陳宗禮， 張枝嬋， 韓愛琴， 柏 勇， 楊 洋， 張樂元

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 延安 716000)

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超聲波輔助氯化汞消毒污染組培棗苗的研究

陳宗禮， 張枝嬋， 韓愛琴， 柏 勇， 楊 洋， 張樂元

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 延安 716000)

摘要以細(xì)菌污染的晉南1號(hào)單倍體組培棗苗為材料，以乙醇、氯化汞和超聲波為主要試驗(yàn)因素，采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討超聲波輔助氯化汞消毒拯救污染組培苗及外植體消毒的優(yōu)化方法。結(jié)果表明，拯救污染組培苗的優(yōu)化組合消毒方法是70%乙醇浸泡30 s+0.1%氯化汞浸泡4 min+超聲(28 Hz, 25℃)15 min。該方法較之常規(guī)乙醇-氯化汞化學(xué)消毒方法，接種的外植體污染率降低了68.41%，其成活率提高了75.72%，增殖程度提高了4.41倍。該超聲波輔助氯化汞消毒的理化新方法，降低了外植體消毒中氯化汞的使用濃度和消毒時(shí)間，減少了消毒對(duì)環(huán)境的污染，能極大地提高消毒效果，可擴(kuò)展推廣到所有植物組織培養(yǎng)中外植體的消毒。

關(guān)鍵詞超聲波；氯化汞；組培棗苗；污染；消毒

Study on the ultrasonic assisted disinfection method to save pollution tissue culture seedling

CHEN Zong-li, ZHANG Zhi-chan, HAN Ai-qin, BAI Yong, YANG Yang, ZHANG Le-yuan

(Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube, College of Life Science, Yanan University, Yanan 716000, China)

AbstractTo obtainZizyphusjujubemill, Jinnan 1, tissue culture seedling contaminated with bacteria, methods were studied by using the ethanol, mercuric chloride and ultrasonic as primarily test factors together with the random block design of experiment. The results showed that optimal combined disinfection method for saving pollution tissue culture seedling was as follows samples soaked in 70% ethanol for 30 s, then in 0.1% mercuric chloride for 4 min and treated with ultrasonic(28 Hz, 25℃) for 15 min. Compared with the conventional ethanol-mercury chloride chemical disinfection method, pollution rate of inoculation explants with this method was reduced by 68.41%, the survival rate increased by 75.72%, the proliferation degree increased by 4.41 times. This new method of physical and chemical disinfection showed good feasibility.

Keywordsultrasonic; mercuric chloride; tissue culture jujube seedling; pollution; disinfection

植物組織培養(yǎng)中，篩選應(yīng)用適宜的消毒方法，降低消毒劑對(duì)外植體的損傷及對(duì)環(huán)境的污染，搶救被污染的珍稀組培材料，提高無菌系的成活率一直是受到關(guān)注和值得研究的一個(gè)重要問題，也是一項(xiàng)關(guān)系到組培效率的關(guān)鍵技術(shù)。目前，大多數(shù)研究集中在關(guān)于應(yīng)用化學(xué)消毒劑如乙醇、氯化汞、次氯酸鹽等的不同組合消毒方法的研究[1-6]；也有少數(shù)關(guān)于輔助應(yīng)用抗生素控制污染的研究[7]。眾所周知，化學(xué)消毒劑的使用只有達(dá)到一定濃度和作用時(shí)間時(shí)才可殺滅細(xì)菌消除或降低污染，但這同時(shí)也會(huì)對(duì)外植體細(xì)胞造成一定損傷，從而影響外植體的存活和萌發(fā)概率；輔助應(yīng)用抗生素雖可除去內(nèi)部組織所帶菌類，但其抑菌單一、藥效時(shí)間短、穩(wěn)定性差、容易使菌類產(chǎn)生抗藥性等缺點(diǎn)而受到限制[7]；同時(shí)，較大濃度的化學(xué)消毒劑的殘留物也會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定的影響。因此，非化學(xué)殺菌劑得到了越來越多的重視，其中之一就是超聲殺菌。近來，有關(guān)學(xué)者在不同植物組培[8-15]、微生物[16-18]和食品加工領(lǐng)域[19-21]進(jìn)行了超聲波輔助殺菌的消毒方法研究。植物組織培養(yǎng)中，新建的無菌系苗尤其是一些珍稀組培苗在實(shí)驗(yàn)室常被二次污染，致使試驗(yàn)受到嚴(yán)重影響甚或終止。關(guān)于拯救污染組培苗的方法的研究還未見報(bào)道。本文以晉南1號(hào)棗花藥培養(yǎng)獲得的單倍體試管二次污染苗為材料，進(jìn)行了超聲波輔助消毒的研究，旨在拯救二次污染的珍稀組培苗，同時(shí)探討組培外植體消毒的優(yōu)化方法。

1材料與方法

1.1材料

接種材料為繼代培養(yǎng)到第4代二次污染的晉南1號(hào)棗(Zizyphejujubemill jinnan 1zao)單倍體試管苗，培養(yǎng)基為CyI[22]。由陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。晉南1號(hào)棗是陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于1999年由楊陵農(nóng)博會(huì)引進(jìn)的優(yōu)良鮮熟棗品種(現(xiàn)種植于延安大學(xué)生物園內(nèi))，齊向英等2010年開展了晉南1號(hào)棗花藥培養(yǎng)并于2012年獲得單倍體株系試管苗，現(xiàn)存于陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

主要試劑：無水乙醇(廣東廣華科技股份有限公司)，氯化汞(天津環(huán)通精細(xì)化工廠)，均為分析純，使用時(shí)用重蒸水配制成所需濃度。

主要儀器：立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-75KBS, 上海申安醫(yī)療器械廠)，凈化工作臺(tái)(SW-CJ-1F, 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，超聲波清洗機(jī)(SB-5200DT, 寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在參閱文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選乙醇、氯化汞、附加超聲波處理3個(gè)主要影響消毒效果的因素，以不同濃度與時(shí)間組合形成11種消毒處理(A、B 、... K)，以文獻(xiàn)上較多使用的消毒處理為對(duì)照(CK)，共計(jì)12種處理組合(表1)，每個(gè)處理重復(fù)3次，按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)。各處理均以CyI[22]為培養(yǎng)基。

表1 污染組培棗苗的組合消毒處理

1.2.2接種與培養(yǎng)

選擇生理狀況基本一致并被細(xì)菌污染的晉南1號(hào)棗單倍體試管苗，在無菌條件下，于凈化工作臺(tái)中剪取培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基以上污染組培苗的莖段，放入裝有少量無菌水的無菌瓶中，先于無菌水清洗3次后按設(shè)計(jì)的污染苗不同消毒處理分別進(jìn)行消毒處理。將消毒過的材料在無菌條件下用無菌水沖洗4次，修剪成約1cm長(zhǎng)莖段接入培養(yǎng)瓶中[15]，每瓶接3個(gè)莖段，每個(gè)處理至少接入30個(gè)莖段，放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。前3 d進(jìn)行室內(nèi)自然光培養(yǎng)，之后進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度(25～28)℃, 相對(duì)濕度為50%～70%，光強(qiáng)為(1500～2000)lx，光照時(shí)數(shù)為12 h/d。

1.2.3觀察與統(tǒng)計(jì)

試管苗培養(yǎng)中，定期進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。接種7 d后，觀察統(tǒng)計(jì)各處理組培苗的成活數(shù)，污染數(shù)，褐化數(shù)；30 d時(shí)測(cè)量各處理的分枝數(shù)和苗高。最后計(jì)算污染率(污染數(shù)/接種總數(shù)×100%)，死亡率(死亡數(shù)/接種總數(shù)×100%)，褐化率(褐化數(shù)/接種總數(shù)×100%)，增殖程度(苗高系數(shù)×增值系數(shù))；其中，苗高系數(shù)=平均苗高/接種苗高，增殖系數(shù)=分枝數(shù)/成活苗數(shù)。所有測(cè)量數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；以污染率、成活率、褐化率、增殖程度作為評(píng)價(jià)各污染苗消毒處理的效果。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒處理對(duì)晉南1號(hào)棗單倍體污染率的影響

試驗(yàn)結(jié)果見表2。表2結(jié)果經(jīng)F檢驗(yàn)，F(xiàn)處理=36.46>F0.01(20, 10)=4.41，處理間差異極顯著。進(jìn)一步進(jìn)行SSR檢驗(yàn)， 以CK的污染率最高[(18.33±2.36)%]，極顯著地高于其它11種處理；E、I、G、J、K和F 污染率顯著地高于H，極顯著地高于C、A、B、D；H極顯著地高于C；C極顯著地高于A、B、D；而E、I、G、J、K和F相互間無顯著差異；A、B、D相互間亦無顯著差異；以A、B、D的污染率最低(均為0)。分析表明，以A、B、D 3種處理的消毒效果最優(yōu)(可達(dá)0污染)，其次是C處理(比CK降低污染17.17%)，再次是H處理(比CK降低污染15.26%)，第4是E、I、G、J、K和F (比CK降低污染11.44%～14.32%)。說明氯化汞濃度為0.5%、作用時(shí)間為8 min時(shí)殺菌效果最好。

表2 不同消毒處理對(duì)單倍體試管棗苗污染率(%)的影響

小寫字母表示0.05水平上差異顯著；大寫字母表示在0.01水平上差異顯著。相同字母表示差異不顯著；不同字母表示差異顯著或差異極顯著(下同)。

2.2不同消毒處理對(duì)晉南1號(hào)棗單倍體成活率的影響

試驗(yàn)結(jié)果見表3。表3結(jié)果經(jīng)F檢驗(yàn)，F(xiàn)處理=46.71>F0.01(20, 10)=4.41，處理間差異極顯著。進(jìn)一步進(jìn)行SSR檢驗(yàn)，以K處理的成活率最高，達(dá)(89.66%±3.67)%，極顯著地高于E、D、A、F、H、CK、B和C，顯著地高于G；K、I和J處理相互間無顯著差異。G處理顯著地高于E、D、A、F、H、CK、B和C，而E、D、A、F、H、CK、B和C 相互間亦無顯著差異。分析表明，以K、I兩種處理的成活率最優(yōu)，達(dá)(86.14±4.58)%～(89.66±3.67)%，分別是CK的1.83和1.76倍，其次是J和G處理，成活率分別是CK的1.57倍和1.53倍，再次是A、B、C、D、E、F和H，它們的成活率與CK無顯著差異。說明在超聲波輔助下，氯化汞濃度為0.1%，作用時(shí)間4～6 min的消毒組合，其消毒材料的成活率相對(duì)最高，而氯化汞濃度相對(duì)高的或作用時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)的消毒組合，其消毒材料的成活率都在極顯著地降低。

表3 不同消毒處理對(duì)單倍體試管棗苗成活率的影響

表4 不同消毒處理對(duì)單倍體試管棗苗褐化率(%)的影響

2.3不同消毒處理對(duì)晉南1號(hào)棗單倍體褐化率的影響

試驗(yàn)結(jié)果見表4。表4結(jié)果經(jīng)F檢驗(yàn)，F(xiàn)處理=54.60>F0.01(20, 10)=4.41，處理間差異極顯著。進(jìn)一步進(jìn)行SSR檢驗(yàn)，C處理的褐化率極顯著地高于其它11個(gè)處理；B、H、A、D和F的褐化率極顯著高于CK、G、E、J、I和K；CK顯著高于G，極顯著高于E、J、I和K；G和E顯著地高于J和I，極顯著高于K；而B、H、A、D和F處理相互間無顯著差異；G、E和J處理相互間也無顯著差異；I和K相互間亦無顯著差異。分析結(jié)果表明，以K和I兩種消毒處理的褐化率最低為(6.28±3.47)%～(8.07±3.88)%，比CK分別降低了80.77% 和75.28%；其次是G、E和J，比CK分別降低了41.41%、48.61%和69.04%；再次是B、H、A、D和F，比CK分別降低了70.71%、46.74%、37.67%、31.30%和30.90%。說明氯化汞濃度相對(duì)高的或作用時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)的消毒組合，其消毒材料的褐化率提高均極顯著；而在相同氯化汞濃度下，輔助超聲波消毒處理的褐化率提高極顯著(如處理C> B，F(xiàn)> CK)；比較A、B 2種處理，在相同氯化汞濃度下，增加70%乙醇進(jìn)行30 s的消毒處理(B)其褐化率比A有增加趨勢(shì)，但增加不顯著。

表5 不同消毒處理對(duì)單倍體試管棗苗增殖程度的影響

表6 各組合消毒處理結(jié)果的相關(guān)分析*

*：計(jì)算相關(guān)系數(shù)時(shí)不考慮A、B、C、D 4種處理，因其增殖程度均為零。

2.4不同消毒處理對(duì)晉南1號(hào)棗單倍體增殖程度的影響

試驗(yàn)結(jié)果見表5。表5結(jié)果經(jīng)F檢驗(yàn)，F(xiàn)處理=56.50>F0.01(20, 10)=4.41，處理間差異極顯著。進(jìn)一步進(jìn)行SSR檢驗(yàn)， I處理的增殖程度極顯著地高于其它11種處理；J、E、K的增殖程度極顯著地高于H、G、F，CK、A、B、C、D；H、G、F顯著地高于CK，極顯著地高于A、B、C、D；而J、E和K相互間無顯著差異；H、G和F相互間也無顯著差異；A、B、C、D和CK相互間亦無顯著差異。分析表明，以I處理的增殖程度最高(9.98±0.96)，是CK的10.40倍；其次是J、E和K處理，增殖程度分別是CK的4.41、3.91和3.90倍；再次是H、G和F，增殖程度分別是CK的2.39、2.22和1.71倍；而A、B、C、D 4種處理的增殖程度比CK有所減少，但減少均不顯著。說明相對(duì)較低濃度的氯化汞(0.1%)和較短的作用時(shí)間(4～5 min)輔助超聲波(28 Hz，25℃，15 min)和70%乙醇30 s處理的消毒組合其增殖程度相對(duì)最好(如處理I、J)。

2.5優(yōu)化消毒方案的選擇

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的污染率、成活率、褐化率和增殖程度4項(xiàng)參數(shù)作兩兩相關(guān)分析(表6)顯示：污染率與褐化率成弱正相關(guān)(Rc-b=0.09), 成活率與增殖程度成較強(qiáng)正相關(guān)(Rs-p=0.65), 污染率與成活率、污染率與增殖程度分別成弱負(fù)相關(guān)(Rc-s=-0.37,Rc-p=-0.27), 成活率與褐化率成強(qiáng)負(fù)相關(guān)(Rs-b=-0.96)，褐化率與增殖程度呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān)(Rb-p=-0.62)。以上總體分析反映出，接種的外植體污染率高在一定程度上會(huì)促使其褐化，其成活率與增殖程度則相應(yīng)降低(如處理CK)；接種的成活率高，其增殖程度將極顯著地提高(如處理I、J、K)；接種的褐化率高或低則其成活率與增殖程度將極顯著地降低或提高(如處理C、B、I、J、K、E)。

故評(píng)價(jià)不同消毒處理對(duì)外植體的消毒效果，既要考慮降低其污染率，即提高對(duì)有害微生物的滅菌效果，又要盡量減少消毒劑對(duì)外植體細(xì)胞的傷害，即要降低外植體的褐化率，提高外植體的接種成活率和增殖程度。據(jù)此，結(jié)合2.1至2.4的分析，A、B和D處理雖達(dá)零污染，但褐化率達(dá)(42.87±3.64)%～(55.74±2.89)%，成活率分別只有(55.05±5.93)%、(44.26±2.89)%和(11.28±7.47)%，增殖程度均為零；說明這幾種處理對(duì)外植體的傷害均很大，主要是較高濃度的氯化汞和較長(zhǎng)的消毒時(shí)間對(duì)外植體造成了毒害。而I處理的污染率[(5.8±2.37)%]極顯著地低于CK(比CK降低了68.41%)；其褐化率[(8.07±3.88)%]雖與K相當(dāng)，但卻極顯著地低于其它10種處理；其成活率[(86.14±4.58)%]雖與K相當(dāng)，但卻極顯著地高于其它10種處理；其增殖程度(9.98±0.96)均極顯著地高于其它11種處理。綜合分析顯示，以I組合消毒處理的消毒效果最優(yōu)。

3討論與結(jié)論

消毒技術(shù)是組培過程中的關(guān)鍵技術(shù)，關(guān)系到整個(gè)實(shí)驗(yàn)是否能夠成功。本研究通過隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，篩選出拯救污染組培棗苗的優(yōu)化消毒方法，即將外植體用70%乙醇浸泡30 s+0.1%氯化汞浸泡4 min+超聲波28 Hz，25℃，15 min。用該方法，可比常用的消毒方法降低外植體污染率68.41%，提高其成活率75.72%。該方法可擴(kuò)展到所有植物組織培養(yǎng)中外植體的消毒以及組培中被二次污染的珍稀組培材料的消毒拯救。

消毒技術(shù)中乙醇的常用濃度為70%，主要進(jìn)行表面消毒，它能吸收細(xì)菌蛋白的水分使其脫水變性凝固，從而殺滅細(xì)菌，同時(shí)具有濕潤(rùn)作用，能排除外植體表層組織的空氣，有利于其他滅菌劑的滲入；但其穿透力強(qiáng)，滅菌時(shí)間應(yīng)控制在30 s以內(nèi)[16]，延長(zhǎng)時(shí)間會(huì)造成外植體脫水，促進(jìn)褐化，影響其成活率和將來的生長(zhǎng)狀況。

氯化汞常用濃度為0.1%和0.5%，其殺菌原理是Hg2+可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)菌蛋白變性、酶失活[14]，從而殺滅細(xì)菌；但其殘毒較大，應(yīng)用無菌水充分沖洗消毒過的外植體以最大限度地清除其殘毒，否則會(huì)使外植體受到毒害而褐化。

采用超聲波消毒的機(jī)理是空化效應(yīng)，空化的基本效應(yīng)有高溫效應(yīng)、放電效應(yīng)、發(fā)光效應(yīng)、壓力效應(yīng)等。其中起殺菌作用的主要是高溫效應(yīng)和壓力效應(yīng)，在空化所產(chǎn)生的高溫高壓條件下, 水能夠分解成具有強(qiáng)氧化殺菌作用的OH-，H2O2而殺菌[8]；另外，“空化效應(yīng)”會(huì)釋放巨大能量, 產(chǎn)生局部瞬間高壓, 形成沖擊波, 使物體表面及液體介質(zhì)受到極大的沖擊力, 能量足以使細(xì)胞破裂，從而能使其中的菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)膜破裂，細(xì)胞內(nèi)含物膠體發(fā)生絮凝沉淀，凝膠發(fā)生液化或乳化而失去生物活性，達(dá)到殺菌的目的[8, 17-19]。

超聲與氯化汞聯(lián)合處理與傳統(tǒng)消毒方式相比可以降低氯化汞的用量及消毒時(shí)間，極大地降低了組培外植體的褐化率而提高了其成活率。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在相同氯化汞濃度下，輔助超聲波消毒處理的褐化率有極顯著提高(如處理C> B，F(xiàn)> CK)，可能有以下原因：一方面，在液體中附著在外植體壁上的Hg2+在超聲場(chǎng)的作用下會(huì)發(fā)生變化使之分散、松散、松脫而不易附著于外植體壁上[22]；但同時(shí)Hg2+會(huì)在超聲波作用下獲得巨大加速度，因此產(chǎn)生劇烈運(yùn)動(dòng)，在超聲波的空化效應(yīng)及伴隨效應(yīng)引起的促進(jìn)溶液滲透作用[23]下又易于侵入外植體細(xì)胞內(nèi)造成一定毒害；另一方面，在液體介質(zhì)中超聲作用下獲得巨大加速度的分子因此產(chǎn)生的劇烈運(yùn)動(dòng)，還會(huì)引起組織細(xì)胞容積和內(nèi)溶物移動(dòng)、變化及細(xì)胞原漿環(huán)流，這種作用可引起細(xì)胞某些功能的改變而易引起一定程度傷害[24]；或許是這兩方面的共同作用導(dǎo)致了超聲波輔助消毒中棗外植體褐化率一定程度的提高。因此，在消毒過程中，研究設(shè)置合適的超聲波處理功率和時(shí)間對(duì)于提高總體消毒效果也是非常必要的。

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中圖分類號(hào)Q943.1,Q322;S665.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)2095-1736(2016)02-0059-05

作者簡(jiǎn)介:陳宗禮，教授，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)，E-mal: yadxczl@126.com。

基金項(xiàng)目：陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2013KTZB02-03-01)；陜西省高水平大學(xué)建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2012SXTS06)；延安市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009KN-25)

收稿日期：2015-07-20；修回日期：2015-08-31

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.059