不同pH對病原菌菌絲生長的影響

由表4可知，病菌在不同pH下均能生長，在中性條件下生長較好，強酸性和強堿性均不利于菌絲生長，在5%顯著水平上存在顯著性差異。病原菌在中性條件下菌絲生長量最大，酸性和堿性條件下菌絲生長量較低。

表4　pH對非洲鳳仙莖基腐病菌菌絲生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5.5不同溫度對病原菌菌絲生長的影響

由表5可知，病原菌在25～30 ℃適合病原菌生長，在4、40、45 ℃溫度下病原菌不能生長。

表5　溫度對非洲鳳仙莖基腐病菌菌絲生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5.6不同光照對病原菌菌絲生長的影響

由表6可知，病原菌在不同的光照條件下均可以生長，在5%顯著水平上無差異。病菌菌絲在半光照條件下生長量最大，在5%顯著水平上不存在差異。

表6　光照對非洲鳳仙莖基腐病菌菌絲生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5.7病原菌菌絲致死溫度的測定

菌絲致死溫度試驗結果表明，病菌在50 ℃時可以生長，在55 ℃不生長；以1 ℃為梯度，最終確定菌絲致死條件為51 ℃、10 min。

2.5.8病原菌對不同殺菌劑的敏感性

由表7可知，所選的30種殺菌劑對病原菌均有抑制作用。病原菌對≥300億個·g-1內生芽孢桿菌WP、1 000億個·g-1枯草芽孢桿菌WP、25%肟菌·50%戊唑醇WG、40%氟硅唑EC的敏感性較好，對其EC50<0.1 mg·L-1，可以作為田間防治非洲鳳仙立枯病的首選殺菌劑；50%腐霉利WP、25%吡唑醚菌酯EC、10%多抗霉素WP、50%多菌靈WP、12.5%靈硅唑·27.5%多菌靈SE、40%菌核凈WP、5%唑醚·55%代森聯(lián)WG、50%異菌脲WP次之，0.1 mg·L-120 mg·L-1。

表7　非洲鳳仙莖基腐病菌對殺菌劑的敏感性

3結論與討論

對非洲鳳仙莖基腐病的癥狀進行描述，結合病原形態(tài)特征、培養(yǎng)特性及rDNA-ITS序列分析結果，確定該病害由RhizoctoniasolaniKühn AG4-HG-Ⅰ融合群引起。非洲鳳仙莖基腐病對非洲鳳仙的生產造成極大的威脅，需引起園林觀賞植物工作者的高度重視。掌握該病害的診斷特征，及時采取有效的防治措施，才能防止病害的擴大蔓延，減少其對觀賞植物造成的重大損失。

掌握病菌的生物學特性和病害的發(fā)生規(guī)律，是進行病害防治的必要前提。對病原菌生物學特性的研究結果表明：病菌對營養(yǎng)、光照、酸堿度等的要求并不嚴格，因此病害在營養(yǎng)瘠薄的栽培條件下也可嚴重發(fā)生。

采用生長速率法測定了病菌對30種殺菌劑的敏感性，結果表明，病原菌對≥300億個·g-1內生芽孢桿菌WP、1 000億個·g-1枯草芽孢桿菌WP、25%肟菌·50%戊唑醇WG、40%氟硅唑EC敏感性較高，可以作為田間防治非洲鳳仙莖基腐病的首選殺菌劑。為了延緩抗藥性的產生，建議藥劑輪換使用。

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收稿日期：2015年8月4日。

第一作者簡介：孫慧穎，女，1991年7月生，吉林農業(yè)大學農學院，碩士研究生。E-mail：1185175221@qq.com。通信作者：白慶榮，吉林農業(yè)大學農學院，教授。E-mail：bbbqqqrrr@163.com。

1)科技創(chuàng)新基金(201410193005)；吉林省自然科學基金(20101565)。

責任編輯：程紅。