黃　麗，王　春，趙士弟

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針刺預(yù)處理對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞缺血性損傷的影響

黃麗1，王春2，趙士弟1

［摘要］目的:研究針刺預(yù)處理百會穴+雙側(cè)足三里穴對腦缺血誘導(dǎo)的大鼠小腦浦肯野細(xì)胞損傷的影響。方法:將雄性SD大鼠30只隨機(jī)分為正常對照組、針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴組(針刺穴位組)和針刺非穴位組，各10只。采用糖氧剝奪的腦缺血模型，觀察針刺預(yù)處理治療后大鼠小腦浦肯野細(xì)胞的存活率，檢測小腦組織中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。結(jié)果:與正常對照組比較，針刺非穴位組大鼠腦缺血后浦肯野細(xì)胞死亡率明顯增加，MDA水平明顯增高，SOD活性明顯降低(P＜0．01) ;與針刺非穴位組比較，針刺穴位組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率明顯增加，小腦組織中MDA含量明顯降低，SOD活性明顯增加(P＜0．01)。結(jié)論:針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞缺血性損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與小腦組織中活性氧的生成減少和清除增加有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］腦缺血;百會穴;足三里穴;浦肯野細(xì)胞;丙二醛;超氧化物歧化酶;大鼠

［作者單位］1．蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，安徽蚌埠233030; 2．蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽蚌埠233040

缺血性腦血管疾病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。臨床上采取的很多治療措施如應(yīng)用谷氨酸受體阻斷劑、低溫療法等，雖然有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，但均不能完全改善由腦缺血導(dǎo)致的共濟(jì)失調(diào)和震顫等癥狀［1］。小腦性共濟(jì)失調(diào)和震顫與浦肯野細(xì)胞密切相關(guān)［2－3］。臨床研究［4－5］表明，針刺療法在治療ICVD方面發(fā)揮著越來越重要的作用。針刺預(yù)處理是指在腦缺血前給予針刺，從而對缺血后的腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用的現(xiàn)象。研究［6－7］表明，針刺預(yù)處理可以明顯地改善腦血液循環(huán)，增加腦血流量，減輕腦細(xì)胞水腫，但其具體機(jī)制尚未完全明確。本實(shí)驗(yàn)采用糖氧剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)的腦缺血模型，觀察針刺預(yù)處理百會穴+雙側(cè)足三里穴對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率、小腦組織中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響，從自由基的角度探討針刺預(yù)處理對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞缺血性損傷的保護(hù)機(jī)制，為改善ICVD患者的預(yù)后提供一定的實(shí)驗(yàn)和理論參考依據(jù)。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動物雄性SD大鼠30只，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體質(zhì)量(240±10) g，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1周。

1．2試劑與設(shè)備MDA、SOD測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。NaCl、KCl、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4、dextrose、HEPES、KOH、EGTA、Mg2 +-ATP、Tris-GTP、葡萄糖酸鉀、NaOH均為Sigma公司產(chǎn)品; 95% O2和5% CO2購自合肥巨網(wǎng)氣體有限公司;振蕩切片機(jī)(美國VIBRATOME公司)。

1．3溶液配制［8］人工腦脊液A組成(mmol/L) : 124 NaCl，3 KCl，1．3 NaH2PO4，26 NaHCO3，10 dextrose，5 HEPES，0．5 CaCl2和4 MgSO4; pH 7．35～7．45(1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH)。人工腦脊液B組成(mmol/L) : 124 NaCl，3 KCl，1．3 NaH2PO4，26 NaHCO3，10 dextrose，5 HEPES，2．4 CaCl2和1．3 MgSO4，pH 7．35～7．45 (1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH)。

1．4腦片制備大鼠腹腔注射20 g/L戊巴比妥0．1 mL麻醉，斷頭取出小腦，在充分氧合(通95% O2和5% CO2混合氣體)的冰水混合的人工腦脊液A中將小腦蚓部制備成400 μm腦片，然后迅速轉(zhuǎn)移至充分氧合的人工腦脊液B，在31°C條件下孵育［8］。

1．5體外OGD腦缺血模型制備［9－10］將大鼠小腦腦片轉(zhuǎn)移至無氧(通95% N2和5% CO2混合氣體)無糖的人工腦脊液B培養(yǎng)液中培養(yǎng)0．5 h模擬缺血，制備OGD腦缺血模型。

1．6實(shí)驗(yàn)分組30只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴組(針刺穴位組)和針刺非穴位組各10只。

1．6．1正常對照組未作針刺預(yù)處理的大鼠。腦片以充分氧合的人工腦脊液B培養(yǎng)2 h。

1．6．2針刺穴位組針刺部位選擇百會穴和足三里穴［11］。大鼠于適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1周后給予針刺預(yù)處理。兩人配合操作，一人抓取活體大鼠以固定，另一人以0．25 mm×25 mm毫針向百會穴平刺約3 mm，同時用0．25 mm×40 mm毫針向雙側(cè)足三里穴直刺約5 mm，每天2次，間歇5 min捻轉(zhuǎn)1次，每次持續(xù)30 min，連續(xù)刺激7 d后大鼠被斷頭取腦，制備成腦片。腦片先以充分氧合的人工腦脊液B培養(yǎng)1．5 h，再轉(zhuǎn)移至OGD液培養(yǎng)0．5 h。

1．6．3針刺非穴位組針刺部位選擇頭部與腿部的各1個非穴位點(diǎn)。針刺方法、持續(xù)時間、腦片處理與針刺穴位組一致。

1．7檢測指標(biāo)

1．7．1形態(tài)學(xué)指標(biāo)缺血后的腦片置于4 %甲醛溶液中4℃保存24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，取腦片內(nèi)部組織做病理切片(距邊緣約100 μm組織以排除在腦片制備中直接受損的區(qū)域)，并進(jìn)行蘇木精－伊紅(HE)染色，檢測浦肯野細(xì)胞存活率(即其未受損細(xì)胞百分比)。有下列特征之一則視為受損:細(xì)胞腫脹、空泡化或細(xì)胞固縮核深染［12］。腦片的每個區(qū)域至少有50個浦肯野細(xì)胞被計(jì)數(shù)或3個區(qū)域總計(jì)數(shù)＞150個［9］。

1．7．2生化檢測MDA含量及SOD活性取上述實(shí)驗(yàn)各組大鼠小腦組織，勻漿后按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1．8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2．1針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴對小腦浦肯野細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響正常對照組小腦浦肯野細(xì)胞胞膜清晰完整，無腫脹，無變性壞死，核仁清晰;針刺非穴位組可見浦肯野細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、變性壞死，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞體皺縮變形，間質(zhì)水腫明顯;而針刺穴位組細(xì)胞損傷則較針刺非穴位組明顯減輕，僅有輕度水腫，細(xì)胞膜完整清晰，核仁明顯(見圖1～3)。2．2 3組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率、小腦組織中MDA和SOD活性比較與正常對照組比較，針刺非穴位組大鼠腦缺血后浦肯野細(xì)胞的存活率明顯降低(P＜0．01) ;與針刺非穴位組比較，針刺穴位組浦肯野細(xì)胞的存活率明顯增加(P＜0．01) ;與正常對照組比較，針刺非穴位組大鼠腦缺血后可使小腦組織中MDA水平明顯增高，SOD活性明顯降低(P＜0．01) ;與針刺非穴位組比較，針刺穴位組大鼠小腦組織中MDA含量明顯降低，SOD活性明顯增加(P＜0．01) (見表1)。

表1　3組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率和小腦組織中MDA及SOD活性比較(±s)

表1　3組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率和小腦組織中MDA及SOD活性比較(±s)

q檢驗(yàn):與正常對照組比較＊＊P＜0．01;與針刺非穴位組比較▲▲P＜0．01

分組　n　　細(xì)胞存活率/% MDA/ (mmol/100 mg prot) SOD/ (U/mg prot)正常對照組10　 83．89±4．51　 3．64±0．29　 38．21±3．04針刺非穴位組　10　 37．20±3．24＊＊　6．28±0．34＊＊　21．57±2．05＊＊針刺穴位組　10　 64．14±3．60＊＊▲▲　3．87±0．40▲▲　33．05±2．60＊＊▲▲F　　—　376．25　178．35　107．73 P　　—　?。?．01　　＜0．01　?。?．01 MS組內(nèi)　　—14．599　0．120　6．735

3　討論

ICVD是危害人類健康的常見病和多發(fā)病，具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高的特點(diǎn)，給社會和家庭帶來極大的負(fù)擔(dān)，其預(yù)防與治療一直是醫(yī)學(xué)界的重要課題之一。目前對于ICVD臨床上尚無十分有效的方法。近年來國外［13］研究的焦點(diǎn)集中在盡早恢復(fù)和改善缺血腦組織的血供以及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能等方面。

自1990年KITAGWA等［14］提出腦缺血預(yù)處理的概念以來，缺血預(yù)處理理論得到了學(xué)者的廣泛關(guān)注。缺血預(yù)處理可以通過激發(fā)機(jī)體自身的機(jī)制減輕一次或多次腦缺血所產(chǎn)生的損傷。近年來的研究［15］表明，缺血、缺氧、亞低溫甚至某些藥物均可作為預(yù)處理的手段，誘導(dǎo)腦缺血耐受的發(fā)生。但是由于大多數(shù)預(yù)處理手段的損傷性較大，因此決定了它們只能作為機(jī)制探討的手段而無法作為一種腦缺血前的預(yù)防措施直接應(yīng)用于臨床。針刺療法作為中醫(yī)學(xué)的重要組成部分之一，在古代就有了防止腦中風(fēng)的相關(guān)記載。中醫(yī)針刺療法具有相對安全、損傷小和操作簡單方便等優(yōu)點(diǎn)。近年研究［4－5］表明，中醫(yī)針刺療法在治療ICVD方面發(fā)揮著越來越重要的作用。因此，研究針刺預(yù)處理特定穴位對增加腦細(xì)胞對缺血的耐受機(jī)制可能具有非常重要的臨床應(yīng)用價值。

本實(shí)驗(yàn)以百會、足三里為針刺預(yù)處理用穴。百會穴位居顛頂，其深處即為腦，且為督脈經(jīng)穴，督脈也歸屬于腦，可見百會穴與腦聯(lián)系密切，是調(diào)節(jié)大腦功能的重要穴位。足三里穴位是“足陽明胃經(jīng)”的主要穴位之一，有學(xué)者［6－7］研究證實(shí)，針刺足三里穴可以促進(jìn)腦細(xì)胞功能的恢復(fù)，提高神經(jīng)細(xì)胞的工作能力。因此，本實(shí)驗(yàn)針刺預(yù)處理的主穴選擇百會穴和雙側(cè)足三里穴。實(shí)驗(yàn)采用OGD的缺血模型，通過移除培養(yǎng)液中的葡萄糖和氧氣模擬腦缺血，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似在體動物模型，并可選擇特定類型的細(xì)胞進(jìn)行研究，是神經(jīng)科學(xué)研究中常用的腦缺血實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?－10］。

研究［15］表明，細(xì)胞內(nèi)自由基損害是腦缺血損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)通過觀察針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活率、小腦組織中MDA的含量和SOD活性的影響，從自由基的角度對針刺預(yù)處理后缺血性小腦浦肯野細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探討。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，是清除自由基的首要物質(zhì)，它可對抗因氧自由基對細(xì)胞造成的損傷，修復(fù)受損細(xì)胞，在機(jī)體的氧化與抗氧化平衡中起著極其重要的作用，其活性的高低也間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。腦組織中富含脂質(zhì)，當(dāng)腦缺血性損傷時，機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基，后者使脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如MDA等。因此，測定小腦組織中MDA含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映腦細(xì)胞損傷的程度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組比較，針刺非穴位組的大鼠腦缺血后可使小腦浦肯野細(xì)胞的死亡數(shù)明顯增加，細(xì)胞存活率降低，MDA水平明顯增高，SOD活性明顯降低(P＜0．01) ;與針刺非穴位組相比，針刺穴位組大鼠小腦浦肯野細(xì)胞存活數(shù)明顯增加，細(xì)胞存活率增加，小腦組織中MDA含量明顯降低，SOD活性明顯增加(P＜0．01)，表明針刺預(yù)處理百會穴+足三里穴可以通過減少神經(jīng)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的程度，減輕腦缺血導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的紊亂，穩(wěn)定細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜及其功能，使神經(jīng)細(xì)胞的功能得以維持，同時可以提高機(jī)體酶促抗氧化防御系統(tǒng)的功能，增加其清除氧自由基的能力來保護(hù)腦缺血導(dǎo)致的小腦浦肯野細(xì)胞的損傷。

綜上所述，針刺百會穴+雙側(cè)足三里穴對大鼠小腦浦肯野細(xì)胞的缺血性損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與小腦組織中活性氧的生成減少和清除增加有關(guān)。

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(本文編輯馬啟)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

Influence of acupuncture pretreatment on ischemia-induced functional impairment of cerebellar Purkenje cells in rats

HUANG Li1，WANG Chun2，ZHAO Shi-di1

(1．Department of Pathophysiology，Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030; 2．Department of Endocrinology，The Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233040，China)

［Abstract］Objective: To investigate the influence of acupuncture pretreatment Baihui-point and bilateral Zusanli-point on ischemiainduced impairment of cerebellar Purkenje cells．Methods: Thirty male SD rats were randomly divided into three groups: control group，acupuncture pretreatment in Baihui-point and bilateral Zusanli-point group and pretreatment in non acupuncture point group，10 rats in each group．The oxygen-glucose deprivation model was established，the survival rate of Purkinje cells，malondiadehyde(MDA) content and superoxide dismutase(SOD) activity were detected during the ischemia period after the rats were acupunctured．Results: Compared with the control，the survival rate of Purkinje cells was lower，MDA content was increased and SOD activity was decreased significantly in non-acupuncture pretreatment group(P＜0．01)．Compared with the non-acupuncture pretreatment group，the survival rate of Purkinje cells was increased，MDA content was decreased，and SOD activity was increased in the acupuncture pretreatment in Baihui-point and bilateral Zusanli-point group(P＜0．01)．Conclusions: Acupuncture pretreatment to Baihui-point and bilateral Zusanli-point prevented ischemia-induced functional impairment of cerebellar Purkenje cells，the protective mechanism may be related to reduce the production of reactive oxygen species and promote the clearance in cerebellar Purkenje cells．

［Key words］ischemia; Baihui-point; Zusanli-point; Purkenje cells; malondiadehyde; superoxide dismutase; rat

［通信作者］趙士弟，碩士研究生導(dǎo)師，教授．E-mail: zhsdi@126．com

［作者簡介］黃麗(1982－)，女，碩士，講師．

［基金項(xiàng)目］安徽省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1308085QH147; 1408085MH185) ;蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目(Byky1252)

［收稿日期］2014-11-26

［文章編號］1000-2200(2016) 01-0007-04

［中圖法分類號］R 743．31

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI:10．13898/j．cnki．issn．1000-2200．2016．01．002