孫夢婕，李尤艷，2，肖智

( 1.遵義醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院; 2.遵義市第一人民醫(yī)院眼科; 3.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義　563000)

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中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)D-絲氨酸促進(jìn)大鼠電針耐受

孫夢婕1，李尤艷1，2，肖智3

( 1.遵義醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院; 2.遵義市第一人民醫(yī)院眼科; 3.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義563000)

【摘要】目的:觀察大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)( PAG)中D-絲氨酸( D-ser)在大鼠電針耐受形成和維持中的作用并探討其初步的中樞神經(jīng)機(jī)制。方法: SD大鼠給予多次電針刺激后建立大鼠電針耐受模型;觀察電針耐受大鼠機(jī)械痛閾( MWT)變化百分?jǐn)?shù)的改變; ELISA法檢測大鼠在電針耐受前后PAG中D-ser水平變化;電針耐受大鼠PAG微量注射星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑－氟代檸檬酸( Fc)后給予電針刺激觀察大鼠MWT變化百分?jǐn)?shù)改變。結(jié)果:大鼠經(jīng)多次電針刺激后，其MWT變化百分?jǐn)?shù)逐漸降低伴PAG中D-ser水平逐漸升高;電針耐受大鼠給予Fc后再電針刺激，PAG中D-ser水平下降，大鼠MWT變化百分?jǐn)?shù)升高。結(jié)論:多次外周穴位電針刺激導(dǎo)致大鼠電針耐受形成，其機(jī)制與PAG中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化引起D-ser釋放增加有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】電針;耐受; D－絲氨酸;中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2016-3-4 10∶16網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160304.1016.018.html

臨床上對多種疼痛采用外周穴位針刺方法進(jìn)行鎮(zhèn)痛治療，取得很好的鎮(zhèn)痛效果。電針( electroacupuncture，EA)是對傳統(tǒng)手針進(jìn)行改進(jìn)后的一種針刺方法，它通過在外周穴位給予電刺激進(jìn)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。臨床已將電針用于手術(shù)后疼痛、頭痛、痛經(jīng)、肌筋膜痛、腰背疼痛等多種疾病的鎮(zhèn)痛治療，但長時(shí)間或反復(fù)多次給予人或動(dòng)物電針刺激，電針的鎮(zhèn)痛效應(yīng)會(huì)逐漸減低以致消失，表現(xiàn)為電針耐受( electroacupuncture tolerance)。由于電針耐受的出現(xiàn)極大的限制了電針在臨床鎮(zhèn)痛治療中的運(yùn)用，因此，對電針耐受形成和維持機(jī)制的研究非常重要。

多年研究結(jié)果證實(shí)，機(jī)體存在一個(gè)內(nèi)源性的疼痛調(diào)節(jié)系統(tǒng)，包括:下行性疼痛抑制系統(tǒng)和下行性疼痛易化系統(tǒng)。中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)( periaqueductal gray，PAG)是位于中腦頂蓋和被蓋之間，圍繞中腦導(dǎo)水管的環(huán)形區(qū)域。PAG是機(jī)體內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的關(guān)鍵部位，在疼痛調(diào)制和嗎啡耐受的形成、維持機(jī)制中均有重要作用［1］。

既往認(rèn)為細(xì)菌和無脊椎動(dòng)物體內(nèi)存在D型氨基酸而哺乳動(dòng)物體內(nèi)僅存在L型氨基酸，隨著研究方法和儀器的進(jìn)步發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物大腦中也存在D型氨基酸，例如: D-天冬氨酸，D-絲氨酸( D-serine，DSer)等［2］。D-Ser由絲氨酸消旋酶( serine racemase，SR)將L-serine轉(zhuǎn)化而來;同時(shí)大量研究提示，DSer可以作為神經(jīng)遞質(zhì)或膠質(zhì)遞質(zhì)由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞所分泌。N-甲基-D-天門冬氨酸( N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體NR1亞基存在“甘氨酸位點(diǎn)”，該位點(diǎn)被甘氨酸結(jié)合后，NMDA受體才能被激活。D-Ser可以與該“甘氨酸位點(diǎn)”結(jié)合且結(jié)合效能遠(yuǎn)大于甘氨酸;同時(shí)，D-Ser不能被甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體所轉(zhuǎn)運(yùn)，因而不受重吸收機(jī)制的調(diào)節(jié)。由于NMDA受體參與機(jī)體多種生理、病理機(jī)制的調(diào)節(jié)過程，因此，D-Ser可以通過調(diào)節(jié)NMDA受體的功能介入多種生理、病理過程的調(diào)節(jié)機(jī)制。

對嗎啡耐受機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，慢性嗎啡治療可引起NMDA受體活化，細(xì)胞內(nèi)Ca2 +水平增加，激活胞內(nèi)PKC信號途徑，最后引起μ阿片受體磷酸化，嗎啡耐受形成。由于嗎啡耐受和電針耐受存在交叉耐受，因此，D-Ser可能也通過調(diào)節(jié)NMDA受體功能參與電針耐受的形成和維持機(jī)制。明確PAG 中D-Ser是否介入大鼠電針耐受的機(jī)制是本研究的主要目的。

本研究將通過建立電針耐受大鼠模型，觀察電針耐受大鼠中腦PAG中D-Ser水平變化;此外在電針耐受大鼠PAG中給予星形膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制劑氟代檸檬酸( fluorocitrate，F(xiàn)c)后觀察Fc對大鼠電針耐受的影響。通過本研究可以加深對電針耐受機(jī)制的認(rèn)識，為開發(fā)“只鎮(zhèn)痛少耐受”的新型鎮(zhèn)痛藥物提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及分組

清潔級成年雄性Sprague-Dawley( SD)大鼠共84只購于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)，體重210～220 g，實(shí)驗(yàn)期間分籠飼養(yǎng)，3～4只大鼠1籠;大鼠置于安靜，溫度( 24±1)℃，濕度( 60±5) %，人工光照，明暗各12 h/d( 8AM-8PM)周期的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照國際疼痛研究協(xié)會(huì)( International Association for the Study of Pain，IASP)關(guān)于應(yīng)用動(dòng)物進(jìn)行疼痛研究的倫理綱要進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)過程中盡量減少動(dòng)物的不適和動(dòng)物的使用量。

按照隨機(jī)數(shù)字表法將84只大鼠隨機(jī)分為7組( n =12) :正常組( normal)、假電針組( sham-EA)、電針組( EA)、電針+人工腦脊液組( artificial cerebrospinal fluid，aCSF) ( EA + aCSF)和電針+ Fc組( EA + Fc) ; EA + Fc組按照Fc劑量再分為EA +0. 3 μg Fc、EA +0. 6 μg Fc和EA + 1. 2 μg Fc低、中、高劑量3個(gè)亞組;正常組不作任何處理，單純飼養(yǎng); EA組、EA + aCSF組、EA + Fc組大鼠給予外周穴位電針刺激，1次/d，共6次; EA + aCSF組和EA + Fc組大鼠給予PAG外側(cè)區(qū)( lateral subregion of the PAG，lPAG)植管并通過植管微量注射aCSF或不同劑量Fc。假電針組大鼠僅在外周穴位給予針刺，不通電流。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

電子Von Frey測痛儀( IITC Life science公司，2390系列，美國)、冰凍切片機(jī)( Leica CM1950，德國)、腦立體定位儀( Narishige公司，SR-6R，日本)、全波長酶標(biāo)儀( Multiskan，美國)。氟代檸檬酸( Sigma Aldrich公司，美國)，溶于無菌生理鹽水中，濃度為10 μg /μL，微量注射時(shí)按需要稀釋成適合的終濃度。lPAG中微量注射量為( 0. 3 μg /0. 3 μL、0. 6 μg/0. 3 μL或1. 2 μg /0. 3 μL)。D-serine酶聯(lián)免疫分析試劑盒購于上海酶研生物科技有限公司。人工腦脊液中各種離子成份及其濃度( mmol/L) 為: NaCl 126，KCl 5，CaCl22，MgCl22，NaH2PO41. 25，NaHCO326，葡萄糖10。

1.3動(dòng)物模型建立

將大鼠置于固定籠內(nèi)，雙后肢及尾暴露于固定籠外，采用經(jīng)穴電針治療儀(華信經(jīng)穴電針治療儀HXZ-I-6型，成都)給予大鼠雙后肢“足三里”和“三陰交”穴位進(jìn)針，足三里:大鼠后膝關(guān)節(jié)下方，腓骨小頭下約5 mm;三陰交:在小腿內(nèi)側(cè)，內(nèi)踝尖上3 mm，脛骨內(nèi)側(cè)緣后方;進(jìn)針部位和針用75%酒精消毒。參照Huang的方法［3］建立大鼠電針耐受模型:大鼠在清醒狀態(tài)下給予方波刺激，波寬0. 2 ms，頻率100 Hz，按照1-2-3 mA強(qiáng)度遞增，每個(gè)強(qiáng)度維持10 min;每次電針30 min后檢測機(jī)械痛閾值( mechanical withdrawal threshold，MWT)，共電針6 d( 1 次/d)，隨刺激時(shí)間延長，電針的鎮(zhèn)痛效果逐漸降低導(dǎo)致電針耐受形成［4］。

1.4機(jī)械痛閾值的檢測

測定機(jī)械痛閾值( mechanical withdrawal threshold，MWT)時(shí)，室溫維持在20～24℃，保持周圍環(huán)境安靜。先將大鼠置于底帶孔的透明有機(jī)玻璃籠中30 min以上，使大鼠適應(yīng)環(huán)境，待大鼠停止行走、抓撓、直立、排便等活動(dòng)處于安靜狀態(tài)后開始檢測。通過網(wǎng)孔用電子von Frey纖維刺激大鼠后肢足底中部2 s，出現(xiàn)縮足反應(yīng)時(shí)讀數(shù)為MWT。建模前( 0 d)和建模后每天檢測大鼠MWT變化百分?jǐn)?shù)直到電針后6 d。檢測時(shí)間點(diǎn)為電針前( 0 d，此時(shí)為大鼠基礎(chǔ)痛閾)以及電針后每天的MWT并與基礎(chǔ)痛閾相比求得機(jī)械痛閾變化百分?jǐn)?shù)( %) = (電針后MWT值－基礎(chǔ)MWT值) /基礎(chǔ)MWT值×100%。MWT檢測在每次電針刺激后4 h進(jìn)行。

1.5中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)植管及微量注射

EA + aCSF組和EA + Fc組大鼠在建模前5 d給予4%水合氯醛麻醉( 10 mL/kg)，麻醉成功后，大鼠俯臥位置于腦立體定位儀上，切開頭皮，暴露顱骨，鉆孔，在PAG外側(cè)區(qū)( lateral PAG，lPAG)植管。lPAG的坐標(biāo)為:前囟后7. 80 mm，中線旁開0. 60 mm，顱骨表面下4. 5 mm。插入外直徑0. 8 mm的不銹鋼插管，用牙科磷酸鋅水門釘固定，單側(cè)插管，在插管內(nèi)放入一內(nèi)芯，防止插管堵塞。植管后給予青霉素鈉鹽(溶于2 mL無菌鹽水)腹腔注射預(yù)防感染和脫水。手術(shù)結(jié)束后放入籠中，保溫直到麻醉蘇醒。插管完成后，每日觀察大鼠的一般情況，生命體征以及運(yùn)動(dòng)功能變化，如果出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙(癱瘓、呼吸異常、插管腦脊液漏)等，排除在實(shí)驗(yàn)組外。大鼠電針刺激后6 d給予lPAG微量注射aCSF或不同劑量Fc，1次/d，連續(xù)3 d。注射藥物前輕度固定大鼠，用微量進(jìn)樣器連接注射針頭后給予注射，注射針頭長于導(dǎo)管1 mm。每次注射0.3 μL，3 min內(nèi)注射完畢，留針2 min，確保藥物的完全擴(kuò)散。整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過微量進(jìn)樣器注入2%伊文思藍(lán)0.1 μL，確定注射部位并與大鼠腦圖譜［5］比對，只有注射部位位于lPAG的大鼠數(shù)據(jù)才納入統(tǒng)計(jì)處理。

1.6 ELISA

大鼠麻醉后斷頭取腦，在冰盤上迅速摘取中腦，取PAG組織約100 mg，按照100 mg/mL加入PBS，pH7. 4，用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本解凍后保持在2～8℃。勻漿后4℃3 000 r/min離心20 min，收集上清液約500 μL。BCA試劑盒(碧云天)進(jìn)行總蛋白定量后，嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書操作檢測PAG中D-Ser的含量(設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔，分別進(jìn)行加樣。37℃溫育30 min后棄去液體，洗板30 s×5次。加入酶標(biāo)試劑50 μL，溫育30 min后棄去液體，洗板30 s× 5次。加入顯色劑A和B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min，加入終止液50 μL終止反應(yīng))。反應(yīng)終產(chǎn)物在酶標(biāo)儀以450 nm波長下測量各孔的吸光度( OD值)，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程計(jì)算對應(yīng)的樣品D-ser蛋白濃度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較采用重復(fù)測量方差分析;多組間數(shù)據(jù)比較采用兩因素方差( Two-Way ANOVA)和Post hoc Turky分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠持續(xù)電針刺激后耐受形成

EA組大鼠EA刺激1 d后，MWT變化百分?jǐn)?shù)為( 86. 7±12. 7) %，與正常組MWT變化百分?jǐn)?shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.001) ;連續(xù)6 d給予電針刺激，MWT變化百分?jǐn)?shù)逐漸變小，第6次電針刺激后MWT值變化百分?jǐn)?shù)為( 3. 5±2. 4) %，與正常組大鼠MWT變化百分?jǐn)?shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明隨著電針刺激次數(shù)的增多，電針的鎮(zhèn)痛效應(yīng)逐漸降低，電針耐受形成。假電針組大鼠在各觀察時(shí)間點(diǎn)與正常組大鼠MWT變化百分?jǐn)?shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

2.2電針耐受大鼠PAG中D-serine水平變化

取電針6次后時(shí)間點(diǎn)的正常組、假電針組和電針組大鼠，ELISA法檢測PAG中D-ser水平情況。結(jié)果提示:電針組大鼠PAG中D-ser水平增加，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 001) ;假電針組大鼠PAG中D-ser水平與正常組大鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.3 lPAG中微量注射氟代檸檬酸對電針耐受大鼠機(jī)械痛閾變化百分?jǐn)?shù)的影響

取電針耐受大鼠，給予lPAG中微量注射人工腦脊液或不同劑量Fc ( 0.3 μg、0.6 μg或1.2 μg)，1次/d，連續(xù)給予3 d，同時(shí)給予外周穴位電針刺激1次/d，共3次。觀察注射人工腦脊液或Fc后大鼠MWT變化百分?jǐn)?shù)。EA +0.3 μg Fc組與EA + aCSF組大鼠比較，MWT變化百分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EA + 0.6 μg Fc組和EA + 1.2 μg Fc組與EA + aCSF組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 001) ; EA + 0.6 μg Fc組與EA +1.2 μg Fc組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 001) (圖3)。

圖1　多次電針刺激對大鼠MWT變化百分?jǐn)?shù)的影響*P<0.001,#P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)正常組大鼠比較。

圖2　大鼠PAG中D－ser水平*P<0.001,與正常組大鼠比較。

圖3　lPAG微量注射Fc對電針耐受大鼠機(jī)械痛閾變化百分?jǐn)?shù)的影響*P<0001,與EA+aCSF組大鼠比較；#P<0001,與EA+0.6 μg Fc組大鼠比較。

2.4 lPAG中微量注射氟代檸檬酸對PAG中D-ser水平的影響

取電針耐受大鼠，給予lPAG中微量注射人工腦脊液或不同劑量Fc ( 0.3 μg、0.6 μg或1.2 μg)，1次/d，連續(xù)給予3 d，同時(shí)給予外周穴位電針刺激1 次/d，共3次。觀察注射人工腦脊液或Fc對大鼠PAG中D-ser水平的影響。EA +0.3 μg Fc組與EA + aCSF組大鼠比較，PAG中D-ser水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EA +0.6 μg Fc組和EA +1.2 μg Fc組與EA + aCSF組比較，PAG中D-ser水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 001) ; EA + 0.6 μg Fc組與EA + 1. 2 μg Fc組比較，PAG中D-ser水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 001) (圖4)。

圖4　lPAG微量注射Fc對電針耐受大鼠PAG中D－ser水平的影響*P<0.001,與EA+aCSF組大鼠比較；#P<0001,與EA+0.6 μg Fc組大鼠比較。

3　討論

本研究通過對大鼠進(jìn)行多次外周穴位電針，觀察在電針耐受的形成和維持中，大鼠PAG中D-ser水平的變化。主要研究結(jié)果包括以下幾個(gè)方面:( 1)多次電針刺激引起大鼠機(jī)械痛閾變化百分?jǐn)?shù)逐漸減小，電針耐受形成; ( 2)電針耐受大鼠與正常大鼠比較，PAG中D-ser水平升高; ( 3)電針耐受大鼠PAG中微量注射Fc后，大鼠機(jī)械痛閾變化百分?jǐn)?shù)增加，電針耐受癥狀緩解。

普遍認(rèn)為，電針耐受和嗎啡耐受的機(jī)制有許多共同點(diǎn)，且存在交叉耐受［6］，導(dǎo)致嗎啡耐受的機(jī)制同樣可能引起電針耐受。當(dāng)前研究已經(jīng)明確的引起嗎啡耐受的主要機(jī)制包括: ( 1)阿片受體改變，表現(xiàn)為受體表達(dá)量變化或受體內(nèi)化、G蛋白信號通路脫偶聯(lián)以及阿片受體的各受體亞型之間的相互作用等; ( 2)內(nèi)源性阿片拮抗系統(tǒng)的活化，包括:孤啡肽及其受體、去甲腎上腺素、八肽膽囊收縮素( CCK-8)和神經(jīng)肽FF等; ( 3) NMDA受體活化，一氧化氮( NO)生成增多等促進(jìn)嗎啡耐受形成。此外，近年發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞活化也與嗎啡耐受的形成和維持有關(guān)［7－8］。

PAG是阿片鎮(zhèn)痛和阿片耐受的關(guān)鍵部位，特別是其腹外側(cè)區(qū)［9－10］。近年研究提示PAG中小膠質(zhì)細(xì)胞活化后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( BDNF)釋放增多和NMDA受體表達(dá)上調(diào)促進(jìn)嗎啡耐受形成［11］。本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著電針次數(shù)的增多，大鼠機(jī)械痛閾變化百分?jǐn)?shù)逐漸減少，提示大鼠電針耐受的出現(xiàn);同時(shí)也觀察到，伴隨電針耐受的出現(xiàn)，大鼠PAG中D-ser水平的增高。說明PAG中D-ser水平的改變介入了大鼠電針耐受機(jī)制。

給予外源性甘氨酸可以增強(qiáng)NMDA受體對NMDA的反應(yīng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸結(jié)合于NMDA受體的甘氨酸位點(diǎn)是谷氨酸激活NMDA受體的基礎(chǔ)［12］。然而，通過近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在多個(gè)腦區(qū)，D-ser才是NMDA受體甘氨酸結(jié)合位點(diǎn)的內(nèi)源性配體［13－14］。D-ser的分布與NMDA受體表達(dá)分布平行。D-ser通過可以調(diào)節(jié)NMDA受體功能，參與對突觸可塑性、感覺信息傳遞、神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)毒理以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病(帕金森病、阿爾茲海默病、精神分裂癥等)機(jī)制的調(diào)節(jié)過程，同樣D-ser也可以通過調(diào)節(jié)NMDA受體的功能參與電針耐受的形成。

Chen等［15］發(fā)現(xiàn):慢性嗎啡治療引起脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和D-ser釋放增多，大鼠出現(xiàn)嗎啡耐受表現(xiàn);鞘內(nèi)給予D-氨基酸氧化酶( D-amino acid oxidase，DAAO)降低D-ser水平后可緩解大鼠嗎啡耐受表現(xiàn)，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和D-ser介入嗎啡耐受的脊髓機(jī)制。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過囊泡釋放或出胞作用釋放D-ser，值得一提的是近期研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元也能釋放D-ser和甘氨酸［16］。那么本研究中發(fā)現(xiàn)電針耐受大鼠PAG中D-ser水平增高，D-ser來源于何種細(xì)胞，我們采用星形膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制劑Fc進(jìn)行驗(yàn)證。Fc通過抑制順烏頭酸酶，干擾細(xì)胞內(nèi)三羧酸循環(huán)，對星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有特異性的抑制作用。通過給予Fc抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化達(dá)到鎮(zhèn)痛的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但采用Fc觀察膠質(zhì)細(xì)胞在嗎啡或電針耐受中的作用的研究相對較少。本研究通過在PAG中微量注射Fc抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后，PAG中D-ser水平下降并與Fc劑量相關(guān)，大鼠電針耐受癥狀緩解，其機(jī)制可能與Fc抑制PAG中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化減少D-ser的釋放有關(guān)。本課題組前期對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠PAG中D-ser水平的升高，達(dá)到( 1 800±327) ng/L，對大鼠的疼痛起緩解作用，其機(jī)制可能與PAG中NMDA受體的激活有關(guān)［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，電針耐受大鼠其PAG中D-ser水平進(jìn)一步增加，達(dá)到( 5 200±626) ng/L左右，由于D-ser水平的大幅增加，可能引起NMDA受體的過度激活，最終導(dǎo)致大鼠電針耐受的形成和維持。

以前認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞僅僅起營養(yǎng)和支持作用，近年研究提示膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放膠質(zhì)遞質(zhì)、促炎癥細(xì)胞因子等廣泛參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果證實(shí)PAG中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后通過促進(jìn)D-ser釋放介入電針耐受的形成和維持機(jī)制。本研究一方面加深了對電針耐受機(jī)制的認(rèn)識，另一方面為開發(fā)“只鎮(zhèn)痛少耐受”的新型鎮(zhèn)痛藥物或鎮(zhèn)痛方法提供新的理論依據(jù)。

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(學(xué)術(shù)編輯:張曉東)

論著

Midbrain periaqueductal gray D-serine facilitates electroacupuncture tolerance in rats

SUN Meng-jie1，LI You-yan1，2，XIAO Zhi3
( 1.Graduate School，Zunyi Medical College; 2.Department of Ophthalmology，the First People’s Hospital of Zunyi City; 3.Research Center for Medicine＆Biology，Zunyi Medical College，Zunyi 563000，Guizhou，China)

【Abstract】Objective: To investigate the role of midbrain periaqueductal gray ( PAG) D-serine( D-ser) in the mechanism of the electroacupuncture ( EA) induced tolerance in rats.Methods: Male Sprague-Dawley( SD) rats were randomly divided into 7 groups，namely，normal group，sham-EA group，EA group，EA plus artificial cerebrospinal fluid ( aCSF) group and EA plus Fc group.The EA plus Fc group was divided into low，middle and high Fc subgroups，and had 0. 3μg，0. 6μg and 1. 2μg Fc intra-PAG injection，respectively.The mechanical withdrawal threshold ( MWT) values were detected via an electronic von Frey apparatus.The ELISA technique was used for determination the alterations of D-ser level in the rats PAG on each observation time point.The effects of intra-lateral PAG ( lPAG) injection of Fc，a glial metabolic inhibitor，on MWT values and D-ser concentrations were further studied on EA tolerant rats.Results: In EA tolerant rats，the MWT percentage changes gradually decreased with an increase of D-ser levels in the PAG.The intralPAG injection of Fc increased the MWT percentage changes.Conclusion: Multiple EA treatments can induce tolerance via an astrocyte activation and an increased D-ser release in the PAG on rats.

【Key words】Electroacupuncture; Tolerance; D-serine; Midbrain periaqueductal gray

作者簡介:孫夢婕( 1984－)，女，碩士研究生。通訊作者:肖智，E-mail: xiaozhi1971@163.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金課題( 31160207)

收稿日期:2015－06－14

doi:10. 3969/j. issn. 1005-3697. 2016. 01.09

【文章編號】1005-3697( 2016) 01-0029-06

【中圖分類號】R745.42; R245.97

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A