趙學(xué)蘭， 趙　越， 宋成軍

(1. 天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300074； 2. 環(huán)境保護(hù)部環(huán)境規(guī)劃院，北京100012； 3. 農(nóng)業(yè)部

規(guī)劃設(shè)計研究院 農(nóng)村能源與環(huán)保研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)廢棄物能源化利用重點實驗室，北京 100125)

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蚯蚓中超氧化物歧化酶(SOD)提取條件的優(yōu)化研究

趙學(xué)蘭1， 趙越2， 宋成軍3

(1. 天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300074； 2. 環(huán)境保護(hù)部環(huán)境規(guī)劃院，北京100012； 3. 農(nóng)業(yè)部

規(guī)劃設(shè)計研究院 農(nóng)村能源與環(huán)保研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)廢棄物能源化利用重點實驗室，北京 100125)

摘要超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是一種重要的抗氧化劑，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價值。利用磷酸鹽緩沖液提取赤子愛勝蚓(Eisenia foetida)中SOD，對H3PO4緩沖液pH值、熱處理溫度、料液比與(NH4)2SO4飽和度等關(guān)鍵參數(shù)設(shè)計單因素實驗，采用4因素4水平的正交試驗法[L(16)(45)]進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：熱處理溫度對蚯蚓SOD活性有顯著性影響，主次順序為：熱處理溫度>料液比>H3PO4緩沖液pH值>(NH4)2SO4飽和度。蚯蚓SOD的最佳提取工藝為： H3PO4緩沖液pH值為8.0、熱處理溫度為30℃，料液比為6，以及硫酸銨飽和度為51%～70%。正交實驗設(shè)計優(yōu)化后，蚯蚓SOD活性達(dá)到了2895.32 U/g[FW]。為大規(guī)模生產(chǎn)蚯蚓SOD提供了數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)鍵詞蚯蚓;超氧化物歧化酶(SOD)；活性；提取條件；正交試驗

Optimization of SOD extraction conditions from earthworm

ZHAO Xue-lan1, ZHAO Yue2, SONG Cheng-jun3

(1. Tianjin Vocaltional College of Bioengineering, Tianjin 300074; 2. Chinese Academy for Environmental Planning,Beijing 100012; 3. Key Laboratory of Energy Resource Utilization from Agricultural Residues (MOA), Institute of Energy and Environmental Protection, Chinese Academy of Agriculture Engineering, Beijing 100125, China)

AbstractSuperoxide dismutase (SOD) has been demonstrated to be an important antioxidant, which protects the cells exposed to the toxicity of oxygen and has displayed huge application value and development prospect. The phosphate buffer was used to extract SOD, the antioxidant component of earthwarm (Eiseniafoetida). Four key extraction process parameters selected for single-factor tests were phosphate buffer pH value， heat-treatment temperature， ratio of solid to liquid, and degree of saturation((NH4)2SO4). Four factors and four levels of orthogonal experiment were used to determine the optimum factors levels above. Then activity of the SOD was measured by adjacent benzene three phenolic autoxidation method. Results indicated that the optimal levels of these parameters were as follows: phosphate buffer pH value, 8.0; the heat treatment temperature, 30℃; ratio of solid to liquid 6, and degree of saturation((NH4)2SO4), 51%-70%. Under these conditions, the activity of the SOD was up to 2895.32 U/g[FW]. This study would provide a technical basis for the production of large scale production of SOD from earthworm.

Keywordsearthworm; superoxide dismutase; activity; extraction conditions; orthogonal experiment

世界上有蚯蚓4 000余種[5]，我國已經(jīng)記錄的有9科28屬306種[6]。蚯蚓特殊的生活環(huán)境賦予其體內(nèi)超氧化物歧化酶成分含量很高，回收率為35%[7]，蚯蚓SOD活性較其他物種高，每克鮮重高達(dá)4 000單位[8]。蚯蚓作為一種中藥材入藥已有很久的歷史，易飼養(yǎng)，價格低，對于大規(guī)模生產(chǎn)SOD，是一種很好的原料[9]。

本研究利用磷酸鹽緩沖液法提取蚯蚓SOD，再用鄰苯三酚自氧化法測定活性[10]。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用正交實驗方法，并以磷酸緩沖液pH值、熱處理溫度、料液比、(NH4)2SO4飽和度4個因素，設(shè)置不同水平對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1實驗材料

蚯蚓為赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)屬，大平二號種，天津蚯蚓養(yǎng)殖場贈送。試驗選取體重0.4～0.5 g/條，大小相同、形態(tài)相似、發(fā)育良好的蚯蚓，試驗前馴養(yǎng)1周。

鄰苯三酚購于天津市化學(xué)試劑廠，牛血清蛋白購于上海生物技術(shù)發(fā)展公司，L-蛋氨酸購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，考馬斯亮藍(lán)(G-250)購于上海生工生物工程股份有限公司，所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.2試驗因素

根據(jù)前期研究[9, 11， 12]，蚯蚓SOD提取過程及其活性受4個主要因素影響，即H3PO4緩沖液pH值(A)、熱處理溫度(B)、料液比(提取液體積與蚯蚓鮮重比例，C)與(NH4)2SO4飽和度(D)。

1.3實驗儀器

紫外分光光度計(UVmini-1240，蘇州島津公司)；冷凍離心機(TGL-16G-A型，上海安亭科學(xué)儀廠)；ZK高速自控組織搗碎機(江蘇省鹽城市龍岡科學(xué)儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋。

1.4實驗方法

1.4.1蚯蚓預(yù)處理

將新鮮蚯蚓洗凈，放入清水中，讓其排凈體內(nèi)內(nèi)含物。

1.4.2蚯蚓SOD粗酶液提取工藝流程

蚯蚓→H3PO4緩沖液(3倍體積的0.05 mol/L、pH 7.8)研磨勻漿(8 000 r/min，10 min)，共4次約40 min→過濾(雙層紗布)→0℃～4℃離心(3 000 r/min，15 min)→上清液移入試管→熱處理→粗酶液→測定SOD活性。

1.4.3SOD活性測定

參照GB/T5009·171-2003中酶活性方法進(jìn)行測定，將25℃時每分鐘反應(yīng)液中SOD抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時所需的SOD量為一個活力單位[10]。SOD活性的計算公式如下：

式中：V1為反應(yīng)液總體積(mL)；V2為測定樣品體積(mL)；N為樣品稀釋液倍數(shù)(本實驗的稀釋倍數(shù)為2)；D(λA)為鄰苯三酚的自氧化速率，D(λB)為樣品光密度值變化速率。

1.4.4單因素試驗

稱取粗酶液，分別以1.2中4個工藝參數(shù)為考察因素，以SOD活性為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗，每個處理重復(fù)3次。

1.4.5正交試驗優(yōu)化SOD提取工藝

根據(jù)SOD提取工藝相關(guān)文獻(xiàn)以及預(yù)實驗結(jié)果[9]，以SOD活性為響應(yīng)值，設(shè)計上述4個因素為主要因素，每個因素選擇4個水平，選用L16(45)正交表進(jìn)行試驗(表1)。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計L16(45)

1.5驗證試驗

如果正交試驗得出的優(yōu)化組合不在16組試驗中，則對該組合提取的SOD活性進(jìn)行試驗驗證。酶液制取、活性測試及測試儀器與1.4和1.5相同。

圖1 pH值對蚯蚓SOD活性的影響

2 結(jié)果與討論

2.1pH值對蚯蚓SOD活性的影響

植物中SOD粗提液制備技術(shù)目前采用的方法主要包括磷酸緩沖液提取法、Tris-HCl和熱變性法。其中，H3PO4緩沖液法用得較多，且緩沖液pH值是影響粗提液SOD活力的重要因素[3]。用H3PO4緩沖溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，在室溫下測定酶活性，結(jié)果如圖1。在pH 8.0時，SOD活性達(dá)到最高，為3375.00U/g[FW]，在pH 7.5時，活性較前者較小，差別不明顯，在pH 8.0和7.5時，SOD活性達(dá)到最高，較pH 6.5時的SOD活力分別顯著高出125%和117%?？梢?，在pH 7.5～8.0的H3PO4緩沖液中，SOD活性可一直維持在高水平上，在pH 8.0時，酶活可穩(wěn)定在最高活性的85%左右，這與前人報道的大蒜SOD酶在pH 6～8的H3PO4緩沖液中酶活性最高相一致[13]。

2.2溫度對蚯蚓SOD活性的影響

SOD是酸性蛋白質(zhì)，較穩(wěn)定，保守性強，對環(huán)境溫度適應(yīng)范圍廣，是一種熱穩(wěn)定性很好的酶[13]。圖2顯示，30℃下，SOD酶活性較小，隨著溫度升高，SOD活性顯著升高，在40℃下，SOD活性達(dá)到最高，酶活為2 752.00 U/g[FW]，在45℃下，活性最小，酶活為2 250.00 U/g[FW]。40℃下，SOD活力較30℃和45℃分別顯著增長了41.30%和44.44%。以上表明，適當(dāng)?shù)臒崽幚頊囟瓤梢暂^大幅度提高SOD活性。張娟等[14]對貯存溫度對蜂王漿中SOD活性的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)溫度變化對蜂王漿SOD 活力有明顯影響，適宜的保存溫度對蜂王漿的活性物質(zhì)至關(guān)重要。這與我們的研究結(jié)果一致。蚯蚓與豬血中SOD活性對溫度的反應(yīng)相差較大，豬血SOD 在溫度55℃～65℃下一定時間內(nèi)，活性變化不大[15]?？赡艿脑驗轵球維OD在自身抗逆性方面的反應(yīng)[16]，姜巖巖等[17]研究得出低溫敏感性番茄通過提高SOD的活性來適應(yīng)低溫影響。

圖2 溫度對蚯蚓SOD活性的影響

2.3料液比對蚯蚓SOD活性的影響

料液比對蚯蚓SOD活性的影響如圖3所示，可以看出，料液比為10時，SOD活性最高，達(dá)到2544.00 U/g[FW]，為8時，SOD活性次之，為2 468.00 U/g[FW]，SOD活性僅增加了3.08%，增加不顯著。料液比為6時，SOD活性為2 325.00 U/g[FW]，料液比為4時，SOD活性最小，為1 950.00 U/g[FW]，前者比后者增加了19.23%，增加顯著。可見，料液比從4增加到10時，SOD活性逐漸增加，增加速率降低。

料液比與酶活呈明顯的雙曲線函數(shù)關(guān)系(y=2 586.1 644-3 646.9 491×(0.6461)x，R2=0.9987)也表明了這一點，當(dāng)料液比繼續(xù)增加時，SOD的總活性不再增加。因此，只有合適的提取液體積才能使蚯蚓SOD被充分提取出來，提取液過少SOD提取不完全，過高就會隨提取液體積的增加單位體積提取液內(nèi)所含的SOD總量減少，會使后期酶的產(chǎn)率降低，而且還增加了提取成本[18]。柳建平等[19]發(fā)現(xiàn)提取青梅SOD粗酶需要一個最佳的磷酸緩沖液與青梅果之比。因此，選擇蚯蚓鮮重6倍體積的提取液較為合適。

圖3 料液比對蚯蚓SOD活性的影響

2.4(NH4)2SO4飽和度對蚯蚓SOD活性的影響

鹽析法是工業(yè)上一種常用的純化蛋白質(zhì)的方法。硫酸銨由于價格低廉、溶解度大，且能使蛋白質(zhì)性質(zhì)保持穩(wěn)定而成為最常用的鹽析劑[20]。因此，本實驗把鹽析法作為提取蚯蚓SOD的方法。

圖4 (NH4)2SO4濃度對蚯蚓SOD活性的影響

蚯蚓SOD粗酶液在不同(NH4)2SO4飽和度下沉淀出的SOD活性如圖4所示?？梢钥闯?，飽和度在0%～30%、31%～50%范圍內(nèi)，其SOD活性分別為2 356 U/g[FW]和2 497 U/g[FW]，差別不明顯，飽和度在51%～70%范圍內(nèi)，SOD活性最高，達(dá)到2 861 U/g[FW]，增加明顯超過其他濃度范圍。當(dāng)飽和度在70%～80%范圍內(nèi)，SOD活性最低，為2 183 U/g[FW]，比最高值降低了31.06%。飽和度在50%～70%時， SOD總活性和比活性均最高，即蚯蚓SOD主要集中在飽和度為50%～70%內(nèi)的沉淀中。粗酶液添加硫酸銨至50%～70%飽和度，青梅SOD沉淀效果好，酶活提高了192%[19]。這為工廠化生產(chǎn)蚯蚓SOD提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

2.5正交實驗結(jié)果

根據(jù)表2 直觀分析可得，熱處理溫度對蚯蚓SOD活性有顯著性影響，因素主次順序為B>C>A=D，最佳提取工藝為：緩沖液pH值為8.0、熱處理溫度為30℃，料液比為6，以及(NH4)2SO4飽和度為51%～70%。

2.6驗證分析

因為上述組合不在正交試驗組合中，對該組合進(jìn)行試驗驗證。通過重復(fù)5次驗證實驗，結(jié)果變異系數(shù)為2.586%，蚯蚓SOD酶活的平均值為2 895.32 U/g[FW]，顯著高于16組試驗中的其它組合，表明最優(yōu)組合在提取過程中能保持較高的酶活，且較為穩(wěn)定。

表2 基于SOD活力的四因素綜合影響極差分析

3 結(jié)論

1)單因素試驗結(jié)果表明：蚯蚓SOD熱穩(wěn)定性很好，在35℃～40℃之間活性最高；4倍料液比最為適合；在pH 7.8～8.2時活性最高；(NH4)2SO4飽和度為50%～70%最為合適。

2)正交試驗結(jié)果表明：熱處理溫度對蚯蚓SOD活性有顯著性影響，主次順序為：熱處理溫度>料液比>H3PO4緩沖液pH值>(NH4)2SO4飽和度。得到了蚯蚓SOD的最佳提取工藝：緩沖液pH值為8.0、熱處理溫度為30℃，料液比為6，以及(NH4)2SO4飽和度為51%～70%。經(jīng)正交實驗設(shè)計優(yōu)化后，蚯蚓SOD酶活性達(dá)到了2 895.32 U/g[FW]。

本研究將蚯蚓作為SOD提取原料，為蚯蚓開辟了新的利用途徑，對促進(jìn)蚯蚓高值化、規(guī)?；①Y源化利用，具有重要的意義。

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中圖分類號S899.8； R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號2095-1736(2016)02-0072-04

作者簡介：趙學(xué)蘭，碩士，講師，從事細(xì)胞與分子生物學(xué)研究，E-mail: zxlan312@163.com；通信作者：宋成軍，主要從事農(nóng)業(yè)廢棄物生態(tài)化利用研究，E-mail: songchengjun232@sina.com。

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃課題：農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園區(qū)生產(chǎn)生活循環(huán)技術(shù)系統(tǒng)構(gòu)建與示范(No. 2015BAL04B05)

收稿日期：2015-07-30；修回日期：2015-10-08

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.072