王濤 溫桂海 張桂東 李恩君 武向鵬 苑昭獎 朱濤

miR-21調(diào)控PTEN/Akt信號通路抑制肝癌HepG2細胞增殖的實驗研究*

王濤1溫桂海1張桂東1李恩君1武向鵬1苑昭獎1朱濤2

(1.邯鄲市中心醫(yī)院普外一科， 河北 邯鄲 056001; 2.四川大學華西醫(yī)院， 成都 四川 610041)

目的 探討miR-21對于肝癌HepG2細胞增殖的調(diào)控作用及其相關(guān)的信號通路。方法 分別采用miR-21 mimic和miR-21 inhibitor上調(diào)和下調(diào)肝癌HepG2細胞中miR-21的表達量。在不同時間點(0h、24h和48h)對肝癌HepG2細胞的增殖水平使用MTT法進行檢測。在干預4h后，使用qPCR法對細胞中miR-21和PTEN mRNA水平進行檢測；并對PTEN和Akt蛋白水平及Akt磷酸化(phospho-Akt)水平使用western blot進行檢測。結(jié)果 與對照組相比較，給予miR-21 mimic干預的HepG2細胞活性呈時間依賴性增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。與對照組相比較，給予miR-21 inhibitor干預的HepG2細胞活性呈時間依賴性降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。在干預4h后與對照組相比較，miR-21 mimic干預的HepG2細胞miR-21 mRNA和Akt磷酸化水平明顯增加而PTEN mRNA和蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；同時與對照組相比較，miR-21 inhibitor干預的HepG2細胞miR-21 mRNA和Akt磷酸化水平明顯降低而PTEN mRNA和蛋白表達水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。 結(jié)論 該基礎(chǔ)研究表明miR-21可能可以通過PTEN/Akt信號通路對肝癌HepG2細胞的增殖產(chǎn)生關(guān)鍵性的調(diào)控作用。并通過抑制miR-21的表達具有抗肝臟腫瘤的價值，為進一步腫瘤臨床治療提供思路。

miR-21； PTEN； Akt； HepG2細胞

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，以惡性程度高、轉(zhuǎn)移能力強和患者生存時間短著稱[1-3]。故進一步揭示肝細胞癌的發(fā)生機制和探尋新的的治療方法將具有重要的臨床意義。MicroRNAs (miRNA)是真核細胞內(nèi)一類具有調(diào)控對應mRNA翻譯的非編碼RNA。目前發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤發(fā)生和腫瘤細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移以及凋亡等多個過程中扮演著重要的角色[4-6]。近期的部分研究顯示miR-21對于調(diào)控包括非小細胞肺癌A549細胞、結(jié)腸癌HCT116細胞以及食道癌Eca109等腫瘤細胞增殖和分化具有重要的價值[7-9]。進一步的研究顯示miR-21對于腫瘤的增殖和分化作用與PTEN/Akt信號通路密切相關(guān)[7, 10, 11]。故本研究是探討miR-21對于肝癌HepG2細胞增殖的調(diào)控旨作用及其相關(guān)的信號通路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 miR-21 mimic和miR-21 inhibitor采購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000和OPTI-MEN減血清培養(yǎng)基均購買于美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒和qPCR試劑盒均購自德國Qiagen公司；鼠抗人PTEN抗體、鼠抗人phospho-Akt抗體、鼠抗人Akt抗體和鼠抗人β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；小牛血清購自澳大利亞Gibco公司；MTT試劑盒購自美國Promega公司；其余試劑均為分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) 肝癌HepG2細胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清、100g/L青霉素、100g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。實驗時將細胞置于OPTI-MEN減血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用Lipofectamine 2000將終濃度為50nM的miR-control (陰性對照)、miR-21 mimic和miR-21 inhibitor對細胞進行轉(zhuǎn)染，4h后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細胞活性檢測 取對數(shù)生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100μL約含5×103個細胞。使用MTT比色試驗對轉(zhuǎn)染后后不同時間點(0h、24h和48h)的細胞生長狀態(tài)進行測定，實驗重復4次。細胞活性(%)=(OD干預組/OD 對照組0h)×100(%)[12]。

1.4 qPCR法檢測細胞中miR-21和PTEN mRNA表達檢測 干預4h后，按照qPCR試劑盒說明書提取細胞總RNA。U6作為miR-21的內(nèi)參照；β-actin作為PTEN的內(nèi)參照。引物：miR-21正義5′-ACGTT GTGTAGCTTAT CAGACTG-3′，反義5′-AATGGT TGTTCTCCA CACTCTC-3′；U6正義5′-ATTGG AACGATA CAGAG AAGATT-3′，反義5′-GGAAC GCTTCACG AATTTG-3′；PTEN正義 5′-TGGAT TCGAC TTAGACT TGACCT-3′，反義 5′-TGG CGGTGTCAT AATGTC TTTC-3′；β-actin正義：5′-CATGTAC GTTGCTAT CCAGGC-3′，反義：5′-CTCCTTAATG TCACGCACGAT-3′。按照試劑盒說明書介紹進行反轉(zhuǎn)錄和擴增實驗。使用2-ΔΔCt法對miR-21和PTEN mRNA表達水平進行測定，ΔΔCt= (Ct，目標-Ct，內(nèi)參照)干預組-(Ct，目標-Ct，內(nèi)參照)對照組[13]。

1.5 Western blot法檢測細胞中PTEN蛋白表達水平及磷酸化Akt水平 干預4h后，按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗人PTEN (1∶800)、Akt (1∶1000)、phospho-Akt (1∶1000)和β-actin (1∶1200)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1: 2000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。

1.6 統(tǒng)計學方法 計量資料以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法結(jié)果 使用MTT法對不同時間點(0h、24h和48h)的肝癌HepG2細胞活性進行測定。與對照組相比較，給予miR-21 mimic干預的HepG2細胞活性呈時間依賴性增加，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。與對照組相比較，給予miR-21 inhibitor干預的HepG2細胞活性呈時間依賴性降低，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見圖1。

Table 1 Cell viabilities of HepG2 cells at different time points (0 h, 24h and 48h)

分組 0h24h48hmiR-con組100100100miR-mimic組103.17±3.02①124.62±3.51①141.54±4.09①miR-inhibitor組98.87±2.74①②69.4±2.39①②47.17±1.59①②

注：對應時間點與對照組相比較 ①P<0.05；對應時間點與miR-mimic組相比較 ②P<0.05。

2.2 miR-21 mRNA的表達水平 在干預4h后，使用qPCR對HepG2細胞miR-21 mRNA的表達水平進行檢測。在干預4h后與對照組相比較，miR-21 mimic干預的HepG2細胞miR-21 mRNA表達水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同時與對照組比較，miR-21 inhibitor干預的HepG2細胞miR-21 mRNA明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見表2。

2.3 PTEN mRNA和蛋白表達水平 在干預4h后，使用qPCR和western blot對HepG2細胞PTEN mRNA和蛋白的表達水平進行檢測。在干預4h后與對照組相比較，miR-21 mimic干預的HepG2細胞PTEN mRNA和蛋白的表達水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同時與對照組相比較，miR-21 inhibitor干預的HepG2細胞PTEN mRNA和蛋白表達水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見表2和圖1。

表2 HepG2細胞miR-21和PTEN的表達水平及Akt磷酸化水平

注：與對照組相比較 ①P<0.05；與miR-mimic組相比較 ②P<0.05。

圖1 HepG2細胞PTEN蛋白表達的western blot結(jié)果

Figure 1 The western blot results of PTEN expression in HepG2 cells

2.4 Akt磷酸化水平 在干預4h后，使用western blot對HepG2細胞Akt磷酸化水平水平進行檢測。在干預4h后與對照組相比較，miR-21 mimic干預的HepG2細胞Akt磷酸化水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同時與對照組相比較，miR-21 inhibitor干預的HepG2細胞Akt磷酸化水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見表2和圖2。

圖2 HepG2細胞PTEN蛋白表達的western blot結(jié)果

Figure 2 The western blot results of the phosphorylation of Akt in HepG2 cells

3 討論

根據(jù)2011年的調(diào)查研究顯示肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)作為中國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約為250.28/10萬人，死亡率約為156.83/10萬人；與國外相比較，我國的肝癌的發(fā)病率和死亡率均處于較高水平[1-3, 14]。故進一步的揭示肝癌的發(fā)病機制及探尋新的治療藥物和方法將具有重要的價值和意義。

MicroRNAs (miRNA)是真核細胞內(nèi)的一類約為18～25個堿基構(gòu)成的非編碼的單鏈RNA，其能夠通過特異性的與特定基因(靶基因)轉(zhuǎn)錄的mRNA 3′ UTR區(qū)結(jié)合，并在RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)的作用下完全的或部分的抑制靶基因的表達[4-6]。大量的研究表明miRNA廣泛的參與了生物的生長、發(fā)育、衰老、損傷修復、免疫反應、炎癥反應以及腫瘤生成分化等生理和病理過程[4-6]。近期的研究分析顯示人類miRNA基因數(shù)估計大于1000個，其可以調(diào)控約超過30%的蛋白編碼基因的翻譯過程[4-6]。目前研究發(fā)現(xiàn)miR-21對于非小細胞肺癌A549細胞、結(jié)腸癌HCT116細胞以及食道癌Eca109細胞等多種腫瘤細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡以及腫瘤血管生成過程有重要的調(diào)控作用[7-9, 15]。Liu T等人的研究發(fā)現(xiàn)miR-21對于調(diào)節(jié)移植瘤小鼠腫瘤組織內(nèi)的食道鱗狀細胞癌Eca109細胞的增殖有重要作用[15]。Tao YJ等的實驗證實通過反義核苷(antisense oligonucleotides)技術(shù)抑制miR-21表達后可以通過調(diào)控PTEN/Akt信號通路有效抑制人結(jié)腸癌HCT116細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[9]。同時Yang Z等的研究顯示抑制miR-21的表達可以通過PTEN相關(guān)的信號通路增加非小細胞肺癌A549細胞對于化療藥物順鉑(cisplatin)的敏感性[7]。此外還有研究表明miR-21在腫瘤組織中的表達水平與腫瘤的分期以及患者的預后存在密切的相關(guān)性[16]。在本研究中我們首先使用MTT法對不同時間點(0h、24h和48h)的肝癌HepG2細胞活性進行測定后發(fā)現(xiàn)與對照組相比較，給予miR-21 mimic干預的HepG2細胞活性呈時間依賴性增加，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。與對照組相比較，給予miR-21 inhibitor干預的HepG2細胞活性呈時間依賴性降低，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。該實驗結(jié)果表明miR-21對于肝癌HepG2細胞增殖的具有重要的調(diào)控作用。

PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)作為一種抑癌基因產(chǎn)物對于細胞的增殖和分化以及凋亡過程均具有重要的調(diào)控作用[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)PTEN具有雙特異磷酸酶活性，可通過去除磷酸基修飾其他蛋白質(zhì)和脂肪[17-19]。其主要底物包括PI3K和Akt等重要的信號通路蛋白激酶[17-19]。目前研究表明PTEN表達缺失和突變在包括肝細胞癌、胰腺癌和非小細胞肺癌等多種腫瘤的生長、增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤等過程中均扮演著重要的角色[17-19]。如Wang L等對56例肝細胞肝癌患者切除的腫瘤組織進行分析發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中PTEN表達陽性率僅為42.9%，而癌周組織PTEN表達陽性率為100%；同時發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的PTEN突變率為100%，PTEN基因啟動子部位甲基化率為16.1%[19]。目前研究表明miR-21對于PTEN/Akt信號通路有重要的調(diào)控作用[10]。Xu J等研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-21的表達可以通過抑制PTEN的生物活性促進宮頸癌細胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移能力[10, 20]。本研究顯示在干預4h后與對照組相比較，miR-21 mimic干預的HepG2細胞miR-21 mRNA和Akt磷酸化水平明顯增加而PTEN mRNA和蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；同時與對照組相比較，miR-21 inhibitor干預的HepG2細胞miR-21 mRNA和Akt磷酸化水平明顯降低而PTEN mRNA和蛋白表達水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。該結(jié)果表明在肝癌HepG2細胞中miR-21對PTEN/Akt信號通路具有重要的調(diào)控作用。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明miR-21可能可以通過PTEN/Akt信號通路對肝癌HepG2細胞的增殖產(chǎn)生關(guān)鍵性的調(diào)控作用。并提示通過抑制miR-21的表達具有抗肝臟腫瘤的價值，此為進一步的腫瘤臨床治療提供了思路。

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miR-21 regulates tumor cells proliferation through PTEN/Akt signaling pathway in hepatocellular carcinoma HepG2 cells

WANG Tao1, WEN Guihai1, ZHANG Guidong1,etal

(1DepartmentofTheFirstGeneralSurgery,HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China;2TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610000,China)

Objective To explore the value of miR-21 on the regulation of hepatocellular carcinoma HepG2 cells proliferation and its signaling pathway.Methods miR-21 mimic and miR-21 inhibitor were used to up-regulate and down-regulate the expression of miR-21 in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. Then, MTT was performed to evaluate HepG2 cells viabilities. And qPCR was included to analyze the mRNA expression of miR-21 and PTEN. Meanwhile, the protein expression of PTEN and the phosphorylation of Akt were detected by western blot. Results Our data showed that the cell viabilities of HepG2 cells were time-dependently increased by miR-21 mimic, and, time-dependently decreased by miR-21 inhibitor. And after 4h of interventions, miR-21 mimic up-regulated and miR-21 inhibitor down-regulated the mRNA of miR-21 and the phosphorylation of Akt, respectively. Meanwhile, the mRNA and protein expression of PTEN was inhibited by miR-21 mimic and promoted by miR-21 inhibitor. Conclusion These results indicate that miR-21 could mediate the tumor proliferation possibly through PTEN/Akt signaling pathway in hepatocellular carcinoma HepG2 cells.

miR-21; PTEN; Akt; HepG2 cells

中國博士后科學基金(2014M552369)

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.02.007

2015-08-28； 編輯： 張文秀)