宋紅　曹柏　王玲

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

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超低溫保存對玉蟬花種子生理生化特性的影響1)

宋紅曹柏王玲

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

摘要以玉蟬花種子為試材，將種子自然含水量9.8%分別降至7.2%、5.0%、3.6%、1.9%，液氮保存超24 h后，采用自來水和室溫兩種方法化凍，測定種子電導率、發(fā)芽率、過氧化物酶活性等活力指標，探討超低溫保存對玉蟬花種子生理生化特性的影響及其超低溫保存的可行性。結果表明：玉蟬花種子進行超低溫保存是可行的，含水量和化凍方式是影響玉蟬花種子超低溫保存效果的重要因素，超低溫保存可以適度脫水，選擇含水量3.6%的種子保存后有較高的發(fā)芽率；超低溫保存后采用自來水化凍，玉蟬花種子的發(fā)芽率、可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)、POD酶活性優(yōu)于室溫化凍，并且細胞膜結構及透性受損傷小。

關鍵詞玉蟬花種子；超低溫保存；生理生化特性；種子發(fā)芽率

分類號Q945

Physiological and Biochemical Characteristics ofIrisensataSeeds after Cryopreservation

Song Hong, Cao Bai, Wang Ling

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(4)：44-47.

WithIrisensataseeds materials, we dried their moisture contents from 9.8% to 7.2%, 5.0%, 3.6% and 1.9%, respectively. After 24-h cryopreservation, we used the tap water thaw and thaw at room temperature to measure the level of various indicators of the vitality of seeds, including germination, conductivity and POD, to explore the influence on physiological and biochemical characteristics ofI.ensataseeds after cryopreservation.I.ensataseed cryopreservation is feasible, the moisture and the thaw are important factors affecting cryopreservation effect, the cryopreservation can moderate dehydration, and the moisture content of 3.6% of the seeds have a high germination rate after cryopreservation. After cryopreservation by using tap water to thaw, the germination rate, soluble protein content, and POD activity were better than those thawed at room temperature, and cell membrane structure and permeability were with less damage.

KeywordsIrisensataseeds; Cryopreservation; Physiological and biochemical; Seed germination rate

玉蟬花(Irisensata)，鳶尾屬(Iris)植物中耐寒性較強的種，形色兼?zhèn)洌B續(xù)花期較長，連片栽植觀賞效果極佳，在東北三省均有分布[1-2]。隨著環(huán)境的惡化，野生玉蟬花資源受到日益加重威脅，但當前我國對玉蟬花的開發(fā)保護、利用還未形成體系，僅有少部分科研工作者在從事相關方面的研究，對其種質(zhì)資源的保護已經(jīng)迫在眉睫。在低溫保存、超低溫保存、超干保存等眾多種質(zhì)資源保存方法中，超低溫保存被認為是目前實現(xiàn)生物種質(zhì)永久保存的理想方法而被廣泛應用[3-4]。當前，國內(nèi)外超低溫保存實際生產(chǎn)應用，主要集中在農(nóng)作物和蔬菜上[5]；針對觀賞植物，目前也已成功對部分種子、花粉、莖段、懸浮細胞等組織培養(yǎng)物進行了保存試驗[6-8]，但對玉蟬花種子的超低溫貯藏可行性以及超低溫保存后生理生化指標是否發(fā)生變化、變化規(guī)律均不明了，有關方面的研究甚少。因此，本研究選擇耐寒、觀賞價值極佳的寒地鳶尾典型種玉蟬花鳶尾為試驗材料，探討超低溫保存對玉蟬花種子生理生化特性的影響，以此實現(xiàn)玉蟬花優(yōu)良種質(zhì)長久保存目的，也為玉蟬花種質(zhì)資源的保護提供技術基礎。

1材料與方法

試驗材料為玉蟬花種子，于2013年9月采于東北林業(yè)大學帽兒山實驗基地，種子質(zhì)量為10.7 mg/粒。室內(nèi)自然陰干后，測得初始含水量為9.8%，密封于鋁箔袋，貯藏于冰箱中4 ℃暫存。

采用室溫硅膠干燥法對種子進行處理，得到含水量分別為7.2%、5.0%、3.6%、1.9%的種子。將得到的不同含水量的種子放入凍存管中，擰緊蓋子后放在凍存管架上直接投入液氮中，超過24 h后取出凍存管，用自來水化凍(沖洗6～7 min)和室溫化凍(置于25 ℃室溫中，自然冷卻0.5 h)兩種方式解凍，測定生理生化指標。

種子使用前需進行逐級回水處理。將不同含水量玉蟬花種子分別置于尼龍網(wǎng)袋中，首先放入裝有飽和氯化鈣溶液的密封干燥器中，20 ℃下放置24 h；然后再依次轉(zhuǎn)移到裝有飽和氯化氨溶液和水的干燥器中，20 ℃下分別平衡24 h[9]。

發(fā)芽率的測定：參考《國際種子檢驗規(guī)程》[10]。將鋪有濾紙的培養(yǎng)皿里均勻擺上50粒種子，重復3次。放在光照恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，晝夜變溫處理：30 ℃(8 h)/20 ℃(16 h)。以后每天檢查并記錄種子的萌發(fā)情況，保持培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙表面一直是濕潤狀態(tài)。發(fā)芽率=(發(fā)芽的種子數(shù)/供監(jiān)測的種子數(shù))×100%。

電導率的測定：準確稱取各條件下的種子1 g置于燒杯中，加入去離子水50 mL，充分震蕩后于25 ℃條件下靜置24 h，搖勻后用LC-116型電導儀測定其浸出液，重復3次，計算單位質(zhì)量電導率[11]。

可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)及過氧化物酶(POD)活性的測定：參照王學奎[12]的植物生理實驗方法。

運用SPSS19.0及Excel軟件進行統(tǒng)計分析，用平均值和標準誤表示測定結果，并用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較。

2結果與分析

2.1超低溫保存對種子發(fā)芽率的影響

由表1可見：在超低溫保存前，隨含水量的降低，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先上升再降低的趨勢，含水量7.2%、5.0%、3.6%、1.9%的種子發(fā)芽率均高于初始含水量的種子，且含水量5.0%的種子發(fā)芽率顯著升高了10.24%，表明玉蟬花種子有較強的耐脫水性，脫水處理促進了種子的萌發(fā)。超低溫保存后，采用自來水化凍，含水量5.0%、3.6%的種子發(fā)芽率與其它含水量種子相比差異顯著，較初始含水量分別升高了5.63%、6.60%，含水量3.6%時測得發(fā)芽率最高，各含水量種子發(fā)芽率較保存前均有升高；采用室溫化凍，含水量3.6%的種子發(fā)芽率(92.70%)顯著高于多數(shù)種子，含水量9.8%、7.2%、3.6%的種子發(fā)芽率高于保存前。含水量5.0%、3.6%的種子發(fā)芽率在保存前后均保持較高的水平，其中含水量3.6%的種子采用自來水化凍和室溫化凍發(fā)芽率較保存前均上升，分別升高了6.06%、5.47%。

玉蟬花種子發(fā)芽率受不同化凍方式和含水量的影響明顯，差異達極顯著水平(見表2)。

表1　超低溫保存前后種子發(fā)芽率及電導率的比較

注：數(shù)字后，同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)、同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表2　不同化凍方式和含水量對玉蟬花種子發(fā)芽率和電導率影響的方差分析

注：雙因素方差分析置信區(qū)間為95%。

2.2超低溫保存對細胞膜透性的影響

在貯藏過程中，由于外部環(huán)境因素變化或自身因素種子會發(fā)生一定程度的老化劣變，導致細胞膜完整性受損及膜透性增大，種子內(nèi)電解質(zhì)向周圍溶液滲漏，浸出液電導率隨之上升[13]。由表1可見：超低溫保存前，隨含水量的降低，種子電導率呈現(xiàn)下降—上升趨勢。含水量7.2%、5.0%的種子電導率與初始含水量相比，無顯著差異；含水量3.6%的種子電導率與初始含水量相比，差異顯著，升高了2.52%；含水量1.9%的種子電導率與初始含水量相比，差異極其顯著，升高了5.49%。玉蟬花種子超低溫保存后，采用自來水及室溫化凍，含水量7.2%、5.0%、3.6%的種子電導率與初始含水量比，差異不顯著；含水量1.9%的種子電導率與其它任意含水量種子，差異均極其顯著。采用自來水化凍的各含水量種子電導率，比保存前變化小，有些甚至降低，說明快速解凍能使種子迅速通過危險溫度區(qū)，對細胞膜的影響不大；采用室溫化凍的各含水量種子電導率，比保存前變化大，多數(shù)都升高，說明緩慢解凍種子細胞膜受到了損傷，修復能力減弱，種子活力不如快速解凍種子。

玉蟬花種子電導率受不同化凍方式影響達顯著水平，受含水量影響則達極顯著水平(見表2)。

2.3超低溫保存對可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響

由表3可見：超低溫保存前，隨含水量降低，種子可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)呈上升—下降的趨勢。含水量7.2%、5.0%、3.6%的種子可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)與初始含水量種子比，差異顯著，分別升高了38.92%、79.41%、100.98%。超低溫保存后，無論采用何種化凍方式，含水量7.2%、5.0%、3.6%的種子可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)，均顯著高于初始含水量種子，且含水量3.6%的種子可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)顯著高于其它任意含水量種子。超低溫保存后，種子可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)基本都降低了，對于大多數(shù)種子而言，采用室溫化凍可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)降幅大，含水量3.6%的種子可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)保存前后均高于其它任意含水量種子，說明含水量3.6%的種子低溫耐性好。

玉蟬花種子可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)受不同化凍方式影響非常明顯，達極顯著水平，受含水量的影響也達到極顯著水平(見表4)。

表3　超低溫保存前后種子可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)及POD活性的比較

注：數(shù)字后，同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)、同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表4　不同化凍方式和含水量對玉蟬花種子可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)和過氧化物酶活性影響的方差分析

注：雙因素方差分析置信區(qū)間為95%。

2.4超低溫保存對過氧化物酶(POD)活性的影響

過氧化物酶(POD)是植物體內(nèi)膜質(zhì)過氧化過程中的保護酶之一，是種子自身抵制活性氧、清除自由基有害物質(zhì)的清除劑。由表3可見：超低溫保存前，含水量5.0%、3.6%的種子POD活性有所升高，含水量7.2%、1.9%的種子POD活性則明顯降低。超低溫保存后，僅含水量7.2%(室溫化凍)和含水量3.6%(自來水化凍)的種子POD活性升高，其余種子POD活性均降低，且采用室溫化凍POD活性降幅更大，不如自來水化凍。

玉蟬花種子過氧化物酶活性受不同化凍方式影響非常明顯，達極顯著水平；含水量對玉蟬花種子過氧化物酶活性的影響也達到極顯著水平(見表4)。

3結論與討論

試驗表明：超低溫保存后，無論采用何種化凍方式，各含水量的種子發(fā)芽率比保存前都有所提升，且在含水量降低到1.90%時發(fā)芽率仍能達到80%以上的，說明超低溫保存對玉蟬花種子萌發(fā)有促進作用。這與劉燕等[8]對47種花卉種子的超低溫保存研究結果一致。含水量3.6%比其它含水量種子超低溫保存后發(fā)芽率顯著高，說明選擇合適含水量進行超低溫保存是必要的。

低溫保存中，細胞膜結構的損壞也會影響超低溫保存效果[14]。本試驗中采用快凍快解的方法對種子細胞膜結構影響不大，而采用緩解的方法則容易造成對細胞膜的損傷，這與蔣燕等[15]對南瓜種子的超低溫保存生理生化研究結果一致。含水量7.2%、5.0%、3.6%的種子保存后電導率，與初始含水量比差異不顯著，說明玉蟬花種子適當脫水可保持種子細胞膜系統(tǒng)的相對完整性，這與對藍桉種子、金錢松種子的研究結論一致[16-17]。

植物的超低溫耐性與植物體內(nèi)的水分狀態(tài)和保護性物質(zhì)是分不開的，在植物細胞中，可溶性蛋白是保護性物質(zhì)之一，它的存在有利于低溫耐性的提高[18]。而種子POD的存在，可為萌發(fā)過程中清除細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的毒害。本試驗中發(fā)現(xiàn)：適當降低玉蟬花種子的含水量，可以提高種子內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)及POD活性，含水量7.2%、5.0%、3.6%的種子可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)明顯高于初始含水量種子，含水量5.0%、3.6%的種子POD活性同樣高于初始含水量種子，多數(shù)自來水化凍種子可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)及POD活性高于室溫化凍，說明適當降低種子含水量和采用自來水化凍有利于保持種子的低溫耐性和維持抗脂質(zhì)過氧化功能。

關于化凍方式對超低溫保存后種子的種子活力影響，有研究發(fā)現(xiàn)，緩慢解凍時，細胞內(nèi)易發(fā)生劇烈再結晶，冰晶體增大，使細胞死亡；快速解凍能使其通過略低于冰融點的危險溫度區(qū)，防止降溫過程中所形成晶核生長對細胞損傷[19]。任淑娟等[20]認為，快速解凍的七葉樹種子，離體胚活力更高；但胡晉等[21]認為，室溫化凍，可以使種子慢慢適應溫度變化而免遭傷害。本試驗研究發(fā)現(xiàn)：超低溫保存后，采用自來水化凍發(fā)芽率變化相對較穩(wěn)定，發(fā)芽率、膜透性優(yōu)于室溫化凍，經(jīng)自來水化凍多數(shù)含水量種子的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)、POD活性也高于室溫化凍，說明超低溫保存后玉蟬花種子適合快速解凍，從而維持種子的活力。

超低溫保存技術多以材料進入液氮后保存一定時間，取出后檢驗材料存活情況判定保存方法是否成功[22]。綜上分析認為，無論是發(fā)芽情況，還是生理指標，都不同程度地表明玉蟬花種子進行超低溫保存是可行的，且對種子的有些性能具有一定的促進作用[23]。玉蟬花種子的超低溫保存效果，主要受含水量和化凍方式兩個重要因素的影響，含水量3.6%、自來水化凍的組合最適進行超低溫保存，此時種子具有較高的發(fā)芽率、可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)和POD活性，細胞膜結構相對完整。

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收稿日期：2015年12月14日。

作者簡介：第一宋紅，女，1966年10月生，東北林業(yè)大學園林學院，高級工程師。E-mail:851100942@qq.com。通信作者：王玲，東北林業(yè)大學園林學院，教授。E-mail:Wanglinghlj@126.com。

1)中央高校基本科研業(yè)務費專項資金(DL13EA07-2)。

責任編輯：張玉。