李玲玲, 羅合春, 張先淑

(重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物化學(xué)工程系， 重慶 408000)

?

中華蘆薈內(nèi)生真菌抑菌活性研究

李玲玲, 羅合春, 張先淑

(重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物化學(xué)工程系， 重慶 408000)

摘要從中華蘆薈的根和葉中分離出8株內(nèi)生真菌，其中5株來自葉部，3株來自根部，將分離到的內(nèi)生真菌對4種指示菌枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、大腸埃希菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae進(jìn)行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)葉部和根部各有一株內(nèi)生真菌對3種指示細(xì)菌表現(xiàn)出抑菌活性，且葉部的內(nèi)生真菌對啤酒酵母也有抑制效果。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，這兩株內(nèi)生真菌都屬于黑曲霉。

關(guān)鍵詞內(nèi)生真菌; 中華蘆薈; 抑菌活性

Study on antimicrobial activity of endophytic fungi from Aloeveral.var.chinesis(haw.)

LI Ling-ling, LUO He-chun, ZHANG Xian-shu

(Biochemistry Engineering Department, Chongqing Industry & Trade Polytechnic, Chongqing 408000, China)

Abstract Eight strains of endophytic fungi were isolated from the leaf and root ofAloeveral.var.chinesis(haw.), in which, five from the leaf and three from the root. The antimicrobial activity from endophytic fungi was investigated by using the agar diffusion method and the cylinder plate method withBacillussubtilis,Escherichiacoli,StaphylococcusaureusandSaccharomycescerevisiaeas indicator microorganisms. The results showed that two of endophytic fungi which one was isolated from the leaf and the other from root had inhibitory activities toBacillussubtilis,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus, and the endophytic fungi from leaf showed antimicrobial activity toSaccharomycescerevisiae. They were classified asAspergillusNigerby their morphological features.

Keywords endophytic fungi;aloeveral.var.chinesis(haw.); antimicrobial activity

蘆薈是百合科(Liliaceae)蘆薈屬(Aloe) 多年生肉質(zhì)草本植物，作為生藥在我國已有1 000多年的應(yīng)用歷史。其體內(nèi)有160多種化學(xué)成分，其中藥用成分72種(多糖、蒽醌類、葡萄糖苷、脂類、有機酸、尿苷酸、多種酶、氨基酸、抗生素、皂角素、維生素等主要成分)，具有免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤，抗菌、消炎、抗病毒、抗輻射，促進(jìn)傷口愈合及護(hù)膚，對心血管病有一定的療效等。蘆薈藥用成分中的大黃素和多糖、糖蛋白均具有抗病毒、抗菌活性等[1]。在蘆薈內(nèi)生菌研究方面，國內(nèi)李能章和彭遠(yuǎn)義從中華蘆薈組織中分離出一株能產(chǎn)生廣譜抗菌活性物質(zhì)的內(nèi)生細(xì)菌[2]。尹建雯等對從中華蘆薈[Aloeveral. var.Chinese(Haw Berg)]、元江蘆薈(A．yuanjiangensisXiong & Zheng sp．nov．)及庫拉索蘆薈(A．barbadsisMill．)的根、葉、花柄、花中，分離到88株內(nèi)生真菌，作了革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的抑菌試驗，研究了其抗菌活性[3, 4]。同時也對88株內(nèi)生真菌進(jìn)行了抗真菌活性物質(zhì)篩選，其中35株蘆薈內(nèi)生真菌對多種皮膚致病真菌具有抑制生長作用[5]。黃江華等進(jìn)行了庫拉索蘆薈內(nèi)生真菌類群與分布的初步研究[6]。王莉衡等研究了蘆薈內(nèi)生菌內(nèi)生哈次木霉LH-7對植物病原菌的抗性[7]。柯野等從中華蘆薈的根和葉中分離出內(nèi)生真菌40株，分別對其液體發(fā)酵液進(jìn)行抗菌活性檢測，發(fā)現(xiàn)青霉屬LH4和頭孢屬LH34菌株具有抗菌活性[8]。內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性成分，因此由蘆薈內(nèi)生真菌生產(chǎn)與蘆薈相同或相近的藥用成分，是一條生產(chǎn)藥用代謝產(chǎn)物有效的、快速的途徑。本研究以中華蘆薈的根和葉為材料，分離內(nèi)生真菌，并對其抗菌活性研究，旨在尋找活性較好的內(nèi)生真菌，為尋找新型抗菌物質(zhì)提供資源，同時也為后期的代謝產(chǎn)物研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥用植物標(biāo)本：一株生長良好的無病變、無蟲咬的蘆薈，2014年10月份采集于重慶市涪陵區(qū)，全株取樣后放入塑料袋中，帶回實驗室沖洗干凈，備用。

供試指示菌：大腸埃希菌Escherichiacoli購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus和啤酒酵母Saccharomycescerevisiae為重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室保存。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)用于分離內(nèi)生真菌，液體培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于指示細(xì)菌的培養(yǎng)。

培養(yǎng)啤酒酵母指示菌的培養(yǎng)基配方Ⅳ[9]：胨30 g，檸檬酸鈉30 g，葡萄糖30 g，NaCl 30 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，初始pH 6.2～6.6。

1.2方法

1.2.1 材料的表面消毒

按常規(guī)無菌操作，取中華蘆薈的根和葉，按下列程序進(jìn)行表面消毒：流水沖洗5 h→75%酒精漂洗2 min→無菌水沖洗3次→5.4% NaClO溶液浸泡(葉5 min，根10 min)→無菌水沖洗3次，最后一次沖洗液留下備用。

1.2.2 內(nèi)生真菌的分離和純化

用無菌濾紙將各材料水分吸干后，分別稱取2 g，加10 mL無菌水研磨，取上清液0.1 mL涂布在PDA平板上，倒放于28℃培養(yǎng)7 d。

平板上菌落長出后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、邊緣狀態(tài)、透明度、表面干濕狀態(tài)等特征判斷分離出的菌落種類并計數(shù)，用平板劃線及直接用接種針取尖端菌絲等分離純化方法，經(jīng)過反復(fù)分離、純化，直至得到純化的典型菌落。

將已純化的菌株分別轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌株生長旺盛時。取出置4℃保藏。

1.2.3 消毒可靠性檢驗

1)漂洗液培養(yǎng)檢查。把最后一次漂洗消毒材料的漂洗液吸取0.1 mL涂布于PDA平板上，與內(nèi)生真菌分離平板放于相同條件下培養(yǎng)(倒放于28℃培養(yǎng)7 d)，觀察培養(yǎng)結(jié)果。

2)組織印跡檢查。用滅菌鑷子夾住已消毒過的蘆薈的根和葉，使其表面分別與PDA平板接觸5 min后取出，倒放于與內(nèi)生真菌分離平板相同條件下培養(yǎng)(28℃培養(yǎng)7 d)，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落生長。

1.2.4抑菌試驗

1)抗菌活性內(nèi)生真菌的初篩

待檢內(nèi)生真菌培養(yǎng)：挑取經(jīng)活化的內(nèi)生真菌菌絲或孢子點接至PDA固體平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，備用。

指示菌培養(yǎng)：將指示菌接種于相應(yīng)斜面上進(jìn)行培養(yǎng)，其中細(xì)菌指示菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h；啤酒酵母接種于Ⅳ號培養(yǎng)基斜面上，30℃培養(yǎng)48h。待指示菌長出后，10 mL無菌冷卻生理鹽水將菌苔洗下，打散，制備成菌懸液。

抑菌試驗：參照文獻(xiàn)[10]的瓊脂塊法進(jìn)行抗菌活性的初篩。

2)內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性測定

待檢內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)：在250 mL三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，將各待檢菌接入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，28℃、130 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d。無菌條件下取發(fā)酵液4 mL于離心管中，8 000 r/min離心5 min，收集上清作抑菌試驗。

指示菌培養(yǎng)：同1.2.4。

抑菌實驗：參考文獻(xiàn)[11]的雙層平板法進(jìn)行內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性測定，分別將待檢發(fā)酵上清液100 μL加入牛津杯，每種待檢上清液3個重復(fù)。放入4℃冰箱預(yù)培養(yǎng)7 h后，細(xì)菌指示菌平板放至30℃培養(yǎng)18 h，啤酒酵母指示菌平板放至30℃培養(yǎng)36 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.2.5具抑菌活性內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定

對具有抑菌活性的內(nèi)生真菌采用點植培養(yǎng)法和小室培養(yǎng)法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1消毒可靠性檢驗結(jié)果

兩種檢驗方法所用平板在PDA平板上培養(yǎng)一周后，取出觀察，均無菌落生長，證明中華蘆薈的根和葉表面消毒是徹底的，分離平板上長出的是內(nèi)生真菌。

2.2中華蘆薈內(nèi)生真菌的組成

根據(jù)內(nèi)生真菌菌落形態(tài)、顏色、邊緣狀態(tài)、透明度、表面干濕狀態(tài)等特征判斷，從中華蘆薈中共分離到8株內(nèi)生真菌，葉部5株，根部3株。

表1 中華蘆薈內(nèi)生真菌抑菌活性初篩結(jié)果

“+”：抑菌圈直徑d≤1cm；“++”：1 cm﹤d﹤1.5 cm；“+++”：d>1.5 cm；“-”：無抑菌性。

2.3抗菌活性內(nèi)生真菌初篩

中華蘆薈內(nèi)生真菌抗菌活性初篩結(jié)果見表1，從表1可以看出，8株內(nèi)生真菌中有2株表現(xiàn)出了抑菌活性，一株來自于葉部，對4種指示菌均有抑菌活性；一株來自于根部，對3種指示細(xì)菌均有抑菌活性。

2.4內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性測定結(jié)果

采用雙層平板法對8種內(nèi)生真菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性篩選，結(jié)果表明，葉部(LHY-02)和根部(LHG-01)均有一株內(nèi)生真菌發(fā)酵上清液對3種指示細(xì)菌表現(xiàn)出一定的抑菌活性，見表2和圖1。葉部內(nèi)生真菌LHY-02對指示細(xì)菌的抑菌圈大，且LHY-02同時對酵母也表現(xiàn)出了一定的抑制活性，因此LHY-02對指示菌的抑菌活性要強一些。

表2 中華蘆薈內(nèi)生真菌發(fā)酵上清液的抑菌活性

A：枯草芽孢桿菌；B：大腸桿菌；C：金黃色葡萄球菌。

圖1 中華蘆薈內(nèi)生真菌的抑菌作用

Fig 1 Antimicrobial activity of endophytic fungi

fromAloeveral.var.chinesis(haw.)

2.5具抑菌活性內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)菌落形態(tài)觀察，抑菌活性好的內(nèi)生真菌LHY-02和LHG-01的菌落蔓延，初期菌絲黃色，后期變成黑色厚絨狀，背面淺黃色，分生孢子頭褐黑色。小室鏡檢，頂囊大球形，分生孢子球形，呈黑色。形態(tài)學(xué)初步鑒定這兩株內(nèi)生真菌均屬于黑曲霉屬。

3討論

影響內(nèi)生真菌分離的因素比較多，首先與采用的消毒條件有關(guān)，消毒過輕，可能會使材料表面的雜菌混入，消毒過重，會使部分內(nèi)生菌被殺死；其次，與分離所采用的培養(yǎng)基有關(guān)，即使使用不同種類的培養(yǎng)基也不能確保將植物中的所有內(nèi)生菌全部分離出來，有些內(nèi)生菌不能在人工培養(yǎng)基上生長，有些內(nèi)生菌生長緩慢被生長相對較快的菌株所覆蓋，這樣就造成了分離內(nèi)生菌過程中某些菌株分離不到[12]；另外，還與植物本身的年齡有關(guān)，多年生植株，生長時間越長，分離到的內(nèi)生菌就越多；最后植物采集時的產(chǎn)地、濕度、季節(jié)、所處的海拔高度等也會影響內(nèi)生菌的分布和數(shù)量。本次分離到的具有抑菌活性的兩株內(nèi)生真菌分別來自于根部和葉部，且都屬于黑曲霉，而在文獻(xiàn)[5]和文獻(xiàn)[8]的研究中，未有從中華蘆薈中分離出黑曲霉，可見從一種植物中分離內(nèi)生真菌時，所采用植株不同，分離到的內(nèi)生真菌也不同。

通過對中華蘆薈的根和葉部內(nèi)生真菌的分離，共分離到8株內(nèi)生真菌，其中5株來自葉部，3株來自根部，抑菌試驗結(jié)果表明葉部和根部各有一株內(nèi)生真菌對3種指示細(xì)菌表現(xiàn)出抑菌活性，且葉部的內(nèi)生真菌對啤酒酵母也有抑制效果。這兩株內(nèi)生真菌的菌落特征相似，鏡檢時分生孢子頭和分生孢子也很相似，都屬于黑曲霉屬，但葉部內(nèi)生真菌對細(xì)菌的抑制效果較根部內(nèi)生真菌稍強，抗菌譜較根部內(nèi)生真菌廣，而且葉部分離到的內(nèi)生真菌也較多，這說明因蘆薈抗菌活性成分主要存在于葉中，從而導(dǎo)致與其長期共存的內(nèi)生真菌活性較其他部位強。這一結(jié)論為內(nèi)生真菌分離時宿主植物部位的選擇提供了依據(jù)，選擇宿主植物活性成分集中部位去分離內(nèi)生真菌，分離到有價值的內(nèi)生真菌可能性更大。

參考文獻(xiàn):

[1]楊大慶. 蘆薈的藥用機理研究[J]. 陜西中醫(yī), 2004, 25(7):641-642.

[2]李能章,彭遠(yuǎn)義.一株蘆薈抗菌內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及生物學(xué)性質(zhì)研究[J].生物技術(shù)通訊, 2004, 15(2): 141-145.

[3]尹建雯, 陳有為, 楊麗源, 等.蘆薈植物內(nèi)生真菌的研究Ⅰ.內(nèi)生真菌的分離及鑒定[J].微生物學(xué)雜志, 2004, 24(1): 25-26.

[4]尹建雯, 陳有為, 李治瀅, 等.蘆薈植物內(nèi)生真菌的研究Ⅱ.抗菌活性初探[J].微生物學(xué)雜志, 2004, 24(2): 30-33.

[5]尹建雯, 陳有為, 徐聞, 等.蘆薈植物內(nèi)生真菌抗真菌活性的研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2005, 12: 18-19.

[6]黃江華, 向梅梅, 姜子德.庫拉索蘆薈內(nèi)生真菌類群與分布的初步研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(13) :5480 - 5481.

[7]王莉衡, 柯 楊, 強 毅, 等. 蘆薈內(nèi)生菌內(nèi)生哈茨木霉LH-7對植物病原菌的抗性[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2014, 25(4) : 1130 -1136.

[8]柯野, 方白玉, 曾松榮. 粵北地區(qū)中華蘆薈內(nèi)生真菌的初步研究[J].菌物研究, 2007, 5(3): 134-136.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典第二部[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2012.

[10]林 敏, 寧喜斌. 具抑菌活性海洋微生物的篩選[J].微生物學(xué)雜志, 2005, 25(5):23-25.

[11]王玉君, 崔晉龍, 蘇 紅, 等.遠(yuǎn)志內(nèi)生真菌抑菌活性篩選[J].微生物學(xué)通報, 2009, 36(3):404-411.

[12]崔 宇, 鄭春英, 劉松梅, 等. 藥用植物內(nèi)生菌研究概況[J].黑龍江醫(yī)藥, 2007, 20(1):41-44.

中圖分類號S567.239；R285

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號2095-1736(2016)02-0069-03

作者簡介：李玲玲，碩士，講師，主要研究方向為微生物制藥，E-mail：729005755@qq.com。

基金項目：重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)項目(編號：ZR201310)

收稿日期：2015-07-22；修回日期：2015-07-31

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.069