周 奇，馬春玲，王國英

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266021;2.臨沂市婦女兒童醫(yī)院，山東臨沂 276002)

·論 著·

山東地區(qū)健康人群腺病毒稀有血清型感染狀況調(diào)查分析

周 奇1，2，馬春玲2，王國英1△

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266021;2.臨沂市婦女兒童醫(yī)院，山東臨沂 276002)

目的 調(diào)查山東地區(qū)健康人群中腺病毒不同血清型的感染狀況，篩選出流行水平較低的腺病毒血清型，用于腺病毒載體構(gòu)建。方法 利用腺病毒不同血清型標(biāo)準(zhǔn)株，以ELISA方法檢測健康人群中不同腺病毒血清型的中和抗體。結(jié)果 山東地區(qū)18～70歲的健康人群中腺病毒總抗體的陽性率為95.2%。其中Adv3、Adv5、Adv7、Adv11、Adv26、Adv35、Adv48、Adv49中和抗體的陽性率分別為：69.8%、71.0%、61.0%、9.4%、2.2%、5.8%、0.8%、1.6%。Adv11、26、35、48、49 5個血清型的陽性率遠(yuǎn)低于Adv3、5、7型(P<0.01)。結(jié)論 山東地區(qū)腺病毒的總感染率較高，不同血清型之間有顯著差異，其中Adv26、48、49型腺病毒感染率較低，可用于腺病毒載體的構(gòu)建。

腺病毒; 載體; 血清型; 中和抗體; ELISA

腺病毒是1953年由Rowe等[1]從小兒扁桃體的細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的，對其生物學(xué)和免疫學(xué)特征人類已經(jīng)有了比較全面的認(rèn)識[2-3]。腺病毒自然感染非常普遍，部分血清型可引起爆發(fā)，但對免疫功能正常的人來說常自限性恢復(fù)，所以腺病毒的總體致病性相對較弱[4]。另外它可以感染很多分裂期或靜止期細(xì)胞，即使在一些高度分化的組織細(xì)胞中也可增殖。因此，修飾的腺病毒于上世紀(jì)80年代開始被用作哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因載體。由于腺病毒載體具有宿主范圍廣、包裝容量大、轉(zhuǎn)染效率高、安全性好等突出的優(yōu)勢，它已經(jīng)成為繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后被廣泛應(yīng)用的載體系統(tǒng)[5]。目前使用的腺病毒載體多以5型腺病毒血清型的基因組為框架進(jìn)行構(gòu)建的，但是人群中普遍存在著5型腺病毒的中和抗體，研究證明中和抗體的存在是影響目的基因表達(dá)的一個重要因素，從而限制了腺病毒載體的廣泛應(yīng)用[6]。對健康人群中不同腺病毒血清型的中和抗體進(jìn)行檢測，統(tǒng)計分析不同血清型的中和抗體在人群中的存在情況，從中篩選出流行水平較低的稀有血清型，利用其基因組進(jìn)行載體構(gòu)建，可以減少現(xiàn)存中和抗體的免疫影響，有利于目的基因的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從山東省臨沂市、青島市、濟(jì)南市、菏澤市、威海市5個地區(qū)收集到健康體檢者的血清標(biāo)本500例，均獲得知情同意。年齡為18～70歲，平均36歲，其中男242例，女258例。

1.2 主要毒株、細(xì)胞和試劑：腺病毒1～49型國際標(biāo)準(zhǔn)毒株購于北京302醫(yī)院病毒研究室；A549細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；德國維潤腺病毒總抗體檢測試劑盒購于廣州市益滿生物科技有限公司。

1.3 血清標(biāo)本的收集與制備 每個研究對象均采集空腹靜脈血5 mL，血液標(biāo)本常溫放置30 min后，3 000 r/min離心10 min，收集血清1.5 mL轉(zhuǎn)移至EP管中,置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型病毒的擴(kuò)增、提純與滴度測定 首先對凍存的A549細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇并傳代；取上述血清型的腺病毒感染A549細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增；擴(kuò)增后通過氯化銫梯度離心法進(jìn)行純化；最后以Karber法計算病毒滴度。

1.5 血清腺病毒總抗體的檢測 利用德國維潤腺病毒IgG抗體檢測試劑盒，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，對500例正常血清進(jìn)行原倍檢測，從中篩選出腺病毒感染陽性的血清標(biāo)本。

1.6 血清中和抗體效價的測定 A549細(xì)胞以5×103個細(xì)胞/孔加入96孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)，抽取隨機(jī)血清標(biāo)本20份，用PBS等比稀釋，與同體積MOI=20的各血清型病毒原液混合后加入96孔板中，設(shè)細(xì)胞、病毒對照，培養(yǎng)3 d后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，在病毒對照出現(xiàn)70%以上的病變時判斷結(jié)果，以完全抑制細(xì)胞病變的最大稀釋倍數(shù)做為中和抗體的效價。

1.7 用ELISA方法檢測血清中Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒的中和抗體的陽性率 用包被緩沖液將各病毒原液稀釋至2×106pfu/mL加入到96微孔板中，每孔加100 μL，4 ℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢血清、陰性血清、陽性對照100 μL于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 h，洗滌，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)二抗100 μL，37 ℃孵育1 h，洗滌，加入底物100 μL，37 ℃孵育30 min，加入終止液50 μL，用酶標(biāo)儀讀取試驗(yàn)結(jié)果。

1.8 陽性結(jié)果判斷 使用陰性血清測定結(jié)果均值的2倍作為陽性判斷值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和數(shù)據(jù)處理，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒擴(kuò)增的結(jié)果 加入各型腺病毒原液50 μL感染A549細(xì)胞，3 d以后細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，與正常細(xì)胞對照組相比典型的CPE為：細(xì)胞腫脹、變圓、脫落。分別選取一個正常細(xì)胞對照和一個典型CPE進(jìn)行拍照，結(jié)果見圖1。

A表示未感染腺病毒Ad35的A549細(xì)胞;B表示感染腺病毒Ad35的A549細(xì)胞。

圖1 A549細(xì)胞的形態(tài)

2.2 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒滴度的檢測結(jié)果 通過系列倍比稀釋的病毒液感染96孔板中的A549細(xì)胞，10 d后計數(shù)CPE出現(xiàn)的孔數(shù)，按公式Titre(pfu/mL)=10(x+0.8)測得病毒滴度分別為:Ad3=1.2×109pfu/mL,Ad5=1.9×109pfu/mL,Ad7=1.1×109pfu/mL,Ad11=1.5×109pfu/mL,Ad26=2.0×109pfu/mL,Ad35=0.6×109pfu/mL,Ad48=2.2×109pfu/mL,Ad49=1.8×109pfu/mL。

2.3 血清腺病毒總抗體陽性率 對500例血清進(jìn)行總抗體檢測，只有24例標(biāo)本為陰性，陽性率為95.2%，對陽性血清再進(jìn)行中和抗體的檢測，見圖2。

2.4 血清中和抗體效價的檢測 血清中和抗體效價試驗(yàn)結(jié)果見表1，隨機(jī)抽選的20例血清標(biāo)本中，Ad35、48、49均沒有檢測到相應(yīng)的中和抗體，Ad3的效價在1∶8稀釋倍數(shù)后有所下降，其他血清型的中和抗體效價均在1∶4的稀釋倍數(shù)后開始有所下降，因此選擇1∶4作為血清的稀釋倍數(shù)，見表1。

2.5 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒中和抗體的ELISA檢測結(jié)果 從以上結(jié)果可以看出Ad3、Ad5、Ad7血清型陽性率均在60%以上，其余5個型別的腺病毒的流行水平較低，均低于10%。其中Ad11型陽性率最高為9.40%，其次是Ad35型陽性率5.8%，Ad26型陽性率2.2%，Ad49型陽性率1.6%，Ad48型陽性率最低為0.8%。Ad3、Ad5、Ad7血清型的陽性率與Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49血清型比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表1 各型腺病毒的中和抗體的效價

表2 各型腺病毒的中和抗體的陽性率

圖2 各型腺病毒中和抗體陽性率比較

3 討 論

至20世紀(jì)80年代腺病毒基因組用于載體的構(gòu)建以來，腺病毒載體在基因診斷和疫苗應(yīng)用上得到了廣泛應(yīng)用[5]，但是腺病毒載體還存在著缺乏靶向性、目的基因表達(dá)持續(xù)時間較短、外源基因表達(dá)的可控性差等問題，對腺病毒載體進(jìn)行優(yōu)化是研究者們研究的熱點(diǎn)。

目的基因表達(dá)持續(xù)時間普遍認(rèn)為與機(jī)體的免疫反應(yīng)有關(guān)。國外有研究小組將表達(dá)熒光素酶包被基因重組的Ad35型腺病毒載體注射到有5-型腺病毒型免疫力小鼠體內(nèi)[6]，明顯地檢測到熒光素酶的表達(dá)；而用熒光素酶包被基因重組的5-型腺病毒型載體感染同樣有5-型腺病毒型免疫力小鼠，此包被基因的表達(dá)活性較沒有5-型腺病毒型免疫力的對照小鼠下降90%。這說明避開現(xiàn)存的腺病毒中和抗體的影響可提高目的基因的表達(dá)活性。

腺病毒各血清型的分布存在一定地區(qū)和人種的差異，對山東地區(qū)健康人群進(jìn)行腺病毒各血清型中和抗體的檢測，有利于了解山東地區(qū)健康人群中腺病毒中和抗體的存在情況，對避開現(xiàn)存中和抗體構(gòu)建新型腺病毒載體打下研究基礎(chǔ)[7-9]。

本研究證明在我國山東地區(qū)的健康人群中，腺病毒不同血清型中和抗體的陽性率有著顯著差異，其中Ad5的中和抗體陽性率最高，對5型腺病毒載體的臨床應(yīng)用會造成一定影響。Ad11、Ad35、Ad26、Ad49、Ad48型的中和抗體陽性率較低，均在10%以下。利用陽性率最低的Ad26、Ad49、Ad48三型腺病毒構(gòu)建載體相對于Ad5型來說可有效避開健康人群中腺病毒現(xiàn)存免疫力的影響，有利于目的基因的表達(dá)。

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Investigation and analysis on infection situation of rare adenovirus serotype among normal population in Shandong area

ZhouQi1,2,MaChunling2,WangGuoying1△

(1.MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266021,China;2.LinyiMunicipalWomenandChildren′sHospital,Linyi,Shandong276002,China)

Objective To investigate the infection status of different adenovirus serotypes of adenovirus among normal population in Shandong area in order to screen out the serotypes of low prevalence level for the use in the adenoviral vector construction.Methods Serum levels of neutralizing antibodies against different serotypes of adenovirus were determined with ELISA by using different adenovirus serotype standard strains.Results The positive rate of total adenovirus antibodies in the normal population aged 18-70 years old in Shandong area was 95.2%,in which the antibody positive rates of Adv3,Adv5,Adv7,Adv11,Adv26,Adv35,Adv48 and Adv49 were 69.8%,71.0%,61.0%,9.4%,2.2%,5.8%,0.8% and 1.6%,respectively.The positive rates of Adv11,26,35,48,49 neutralizing antibodies were significantly lower than those of Adv3,5,7 serotypes(P<0.01).Conclusion The adenovirus total infection rate is high in Shandong area.The infection rates of different serotypes are different,in which Adv26,48,49 serotypes have lower infection rates and can be used for constructing the adenovirus vector.

adenovirus; vector; serotype; neutralizing antibodies; ELISA

周奇，男，主管檢驗(yàn)技師，主要從事病毒免疫學(xué)研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:bbq999@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.021 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-4130(2016)07-0923-03

2015-10-20)