張　博，王　宏，張滌非

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氯胺酮通過NO通路介導(dǎo)的抗傷害作用與抑制脊髓P物質(zhì)受體研究

張博1，王宏2，張滌非1

［摘要］目的:觀察氯胺酮(Ket)通過一氧化氮(NO)通路介導(dǎo)的抗傷害作用與脊髓P物質(zhì)(SP)受體的關(guān)系及可能機(jī)制。方法:通過行為學(xué)實(shí)驗、免疫組織化學(xué)技術(shù)和分光光度法，記錄鞘內(nèi)注射SP和/或腹腔注射Ket，熱板法實(shí)驗觀察小鼠舔后足反應(yīng)的潛伏期、甲醛實(shí)驗Ⅰ相和Ⅱ相小鼠舔足時間、脊髓Fos免疫樣(FLI)陽性神經(jīng)元數(shù)量和一氧化氮合酶(NOS)活性及NO產(chǎn)量的變化。結(jié)果:熱板法實(shí)驗: Ket 20 mg/kg和30 mg/kg腹腔注射可使小鼠熱板法痛閾增加(P＜0．05～P＜0．01)，SP 0．5 ng鞘內(nèi)注射后15 min和20 min均可減少Ket小鼠熱板法痛閾(P＜0．01和P＜0．05)。甲醛實(shí)驗: Ket 30 mg/kg腹腔注射可減少小鼠舔足時間(P＜0．01)，鞘內(nèi)注射SP 0．5 ng可增加Ket小鼠2個時相舔足時間(P＜0．01和P＜0．05)。對照組小鼠兩側(cè)脊髓背角對稱分布少量FLI陽性神經(jīng)元，甲醛注射側(cè)脊髓背角FLI陽性神經(jīng)元明顯高于對照組(P＜0．01)，腹腔注射Ket顯著減少注射側(cè)脊髓背角FLI陽性神經(jīng)元的數(shù)量(P＜0．01)，而鞘內(nèi)注射SP可明顯對抗Ket對甲醛注射側(cè)脊髓背角FLI陽性神經(jīng)元的抑制(P＜0．01)。Ket均可抑制脊髓NOS活性和NO水平(P＜0．05)，鞘內(nèi)注射SP可顯著對抗Ket對NOS活性和NO的抑制(P＜0．05)。結(jié)論:Ket抗傷害作用與抑制脊髓SP受體有關(guān)，這可能通過NO通路介導(dǎo)。

［關(guān)鍵詞］氯胺酮;抗傷害作用; P物質(zhì)受體;一氧化氮

［作者單位］1．安徽省太和縣人民醫(yī)院麻醉科，236600; 2．蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，233004

氯胺酮(ketamine，Ket)是唯一具有顯著鎮(zhèn)痛作用的靜脈麻醉藥，近年來人們對Ket抗傷害作用機(jī)制進(jìn)行了許多研究，發(fā)現(xiàn)涉及多種受體、神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道［1－3］，但其確切機(jī)制尚未完全明了。許多實(shí)驗［4－6］已證實(shí)Ket抗傷害作用的中樞主要在脊髓。初級感覺傳入神經(jīng)中較細(xì)的C類和Aδ類纖維被認(rèn)為與傷害性信息的傳遞有關(guān)，在背根神經(jīng)中20%的Aδ和50%的C類細(xì)胞中含有P物質(zhì)(substance P，SP)。現(xiàn)已肯定SP受體(substance P receptor，SPR)介導(dǎo)脊髓背角神經(jīng)元傷害性信息的傳遞。以前的研究［7－8］已證實(shí)，鞘內(nèi)注射SPR內(nèi)源性激動劑SP能增強(qiáng)脊髓背角神經(jīng)元的傷害性反應(yīng)，誘發(fā)和增強(qiáng)傷害性行為，而SPR拮抗劑sendide能抑制鞘內(nèi)注射SP誘發(fā)的傷害性行為［9］。

OKAMOTO等［10］通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Ket能抑制SP和SPR結(jié)合所引起的氯離子電流，同時發(fā)現(xiàn)Ket能抑制SP和SPR的結(jié)合，提示Ket的抗傷害作用可能與SPR有著密切聯(lián)系。SONG等［11］用微電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)，SPR拮抗劑spantide能增強(qiáng)Ket抑制脊髓背角神經(jīng)元對刺激的反應(yīng)，提示SPR參與了Ket作用的脊髓機(jī)制。但這些實(shí)驗都是在離體情況下進(jìn)行的，由于離體實(shí)驗缺乏完整的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，忽略了神經(jīng)元之間的相互作用、神經(jīng)元分離過程中膜蛋白及受體的損傷而導(dǎo)致受體親和力下降等因素，因此離體實(shí)驗并不能完全反映在離體情況下藥物與受體的關(guān)系。本實(shí)驗首先通過行為學(xué)實(shí)驗，觀察鞘內(nèi)注射不同劑量的SP對Ket抗傷害作用的影響，然后采用c-fos免疫組織化學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步驗證脊髓SPR和Ket抗傷害作用的關(guān)系，最后通過分光光度法，探討SPR參與Ket抗傷害作用與脊髓一氧化氮合酶(NOS)活性和一氧化氮(NO)產(chǎn)量的關(guān)系。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗動物和試劑昆明種小鼠192只，雌雄各96只，體質(zhì)量為20～25 g，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供。Ket為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)(批號H32022820)，SP由Sigma公司提供，上述試劑用0．9%氯化鈉注射液(NS)稀釋成所需濃度，兔抗c-fos抗體購于Santa Cruz公司，ABC試劑盒購自北京中衫公司?？捡R斯亮蘭蛋白試劑盒、NO試劑盒和NOS試劑盒購自南京建成生物工程研究所。1．2行為學(xué)實(shí)驗方法(1)熱板法:雌性小鼠置于(55．0±0．5)℃金屬板上，以小鼠舔后足反應(yīng)的潛伏期熱板法痛閾(pain threshold in the hot-plate test，HPPT)作為痛閾指標(biāo)。實(shí)驗前篩選動物，將反應(yīng)潛伏期＜5 s或＞30 s的動物剔除，為防足部燙傷，截止時間設(shè)為60 s。測基礎(chǔ)痛閾間隔5 min，測2次取其平均值。(2)甲醛法:實(shí)驗分為2個時相，0～10 min出現(xiàn)的反應(yīng)為Ⅰ相(早期相)，＞10～60 min出現(xiàn)的反應(yīng)為Ⅱ相(遲發(fā)相)。用微量注射器向每只小鼠足底皮下注射2%甲醛溶液20 μL，分別記錄Ⅰ相和Ⅱ相小鼠舔被注射足累積時間(舔足時間)作為疼痛指標(biāo)。

1．3分組動物均用分層隨機(jī)區(qū)組設(shè)計分組，使各組平均體質(zhì)量和性別比例基本相同。昆明小鼠120只，熱板實(shí)驗選用雄性小鼠，甲醛實(shí)驗雌雄不限，隨機(jī)分為12組，各10只: NS腹腔注射組，Ket 10、20、30組，NS鞘內(nèi)注射組，SP 0．125、0．25、0．5組，Ket 30 + NS鞘內(nèi)注射組，Ket 30 + SP 0．125、0．25、0．5組。NS腹腔注射組和Ket組分別腹腔注射NS或不同劑量的Ket; NS鞘內(nèi)注射組和SP組分別鞘內(nèi)注射NS或不同劑量的SP; Ket + NS鞘內(nèi)注射組和Ket + SP組首先腹腔注射Ket 30 mg/kg，10 min后鞘內(nèi)注射NS或不同劑量的SP。觀察各組小鼠用藥前后HPPT的變化，NS鞘內(nèi)注射組和SP組鞘內(nèi)注射后1 min，其余各組均在腹腔注射Ket后15 min開始測HPPT，或足底注射2%甲醛開始測Ⅰ相和Ⅱ相舔足時間。

1．4 Fos免疫組織化學(xué)技術(shù)昆明小鼠40只，分為5組，各8只: NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射組，NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射+ F組，Ket + NS鞘內(nèi)注射+ F組，NS腹腔注射+ SP + F組，Ket + SP + F組。各組小鼠均首先腹腔注射NS或Ket 30 mg/kg，10 min后鞘內(nèi)注射NS或SP，15 min時除NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射組外均注射甲醛溶液。甲醛刺激后1 h進(jìn)行Fos免疫組織化學(xué)。各組小鼠經(jīng)實(shí)驗處理后，腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉，處死后取腰膨大段脊髓，以SP法作c-fos免疫組織化學(xué)反應(yīng)。

細(xì)胞計數(shù)Fos免疫樣(FLI)陽性神經(jīng)元表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕褐色，細(xì)胞質(zhì)不著色。每張切片根據(jù)Rexed分層法將脊髓灰質(zhì)10層分為4個區(qū): (1)淺層(Ⅰ～Ⅱ?qū)? ; (2)固有核(Ⅲ～Ⅳ層) ; (3)背角頸部(Ⅴ～Ⅵ層) ; (4)腹角(Ⅶ～Ⅹ層)，分別計數(shù)每個區(qū)內(nèi)FLI陽性神經(jīng)元數(shù)量。每只小鼠脊髓切片隨機(jī)抽取10張，在鏡下計數(shù)每張切片各區(qū)FLI陽性神經(jīng)元數(shù)量，并取其平均值作為單個脊髓各區(qū)FLI陽性神經(jīng)元的數(shù)量。

1．5分光光度法昆明小鼠32只，分為4組，各8 只: NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射組，Ket + NS鞘內(nèi)注射組，NS腹腔注射+ SP組，Ket + SP組。腹腔注射NS或Ket 30 mg/kg，10 min后鞘內(nèi)注射NS或SP。然后小鼠靜置30 min，斷頭取腰膨大段脊髓。準(zhǔn)確稱取所取脊髓組織的質(zhì)量，按質(zhì)量體積比加NS制備成10%的組織勻漿，1 000 r/min，離心10 min，然后取組織勻漿上清液，再用NS按1∶9稀釋成1%組織勻漿。然后按照試劑盒說明測定脊髓組織的蛋白含量、NOS活性和NO產(chǎn)量。

1．6統(tǒng)計學(xué)方法采用方差分析和q檢驗。

2　結(jié)果

2．1熱板實(shí)驗NS、Ket 10 mg/kg和20 mg/kg腹腔注射對小鼠HPPT均無明顯影響(P＞0．05)。與NS組比較，Ket 20 mg/kg和30 mg/kg腹腔注射均使HPPT增大(P＜0．05和P＜0．01)。與基礎(chǔ)HPPT比較，Ket 30 mg/kg腹腔注射后15 min時 HPPT增加53% (P＜0．05) (見表1)。SP 0．125、0．25和0．5 ng鞘內(nèi)注射對小鼠行為和HPPT無明顯影響(P＞0．05) (見表2)。NS和SP 0．125 ng鞘內(nèi)注射后15 min Ket小鼠的HPPT均較基礎(chǔ)HPPT升高(P＜0．05)。與Ket + NS組HPPT相比較，Ket + SP 0．5組HPPT在Ket腹腔注射后15 min和20 min時分別減少30．0% (P＜0．01)和26．13% (P＜0．05) (見表3)。

2．2甲醛實(shí)驗Ket 10 mg/kg和20 mg/kg腹腔注射對小鼠Ⅰ相舔足時間均無明顯影響(P＞0．05)，Ket 30 mg/kg腹腔注射明顯減少小鼠Ⅰ相舔足時間(P＜0．01)。Ket 30 mg/kg和20 mg/kg腹腔注射小鼠Ⅱ相舔足時間均減少(P＜0．05) (見表4)。SP 0．125、0．25和0．5 ng鞘內(nèi)注射對小鼠行為及2個時相舔足時間均無明顯影響(P＞0．05) (見表5)。SP 0．125 ng和0．25 ng鞘內(nèi)注射對Ket小鼠2個時相舔足時間均無明顯影響(P＞0．05)，SP 0．5 ng鞘內(nèi)注射均可增加Ket小鼠2個時相舔足時間(P＜0．01和P＜0．05) (見表6)。

表1　不同劑量Ket對小鼠HPPT的影響(ni=10;±s)

表1　不同劑量Ket對小鼠HPPT的影響(ni=10;±s)

q檢驗:與NS比較* P＜0．05，＊＊P＜0．01;與基礎(chǔ)HPPT比較# P＜0．05

分組　　基礎(chǔ)　HPPT 15 min后　20 min后　25 min后　35 min后F P　 MS組內(nèi)NS組15±3　15±4　13±5　14±5　13±4　0．55　　＞0．05　 18．200 Ket組/(mg/kg) 10　13±3　12±3　14±4　13±4　14±5　0．47　?。?．05　 15．000 20　14±4　18±4*　14±6　16±4　15±4　1．40　　＞0．05　 20．000 30　15±4　23±7＊＊#　20±5*　18±5　16±5　3．68　?。?．05　 28．000 F 0．73　9．78　4．02　2．40　0．81　　—　　—　　—P ＞0．05　　＜0．01　?。?．05　?。?．05　?。?．05　　—　　—　　—MS組內(nèi)　12．500　22．500　25．500　20．500　20．500—　—

表2　不同劑量SP對小鼠HPPT的影響(ni= 10;±s)

表2　不同劑量SP對小鼠HPPT的影響(ni= 10;±s)

分組　　基礎(chǔ)　HPPT 1 min后　6 min后　11 min后　20 min后　40 min后NS組16±4　 16±4　 15±4　 14±3　 14±4　 16±4 SP組/ng 0．125　 14±4　 14±5　 14±4　 15±5　 14±5　 13±4 0．250　 15±4　 14±3　 14±6　 15±6　 14±5　 15±6 0．500　 14±4　 13±3　 12±4　 12±3　 14±3　 14±4 F　0．57　 1．07　 0．75　 1．01　 0．00　 0．79 P　　＞0．05　　＞0．05　?。?．05　　＞0．05　?。?．05　?。?．05 MS組內(nèi)16．000　 14．750　 21．000　 19．750　 18．750　 21．000

表3　不同劑量SP對Ket小鼠HPPT的影響(ni=10;±s)

表3　不同劑量SP對Ket小鼠HPPT的影響(ni=10;±s)

q檢驗:與NS比較#P＜0．05，## P＜0．01;與基礎(chǔ)HPPT比較* P＜0．05

分組　　基礎(chǔ)　HPPT 15 min后　20 min后　25 min后　35 min后F　P　 MS組內(nèi)NS組　14±4　20±4*19±4　16±5　15±4　3．76　?。?．05　 17．800 SP組/ng 0．125　14±5　20±4*　18±4　16±4　15±4　3．26　?。?．05　 17．800 0．250　14±4　16±5　16±4　15±5　15±5　0．33　　＞0．05　 21．400 0．500　14±3　14±5##　14±4#　15±3　15±3　0．14　?。?．05　 21．400 F 0．00　4．39　3．07　0．18　0．00　　—　　—　　—P ＞0．05　　＜0．01　?。?．05　?。?．05　?。?．05　　—　　—　　—MS組內(nèi)　16．000　20．500　16．000　18．750　16．500—　—

2．3鞘內(nèi)注射SP對Ket抑制甲醛小鼠脊髓背角Fos陽性神經(jīng)元表達(dá)、NOS活性和NO水平的影響

NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射組小鼠兩側(cè)脊髓背角對稱分布少量的FLI陽性神經(jīng)元(見圖1)。NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射+ F組與NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射組比較，小鼠注射側(cè)脊髓背角有大量FLI陽性神經(jīng)元表達(dá)(P＜0．01)，其中大約59% FLI陽性神經(jīng)元分布在Ⅰ層和Ⅱ?qū)樱?6% FLI陽性神經(jīng)元分布在Ⅴ層和Ⅵ層，10% FLI陽性神經(jīng)元分布在Ⅲ層和Ⅳ層，未注射側(cè)脊髓背角只有少量FLI陽性神經(jīng)元散在分布(P＞0．05)。Ket + NS鞘內(nèi)注射+ F組與NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射+ F組比較，脊髓背角各層FLI陽性神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少(P＜0．01)，但仍多于NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射組(P＜0．01)。NS腹腔注射+ SP + F組與NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射+ F組比較，F(xiàn)LI陽性神經(jīng)元數(shù)量和分布相似(P＞0．05)。Ket + SP + F組與Ket + NS鞘內(nèi)注射+ F組相比，脊髓背角各層FLI陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加(P＜0．01) (見表7)。

與NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射組比較，Ket + NS鞘內(nèi)注射組Ket30 mg / kg腹腔注射明顯抑制NOS活性(P＜0．05)。NS腹腔注射+ SP組SP 0．5 ng鞘內(nèi)注射對NOS活性和NO水平均無明顯影響(P＞0．05)。與Ket + NS鞘內(nèi)注射組比較，Ket + SP組SP 0．5 ng鞘內(nèi)注射可以激活NOS活性(P＜0．05) (見表8)。

表4　不同劑量Ket對小鼠甲醛誘發(fā)舔足時間的影響(ni=10;±s)

表4　不同劑量Ket對小鼠甲醛誘發(fā)舔足時間的影響(ni=10;±s)

q檢驗:與NS組比較* P＜0．05，＊＊P＜0．01

分組　　Ⅰ相　?、蛳郚S組41±12　99±22 Ket組/(mg/kg) 10　37±10　105±31 20　30±9　75±22*30　22±11＊＊　68±24*F 6．25　5．18 P ＜0．01　?。?．01 MS組內(nèi)111．500　626．250

表5　不同劑量SP對小鼠甲醛誘發(fā)舔足時間的影響(ni= 10;±s)

表5　不同劑量SP對小鼠甲醛誘發(fā)舔足時間的影響(ni= 10;±s)

分組　?、裣唷　、蛳郚S組40±12　93±23 SP組/ng 0．125　39±10　104±28 0．25　44±11　104±22 0．5　51±17　115±31 F 1．81　1．17 P ＞0．05　?。?．05 MS組內(nèi)163．500　689．500

表6　不同劑量SP對Ket小鼠甲醛誘發(fā)舔足時間的影響(ni=10;±s)

表6　不同劑量SP對Ket小鼠甲醛誘發(fā)舔足時間的影響(ni=10;±s)

q檢驗:與Ket + NS比較* P＜0．05，＊＊P＜0．01

分組　?、裣唷　、蛳郖et + NS　21±10　67±24 Ket + SP 0．125　21±9　74±24 Ket + SP 0．25　30±9*　89±20*Ket + SP 0．5　36±13＊＊　97±21＊＊F 5．01　3．67 P ＜0．01　　＜0．05 MS組內(nèi)107．750　498．250

3　討論

Ket不但具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，而且具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)靜作用，同時較大劑量的Ket還可使動物產(chǎn)生諸如搖頭、旋轉(zhuǎn)等異常運(yùn)動，鎮(zhèn)靜作用和異常運(yùn)動均會影響對藥物鎮(zhèn)痛效應(yīng)的評價，因此，選擇合適的劑量盡量排除這些因素對實(shí)驗結(jié)果的影響就顯得尤為重要。

本實(shí)驗觀察到未注射甲醛的小鼠保持安靜，脊髓背角只有少量的FLI神經(jīng)元散在分布在背角各層。注射甲醛的小鼠出現(xiàn)躁動不安，舔、咬注射足，注射足紅腫，注射側(cè)脊髓背角出現(xiàn)大量FLI陽性神經(jīng)元，未注射側(cè)脊髓背角各層僅有少量的FLI神經(jīng)元散在分布。腹腔注射Ket 30 mg/kg明顯減少小鼠在Ⅰ相和Ⅱ相舔足時間，并可明顯抑制脊髓背角各層Fos蛋白表達(dá)，提示Ket在脊髓水平具有抗傷害作用，并對急性痛和慢性炎性痛均有抑制作用。

SPR介導(dǎo)脊髓背角神經(jīng)元傷害性信息的傳遞，SP作為其內(nèi)源性配體可激動SPR而發(fā)揮其效應(yīng)。在本實(shí)驗中鞘內(nèi)注射的SP 0．5 ng對行為、痛閾和Fos蛋白表達(dá)均無明顯的影響，但可明顯減弱Ket對熱板和甲醛刺激痛反應(yīng)的抑制，同時拮抗Ket對甲醛實(shí)驗小鼠脊髓背角Fos蛋白表達(dá)的抑制，提示Ket的抗傷害作用與脊髓SPR有著密切聯(lián)系。

目前認(rèn)為Ket抗傷害作用與NO通路有關(guān)，離體實(shí)驗［12］發(fā)現(xiàn)，用NOS抑制劑L-NAME能明顯增強(qiáng)Ket的麻醉作用，但Ket抗傷害作用主要與腦內(nèi)NO通路還是脊髓NO通路有關(guān)存在著爭議。GALLEY等［13］發(fā)現(xiàn)Ket可以抑制大鼠腦組織NOS的活性。同時大量實(shí)驗［14－15］也證實(shí)了Ket的抗傷害作用與抑制脊髓NOS神經(jīng)元的活性有關(guān)。有學(xué)者［16］發(fā)現(xiàn)，腹腔注射L-NAME可以拮抗Ket的抗傷害作用，但鞘內(nèi)注射L-NAME不能拮抗Ket的抗傷害作用，故認(rèn)為Ket抗傷害作用與脊髓上而不是脊髓的NO通路有關(guān)。不同研究者得出不同甚至矛盾的實(shí)驗結(jié)果，不同的實(shí)驗技術(shù)和條件可能是原因之一。但本實(shí)驗結(jié)果證實(shí)，Ket的抗傷害作用與抑制脊髓NOS活性和減少脊髓NO產(chǎn)量有關(guān)。其是否與脊髓上NO通路有關(guān)，在本實(shí)驗中尚未涉及。

既然Ket抗傷害作用與NO通路存在著密切的聯(lián)系，那么SP拮抗Ket抗傷害作用是否通過NO通路發(fā)揮作用?孫曉彩等［17］發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射SPR激動劑Sar-SP能增加NOS活性和NO生成，但同時使大鼠的痛閾降低。本實(shí)驗結(jié)果顯示，單純鞘內(nèi)注射對痛閾無影響的SP并不能激活NOS活性和增加NO生成，但卻能激活被Ket抑制的NOS活性和增加NO生成，提示SP拮抗Ket的抗傷害作用與NO通路有關(guān)。

總之，本實(shí)驗顯示Ket在小鼠熱板法實(shí)驗和甲醛法實(shí)驗中具有抗傷害作用，鞘內(nèi)注射SP能夠拮抗Ket的抗傷害作用，這種拮抗作用與激活NO通路有關(guān)。

表7　鞘內(nèi)注射SP對Ket抑制甲醛小鼠脊髓背角Fos陽性神經(jīng)元表達(dá)的影響(ni=8;±s)

表7　鞘內(nèi)注射SP對Ket抑制甲醛小鼠脊髓背角Fos陽性神經(jīng)元表達(dá)的影響(ni=8;±s)

q檢驗:與NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射+ F比較＊＊P＜0．01;與Ket + NS鞘內(nèi)注射+ F比較##P＜0．01

合計NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射　34±11＊＊##　22±8＊＊##　27±8＊＊##　24±4＊＊##　106±25＊＊分組　LamⅠ－Ⅱ　LamⅢ－Ⅳ　LamⅤ－Ⅵ　LamⅦ－Ⅹ## NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射+ F　 246±48　52±11　121±34　56±14　475±84 Ket + NS鞘內(nèi)注射+ F　121±27＊＊　34±12＊＊　61±15＊＊　37±9＊＊　253±53＊＊NS腹腔注射+ SP + F　253±59　67±19　120±34　61±13　501±97 Ket + SP + F　197±40##　57±15##　95±22##　51±10##　440±56##F 41．64　14．40　21．27　16．28　50．07 P ＜0．01　?。?．01　?。?．01　　＜0．01　?。?．01 MS組內(nèi)1 647．000　183．000　617．000　112．400　4 607．000

表8　鞘內(nèi)注射SP對Ket抑制脊髓NOS活性和NO水平的影響(ni=8;±s)

表8　鞘內(nèi)注射SP對Ket抑制脊髓NOS活性和NO水平的影響(ni=8;±s)

q檢驗:與NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射比較* P＜0．05;與Ket + NS鞘內(nèi)注射比較# P＜0．05

分組　NOS活性/ (U·mg prot－1) NO水平/ (μmol·gprot－1) NS腹腔注射+ NS鞘內(nèi)注射0．065　3．225 1．4±0．2　6．8±1．7 Ket + NS鞘內(nèi)注射　1．1±0．2*　4．9±1．5 NS腹腔注射+ SP　1．5±0．3　8．2±2．6 Ket + SP　1．4±0．3#　6．4±1．0 F 4．62　5．71 P ＜0．01　?。?．01 MS組內(nèi)

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(本文編輯劉暢)

Study of the relationship between the antinociception of ketamine mediated by nitric oxide pathway and inhibiting substance P receptors in the spinal cord

ZHANG Bo1，WANG Hong2，ZHANG DI-fei1
(1．Department of Anesthesiology，Taihe People's Hospital，Taihe Anhui 236600; 2．Department of Anesthesiology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233004，China)

［Abstract］Objective: To investigate the relationship between the antinociception of ketamine(Ket) mediated by nitric oxide(NO) pathway and inhibiting substance P(SP) receptor in the spinal cord，and its possible mechanism．Methods: The SP of intrathecal injection and/or Ket of intraperitoneal injection were recorded using behavioral experiment，immunohistochemical staining and spectrophotometry．The incubation period of licking foot reaction in mice and licking time in phaseⅠand phaseⅡmice were detected using hot-plate test and using formaldehyde experiment，respectively．The changes of the number of Fos-like immunoreactive(FLI) positive cells，nitric oxide synthase(NOS) activity and NO content were measured．Results: In hot-plate test，the 20 mg/kg and 30 mg/kg of Ket of intraperitoneal injection could increase the pain threshold in the hot-plate test(HPPT) of mice(P＜0．05 to P＜0．01)，the 0．5 ng of SP of intrathecal injection after 5 min and 20 min could decrease the HPPT of ketamine-treated mice(P＜0．01 and P＜0．05)．In formalin test，the 30 mg/kg of Ket of intraperitoneal injection could decrease the licking time of mice(P＜0．01)，the 0．5 ng of SP of intrathecal injection could increase the licking time of mice in two stages(P＜0．05 to P＜0．01)．In control group，the few FLI positive cells were symmetrical distribution on both sides of spinal dorsal horn，the FLI positive cells on both sides of spinal dorsal horn injected by formalin were significantly higher than that in control group(P＜0．01)．The FLI positive cells on both sides of spinal dorsal horn injected by intraperitoneal Ket significantly decreased(P＜0．01)，the 0．5 ng of SP of intrathecal injection could significantly inhibit FLI positive cells on both sides of spinal dorsal horn injected by formalin(P＜0．01)．Ket could inhibit the copy paste in spinal cord(P＜0．05)，and the SP of intrathecal injection can counter copy paste caused by Ket(P＜0．05)．Conclusions: The antinociception of Ket is correlation with the inhibiting of SP receptor，which may be mediated by NO pathway．

［Key words］ketamine; antinociception; substance P receptor; nitric oxide

［通信作者］王宏，博士，副主任醫(yī)師，副教授．E-mail: wh201071@ 163．com

［作者簡介］張博(1975－)，男，主治醫(yī)師．

［收稿日期］2014-11-30

［文章編號］1000-2200(2016) 01-0010-06

［中圖法分類號］R 971．2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI:10．13898/j．cnki．issn．1000-2200．2016．01．003