曹乾超　張雅芬　崔海峰　葉子弘

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菰黑粉菌的研究進展

曹乾超張雅芬崔海峰葉子弘

曹乾超，中國計量學院生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，杭州，310018

張雅芬，崔海峰，中國計量學院生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室

葉子弘，通信作者，中國計量學院生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室

柯衛(wèi)東男，武漢市蔬菜科學研究所副所長兼水生蔬菜研究室主任，推廣研究員，享受國務院政府特殊津貼，水生蔬菜行業(yè)計劃及“十二五”國家科技支撐計劃首席專家，主持國家及省、市重大科研項目多項，《植物遺傳資源學報》、《長江蔬菜》編委。長期從事水生蔬菜種質(zhì)資源及育種研究，在水生蔬菜種質(zhì)資源保護及創(chuàng)新、新品種選育、微型種苗繁殖技術研究與應用等方面有創(chuàng)造性貢獻，有力推動了我國水生蔬菜學科建設及產(chǎn)業(yè)發(fā)展。發(fā)表論文、論著100余篇（部），制定農(nóng)業(yè)行業(yè)標準9部，取得國家發(fā)明專利3項，獲國家科技進步獎二等獎、第四屆全國杰出專業(yè)技術人才獎等。

1　菰黑粉菌的病原物及生物學特性

1.1菰黑粉菌病原物的形態(tài)

由于菰黑粉菌在茭白孕茭的過程中起重要作用，近年來關于其形態(tài)學及生理變化條件等的研究越來越多。菰黑粉菌的厚垣孢子為圓形，少數(shù)為橢圓形，在適宜條件下，孢子以芽殖方式萌發(fā)長出先菌絲，隨后先菌絲變長，中間開始膨大變粗，且分隔，在側面分隔線處長出擔孢子，其成熟后脫落，呈短桿狀，繼續(xù)培養(yǎng)，菌液中出現(xiàn)比擔孢子長幾倍的菌絲[6，7]。中國計量學院生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室（以下簡稱本實驗室）建立了穩(wěn)定的菰黑粉菌分離培養(yǎng)鑒定方法，即分別采用PDA、YEPS培養(yǎng)基對灰茭中的菰黑粉菌進行冬孢子分離培養(yǎng)[8]，對正常茭白中的菰黑粉菌進行切片或研磨分離培養(yǎng)[9]，并通過形態(tài)學及分子生物學手段進行鑒定，結果表明，在固體培養(yǎng)基上，不同表型茭白中分離得到的菰黑粉菌菌落形態(tài)基本一致，呈不規(guī)則形、中間隆起或有脊狀突起，初為淡黃色，待培養(yǎng)到一定階段菌落邊緣長出白色菌絲。在液體培養(yǎng)基中，MT型菰黑粉菌多形成致密的菌絲球，T型菰黑粉菌則多以酵母形態(tài)存在[3]。另外二者在ITS區(qū)和蛋白水平上均存在一定的差異[10]。韓秀芹等[11]對菰黑粉菌的不同培養(yǎng)形態(tài)進行觀察，結果發(fā)現(xiàn)，其能在PSA培養(yǎng)基上完成生活史，即厚垣孢子萌發(fā)形成菌絲體后又重新形成厚垣孢子，但未有在PDA培養(yǎng)基上完成生活史的報道，這可能與菰黑粉菌對培養(yǎng)基有較大選擇性有關。

1.2菰黑粉菌的環(huán)境適應性

外界條件對菰黑粉菌的生長影響很大。郭得平等[12]研究發(fā)現(xiàn)，T型菰黑粉菌冬孢子萌發(fā)的適宜溫度為25～28℃，最適pH值為6.0，這與程巖等[5]的研究結果一致，而菌絲的最佳生長溫度為28℃，最適pH值亦為6.0。研究發(fā)現(xiàn)，T型菰黑粉菌對碳源的選擇性不強，但在以蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長較好；對不同氮源的利用差別較大，其中蛋白胨、天冬酰胺利于其菌絲生長，但是在以酵母膏和精氨酸為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長明顯受到抑制[12]。同時，T型菰黑粉菌在多種碳、氮源培養(yǎng)基中均能發(fā)生形態(tài)變化，而MT型菰黑粉菌僅在以蔗糖、麥芽糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中才能發(fā)生形態(tài)變化，表明體外培養(yǎng)時T型菰黑粉菌對環(huán)境適應性較強[13]。另外，茭白品種間菰黑粉菌的生物學特性略有差異，但其適宜生長溫度與肉質(zhì)莖膨大的適宜溫度基本吻合[14]。

2　菰黑粉菌與茭白植株的互作

2.1菰黑粉菌在茭白植株中的分布及形態(tài)變化

早期組織切片觀察已發(fā)現(xiàn)正常茭白膨大的肉質(zhì)莖內(nèi)存在大量的菰黑粉菌，此外茭白地下莖、葉鞘、嫩芽等部位也有分布[15]。研究表明，菰黑粉菌一般分布在茭白分蘗苗頂端細胞質(zhì)豐富、生理活動較為旺盛的部位，在液泡化程度較高的組織中幾乎消失[16]。Zhang等[4]通過進一步顯微觀察，描繪了菰黑粉菌的侵染過程：首先，在9月前或翌年3月后茭白植株內(nèi)的菰黑粉菌菌絲通過維管間組織、薄壁組織或維管束侵染地下莖萌發(fā)的嫩芽，之后順著細胞間隙或穿透細胞進行生長，其中部分胞間生長的菌絲長出大量短的分支，形成聚合菌絲（Hyphal aggregations），這可能是孢子的形成位點；部分胞間菌絲形成很多卷曲的側枝，構成菌絲簇，該種菌絲只能在茭白植株細胞中延伸較短的距離。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，灰茭中的菰黑粉菌潛育期短，在莖膨大過程中即有大量冬孢子聚集形成冬孢子堆；而正常茭白中的菰黑粉菌多以菌絲形態(tài)存在，只在莖部膨大后期才有少量冬孢子形成[3，17，18]。通過觀察寄生于茭白中的2種菰黑粉菌的超微結構發(fā)現(xiàn)，在菌絲細胞與寄主細胞表面凹陷處有1個包含內(nèi)、外2層基質(zhì)的隔膜，其中正常茭白組織細胞的外層基質(zhì)更厚，灰茭組織細胞的內(nèi)層基質(zhì)更透明。在冬孢子壁形成過程中，正常茭白中的保護隔膜更加明顯；MT型冬孢子內(nèi)的脂質(zhì)球很少，而T型冬孢子中的脂質(zhì)球在孢子外壁開始形成后便可觀察到[4]。另外，研究顯示隔膜內(nèi)層即靠近菌絲的為電子密集層，外層即靠近組織細胞的為絕緣層。比較發(fā)現(xiàn)，電子密集層在嫩芽和成熟莖中的分布較肉質(zhì)莖中更明顯，表明此時菌絲入侵活動劇烈[4]。

2.2菰黑粉菌侵染對茭白植株的影響

研究表明，菰黑粉菌的侵入致使植株薄壁細胞分裂加快，維管束極度簡化，生長錐膨大伸長，形成肥大肉質(zhì)莖[4，15]。該過程中茭白的內(nèi)源激素含量、營養(yǎng)吸收供應、糖代謝酶及保護酶活性等均發(fā)生明顯變化。

有學者認為，茭白孕茭是菰黑粉菌分泌吲哚乙酸等激素影響茭白莖部細胞分裂增強和細胞增大的結果[15]。前期，江解增等[19]對茭白發(fā)育過程中各部位內(nèi)源激素含量變化進行研究發(fā)現(xiàn)，茭白植株生育過程中各部位的激素以玉米素及玉米素核苷（Z+ZR）的含量最高，生長素（IAA）其次，赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）含量很低，不同茭白品種中不同部位激素含量及其變化具有一定的差異性，尤其是肉質(zhì)莖膨大階段差異比較明顯?？偟膩碚f，除GA3外，其余激素含量在肉質(zhì)莖膨大前即開始上升，其中Z+ZR含量在肉質(zhì)莖膨大開始后顯著下降；IAA含量在肉質(zhì)莖膨大后期至末期才出現(xiàn)下降；ABA含量則無明顯變化。另外，肉質(zhì)莖的干質(zhì)量增加也與其Z+ZR含量下降密切相關，因此認為Z+ZR可能是刺激肉質(zhì)莖膨大的關鍵激素。后期本實驗室檢測了離體培養(yǎng)的菰黑粉菌和肉質(zhì)莖形成過程中茭白不同地上部位間激素含量的變化，結果表明，菰黑粉菌合成的內(nèi)源激素可能是茭白肉質(zhì)莖形成的重要影響因素[10，20]。但是作用于茭白膨大過程中的激素是由于植株自發(fā)形成或是受到菰黑粉菌誘導、亦或由菰黑粉菌分泌還有待進一步研究確認。

此外，江解增等[21]還對茭白肉質(zhì)莖膨大前后庫源關系進行了深入研究，認為茭白植株在開始孕茭前植株生長及分蘗旺盛，為此時營養(yǎng)物質(zhì)供應的主要對象；另外研究發(fā)現(xiàn)，此過程中短縮莖的相對生長量大于葉片的相對生長量，故認為茭白植株中營養(yǎng)物質(zhì)供應的“中間庫”是短縮莖；進入膨大期后，植物生長中心開始轉(zhuǎn)移，肉質(zhì)莖成為此時營養(yǎng)物質(zhì)供應的“最終庫”。邱屆娟等[22]對茭白植株和肉質(zhì)莖中N、P、K含量分析表明，茭白孕茭過程中肉質(zhì)莖中N、P、K含量均顯著增加，而葉片和短縮莖中的N、P、K含量不同程度下降，同時肉質(zhì)莖中P、K吸收比例明顯高于同期的植株，特別是P高出1倍左右，因此茭白孕茭對營養(yǎng)的需求很大，特別是P元素，缺P對植株孕茭影響很大。

程龍軍等[23]進一步對茭白肉質(zhì)莖膨大期間主要營養(yǎng)物質(zhì)變化進行跟蹤研究，結果顯示，木質(zhì)素和纖維素在肉質(zhì)莖發(fā)育的早期含量較高，隨著莖的發(fā)育，其含量持續(xù)下降，發(fā)育后期二者的含量又明顯上升，這可能與茭白肉質(zhì)莖的個體發(fā)育進程有關。而蛋白質(zhì)含量以可溶性蛋白為主，總蛋白含量表現(xiàn)為前期上升，達到峰值后又開始下降，表明肉質(zhì)莖發(fā)育期間組織代謝旺盛，蛋白質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì)被貯藏的同時也要消耗大量的活性蛋白。另外研究還發(fā)現(xiàn)，總糖和還原糖在肉質(zhì)莖發(fā)育的早期迅速上升，之后有所下降；淀粉含量在肉質(zhì)莖發(fā)育過程中一直上升；而蔗糖含量則呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定的趨勢。糖類物質(zhì)在茭白莖發(fā)育的前期保持增長，表明肉質(zhì)莖發(fā)育中大量糖類同化物質(zhì)被調(diào)入。江解增等[24]對糖分轉(zhuǎn)化酶活性進行比較研究發(fā)現(xiàn)，在茭白膨大過程中肉質(zhì)莖內(nèi)的酸性轉(zhuǎn)化酶活性較高，說明蔗糖進入肉質(zhì)莖后，很快被轉(zhuǎn)化，用于細胞分裂、膨大和器官建成；中性轉(zhuǎn)化酶活性較低，說明細胞內(nèi)部的蔗糖轉(zhuǎn)化、積累速率較低。由于蔗糖合成酶具有雙向催化能力，研究顯示，肉質(zhì)莖中的蔗糖合成酶表現(xiàn)為分解方向一直維持較高活性，而合成方向活性較低且以較快速率下降，說明蔗糖主要靠其他器官合成并運輸至肉質(zhì)莖中，當糖分以蔗糖形式運輸?shù)饺赓|(zhì)莖后以較高的速率被再次分解，轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。

菰黑粉菌作為茭白植株的內(nèi)生真菌，需要從植株中獲取養(yǎng)分，其選擇性地在膨大莖中增殖，使得植株對營養(yǎng)元素的吸收以及營養(yǎng)供應發(fā)生改變。同時，也有學者將茭白肉質(zhì)莖的膨大過程看作是菰黑粉菌對茭白植株莖尖的致病過程[25，26]，該過程中植物為抵抗病原菌的入侵會產(chǎn)生大量活性氧，對菌產(chǎn)生氧化脅迫。該推斷與前期研究結果一致，即在茭白孕茭過程中，茭白組織內(nèi)過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）含量大幅度上升，抗壞血酸含量下降，氧化型抗壞血酸的比例上升[27，28]，而過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）及超氧化物歧化酶（SOD）等常見保護酶活性均呈下降趨勢，尤其是CAT、PAL、SOD活性下降幅度相當大，且肉質(zhì)莖內(nèi)CAT活性始終顯著高于雄茭莖尖[29]，表明肉質(zhì)莖膨大期間活性氧水平偏高。

2.3外界條件對菰黑粉菌與茭白植株互作的影響

外界條件對菰黑粉菌與茭白植株的互作影響較大，調(diào)控菰黑粉菌或植株的生長均可以調(diào)節(jié)茭白孕茭。芐曉東[30]通過研究1，2，4-三氯苯（TCB）和萘（NAP）脅迫對茭白生長發(fā)育的影響發(fā)現(xiàn)，隨著TCB、NAP脅迫濃度的增大，茭白植株的形態(tài)、生理等指標均下降，且TCB的抑制程度更大，此外對2種有毒物質(zhì)的耐性存在種間差異。房艷[31]研究發(fā)現(xiàn)，田間提前噴施適宜濃度的2-甲-4-氯鈉水劑，可使茭白提前采收約4 d，明顯增加前期產(chǎn)量。應榮等[32]研究殺菌劑敵磺鈉及植物生長調(diào)節(jié)劑對茭白孕茭影響發(fā)現(xiàn)，噴施一定濃度的敵磺鈉可明顯提高茭白產(chǎn)量；不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對茭白孕茭具有促進作用，表明茭白莖部菰黑粉菌的生長調(diào)節(jié)和植物內(nèi)源激素含量變化與孕茭密切相關。

3　菰黑粉菌的基因研究

3.1菰黑粉菌細胞壁降解修飾基因的功能研究

Nakajima等[33]發(fā)現(xiàn)，菰黑粉菌可分泌一種降解昆布多糖的酶，該酶與玉米瘤黑粉菌中GH3 β-葡萄糖苷酶具有較高同源性，由基因編碼，具有降解宿主細胞細胞壁的功能，將重組到米曲霉內(nèi)發(fā)現(xiàn)，重組子可降解β-1，3-、β-1，4-、β-1，6-寡聚糖，1，3-1，4-β-葡聚糖及昆布多糖，產(chǎn)生葡萄糖，進一步確認是一種β-葡糖苷酶。動力學分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)先水解昆布三糖和昆布四糖。隨后Nakajima等[34]從菰黑粉菌的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)另一種能降解昆布多糖的糖苷水解酶Lam16A，其擁有1個包含N-末端信號肽及C-末端GPI錨定信號肽的GH16催化結構域。將Lam16A在米曲霉中過表達，結果發(fā)現(xiàn)，其能水解β-1，3-葡聚糖，且在胞外、膜結構上均有定位，而過表達缺失GPI錨定信號肽的Lam16A只能在胞外結構中檢測到，故認為Lam16A錨定到質(zhì)膜可修飾菰黑粉菌細胞壁中的β-1，3-葡聚糖，同時分泌到細胞外可分解β-1，3-葡聚糖，推測在肉質(zhì)莖形成過程中，Lam16A既可修飾菰黑粉菌的細胞壁，又作用于宿主細胞壁中β-1，3-葡聚糖的降解。

3.2菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換相關基因的功能研究

研究發(fā)現(xiàn)，真菌的二型態(tài)轉(zhuǎn)換與其致病性密切相關[35，36]，因此菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換相關基因的研究對闡明茭白的孕茭機制具有重要意義。本實驗室對菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換相關基因開展了大量研究。劉俊平[13]已成功克隆菰黑粉菌乙醛酸循環(huán)中的關鍵基因（異檸檬酸裂合酶基因）和（線粒體氧化戊二酸載體蛋白基因），表達模式分析表明，在分別以麥芽糖、蔗糖、葡萄糖為唯一碳源的不同培養(yǎng)基中，菰黑粉菌中

的表達量均高于常規(guī)的PDA培養(yǎng)，且在麥芽糖培養(yǎng)基中表達量最高，結合型態(tài)變化，推測這可能與菰黑粉菌生長過程中的營養(yǎng)需求和代謝調(diào)控相關，而和基因可能參與菰黑粉菌的型態(tài)變化調(diào)控。胡鵬等[37]研究表明，因子的表達與菰黑粉菌的菌絲生長關聯(lián)較大，在菌絲形成初期，T型和MT型菰黑粉菌中基因的表達水平均較低；菌絲形成后，基因的表達量均顯著升高，隨后逐漸下降，推測基因與玉米瘤黑粉菌類似，參與反饋調(diào)節(jié)信息素的表達。余佳佳等[38]研究發(fā)現(xiàn)，T型和MT型菰黑粉菌中基因的表達量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在菌落周圍開始生長菌絲時達到最大值，故此認為基因可能與菰黑粉菌菌株的融合和菌絲生長有關。

3.3菰黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究

此外，本實驗室建立了基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的菰黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，從酶的種類、濃度、酶解時間及溫度等方面優(yōu)化了菰黑粉菌原生質(zhì)體的制備條件，從穩(wěn)滲劑等條件優(yōu)化了原生質(zhì)體再生體系，同時篩選了潮霉素和萎銹靈作為菰黑粉菌轉(zhuǎn)化子的抗性篩選標記，并成功實現(xiàn)了基因敲除以及EGFP綠色熒光蛋白的過表達[39]，為進一步進行菰黑粉菌的基因功能研究提供了技術支持，為接下來開展菰黑粉菌與茭白互作機制的研究提供了保障。

4　展望

4.1菰黑粉菌種群多樣性研究

研究人員對不同品種茭白中的菰黑粉菌進行分離后發(fā)現(xiàn)，多個菌株在培養(yǎng)方式、適宜溫度、菌株萌發(fā)率、菌落形態(tài)特征等方面存在差異，認為菰黑粉菌可能存在不同的生理小種[14，40]。但是目前對于菰黑粉菌的種群多樣性研究還僅僅圍繞病原菌的生物學特性開展，對于菰黑粉菌是否存在種群多樣性或致病性分化的生理小種、種群分化與茭白品種之間是否存在相關性都需要進一步的驗證。另外，茭白是已知的菰黑粉菌的唯一寄主，該菌是否具有寄主?；曰蜻€有其他可能的寄主，該菌與其近源的玉米黑粉菌、大麥堅黑穗病菌等是否存在種群交疊或進化關系等方面的研究還是空白。因此，接下來可以從分子生物學角度深入開展菰黑粉菌的種群多樣性研究。

4.2菰黑粉菌與茭白植株互作機理研究及相關基因挖掘

茭白孕茭形成膨大莖的原因，有人認為是菰黑粉菌分泌激素刺激植株莖部細胞分裂活動加劇[15]，還有人認為是菰黑粉菌對茭白植株莖尖致病過程中兩者互作的結果[25，26]，2種觀點均表明菰黑粉菌的存在與茭白的形成密不可分，但目前尚缺乏系統(tǒng)研究，即從菰黑粉菌與茭白植株協(xié)同進化所形成的生理、生態(tài)和分子機理來充分研究其互作機制。本實驗室從菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換角度出發(fā)，已通過基因組測序分析克隆得到大量菰黑粉菌參與二型態(tài)轉(zhuǎn)換的基因。隨著菰黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立以及菰黑粉菌體外侵染體系的建立，一方面可以深入對已經(jīng)得到的基因功能進行深入分析，另一方面可從菰黑粉菌角度出發(fā)，結合分子生物學手段及組織細胞學技術，對菰黑粉菌與茭白植株互作機理進行深入研究，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析、互作蛋白篩選等技術挖掘更多參與互作的相關基因。

4.3品種選育

茭白種植及保種育種如今還是采用茭墩分離篩選的方式，人力、物力投入較大，且菰黑粉菌可能存在種群多樣性或生理小種分化，其可能混合存在于茭白植株中，造成茭白品種性狀不穩(wěn)定，退化明顯。因此，除了采用傳統(tǒng)的田間優(yōu)良性狀選育方式，還可采用分子生物學手段檢測茭白植株中菰黑粉菌的種群來保障茭白品種性狀的穩(wěn)定性，通過建立標準的菰黑粉菌侵染體系，以人工接種方式進行茭白育種是未來品種選育方式中新的發(fā)展方向。

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專家論壇李育軍

男，研究員，廣東省農(nóng)業(yè)科學院科技開發(fā)帶頭人曰中國駐多米尼克農(nóng)業(yè)專家組首席農(nóng)業(yè)專家，特立尼達和多巴哥國際合作項目農(nóng)業(yè)專家，菲律賓國際合作項目農(nóng)業(yè)專家曰農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制廣東科學觀測實驗站副主任，國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)甘薯產(chǎn)業(yè)技術體系廣州綜合試驗站專家團隊成員曰科技部和廣東省科技咨詢專家，廣東農(nóng)業(yè)科技園區(qū)專家組組長淵汕尾市冤，企業(yè)科技特派員淵省部產(chǎn)學研冤，農(nóng)村科技特派員。先后承擔并完成國家、部省、市項目70多項，其中主持或參與主持30多項。榮獲主要科技成果獎7項，科普獎1項，其中國家科技進步三等獎、廣東省科學技術二等獎、廣東省農(nóng)業(yè)技術推廣一等獎各1項等曰取得國家、省審定品種12個，新品種權1項，粵食衛(wèi)準字食品1個。發(fā)表主要學術論文80多篇，參編著作多部。

DOI:10.3865/j.issn.1001-3547.2016.06.012

收稿日期：2016-01-08

基金項目：浙江省公益項目（2014C32022）曰國家科技支撐計劃項目（2012BAD27B01）；國家自然科學基金項目（3147085）