楊清嶺，項劍虹，俎紅偉

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒童牙病科，黑龍江佳木斯154002)

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蜂膠與葡萄柚提取物混合液對變形鏈球菌作用的體外研究①

楊清嶺，項劍虹，俎紅偉

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒童牙病科，黑龍江佳木斯154002)

摘要:目的:探討葡萄柚提取物(GSE)、蜂膠這兩種天然提取物配伍使用時在防齲方面的可行性，即期望通過兩種天然提取物的配伍應(yīng)用，達(dá)到降低單組分使用時的使用劑量和副作用。方法:采用液體稀釋法。分別測定蜂膠、葡萄柚提取物以及兩者混合溶液的MIC，進(jìn)而通過分級抑制濃度指數(shù)，來判斷混合液對變形鏈球菌生長作用的影響。結(jié)果:①通過分級抑制濃度指數(shù)計算表明，兩藥物聯(lián)用對變形鏈球菌的抑制作用是相加作用。②混合藥液對變形鏈球菌黏附抑制率取決于混合液濃度的變化呈正相關(guān)。③變形鏈球菌培養(yǎng)前后△pH值隨著蜂膠與葡萄柚提取物混合液的濃度增加而顯著降低。結(jié)論:將兩藥混合使用能降低各組分藥物的使用濃度;兩藥物混合液在一定濃度范圍能有效抑制變形鏈球菌對光滑玻璃表面的黏附;混合液可抑制變形鏈球菌產(chǎn)酸(［1］)。

關(guān)鍵詞:蜂膠;葡萄柚;變形鏈球菌;抑制;黏附;產(chǎn)酸;正相關(guān)

GSE是一種天然提取物，是一種廣譜抑菌類化合物，高效且很有發(fā)展?jié)摿Γ瑲⒕诜浅５偷臐舛葧r就可取得顯著的效果。蜂膠具有毒副作用?。?］、抑菌效果好的特點。本研究進(jìn)一步探究蜂膠和葡萄柚提取物配伍混合液的抗菌機制，為兩者混合液能夠應(yīng)用于臨床上防治齲病提供理論支持和實驗依據(jù)。

1　資料與方法

1.1實驗材料和試劑

(1)變形鏈球菌ATCC 25175:購于杭州百思生物［3］。(2)蜂膠(水溶性固體，純度98%) :購于西安森卓生物科技。(3) TPY液體培養(yǎng)基(1.5%胰蛋白胨、1%葡萄糖、0.6% KH2PO4、0.4%酵母提取物、0.2% K2HPO4·3H2O、0.2% Na2CO3、0.2% NaCl，pH7.0) :青島海天化玻。(4) TPY瓊脂培養(yǎng)基(含1.25%瓊脂的TPY液體培養(yǎng)基) :青島海天化玻。(5)葡萄柚提取物:廣州文玲貿(mào)易有限公司。(6)磷酸鹽PBS緩沖液:實驗室配置。(7)生理鹽水等。(8)漱爽復(fù)方氯已定含漱液(含0.12%葡萄糖酸氯已定) :購于哈爾濱樂泰藥液。

1.2藥液的制備

(1) TPY液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基的配制:稱取TPY液體培養(yǎng)基2.64g和4.64g，分別加入100mL蒸餾水。高壓滅菌20min，備用。(2) PBS磷酸鹽緩沖液的配制:稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.24g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 1.44，氯化鈉(NaCl) 8g，氯化鉀(KCl) 0.2g，吐溫－20，加水。調(diào)pH 7.2，定容1L，備用。

1.3菌液的制備

將S.m接種于液體TPY培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，然后用離心機以3500r/min離心15min，棄上清液，PBS緩沖液沖洗菌液2次，加入裝有無菌液體TPY培養(yǎng)基試管中，調(diào)節(jié)菌液濃度為D(630) = 1.0，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整其濁度為至0.5麥?zhǔn)蠞舛?細(xì)菌近似濃度為1.5×108個菌/mL)。

1.4藥液制備、分組

蜂膠母液制備:取一定量的固體水溶性蜂膠放入無菌液體TPY中，配制成濃度為100mg/mL蜂膠母液，備用［4］。

實驗組:用37℃預(yù)熱的TPY液體培養(yǎng)基將蜂膠母液倍比配置成750.00000、375.00000、187.50000、93.75000、46.87500 mg / L共5個濃度組。陽性對照組:分別用37℃預(yù)熱的TPY液體培養(yǎng)基和氯已定1mL充分混勻后，取出1mL混合物加入50 μL菌液。陰性對照組:加入菌液50μL和TPY液體培養(yǎng)基1mL。空白對照組:只含TPY液體培養(yǎng)基1mL。每組各濃度均設(shè)置5個重復(fù)管。

1.5測定葡萄柚提取物和蜂膠單組份各自的MIC值

用MTT比色法分別測定蜂膠、葡萄柚提取物各濃度組的OD值［5］，計算抑菌率。每組均加入100μL的1×108CFU/mL菌懸液，陽性對照組加入0.12%氯已定和菌液各100μL，陰性對照組TPY培養(yǎng)基和菌液各100μL，空白對照組只加200μLTPY培養(yǎng)基。用比濁法觀察細(xì)菌生長情況，其中細(xì)菌不生長的最小濃度即為抑制變鏈菌生長的最小抑菌濃度。上述測定過程重復(fù)3次，取均值。

1.6確定蜂膠、葡萄柚提取物混合液的MIC值

通過MTT比色法測定蜂膠、葡萄柚提取物各濃度組混合液的OD值，在96孔板橫排分別加入0.75000、0.37500、0.18750、0.09375、0.046875mg / mL蜂膠溶液100μL，縱排加入0.37500、0.18750、0.09375、0.04688、0.02344mg/mL葡萄柚提取物溶液100μL，將兩溶液混合均勻，每孔分別加入已備好的菌液20μL。PBS洗滌后棄液，各孔再加入100μL 的TPY液體培養(yǎng)基和10μL MTT，然后加入150μL DMSO溶液，在搖床上振蕩10min。測量出光密度值，計算出抑菌率達(dá)到80%時混合液的最小濃度，上述實驗過程重復(fù)3次［6］。

1.7混合液抑菌效果的評估指標(biāo)

依據(jù)上述實驗測定結(jié)果，可計算出分級抑制濃度指數(shù)，進(jìn)而判定兩者的抗菌作用關(guān)系。

1.8葡萄柚－GSE對S.m黏附的影響

實驗方法如下:取20個5mL玻璃試管，分成5組，每組四個試管平行對照［7］，加入制備好的TPY液體培養(yǎng)基2mL、菌懸液0.1mL、0.25mLPBS緩沖液(5%蔗糖－0.5mol/L)，加入0.05mL對照組和實驗組溶液，放置于37℃厭氧培養(yǎng)箱24h，各試管與地面呈30°角培養(yǎng)。24h后將試管中的溶液緩慢移除，再用蒸餾水洗脫黏附在試管壁的細(xì)菌，反復(fù)洗滌3次，然后用離心機離心20min。用紫外分光光度計測定A550nm。

1.9葡萄柚－GSE對S.m產(chǎn)酸能力的影響

用二倍稀釋法制備以下四個混合液濃度: 0.5、0.25、0.125、0.0625MIC(設(shè)空白對照組)，將pH值調(diào)定為7.4，按菌液與藥物混合液1: 10(v/v)接種S.m，在37℃厭氧箱培養(yǎng)24h，離心20min，取上層清液，測定pH值，重復(fù)3次，取均值，計算△pH:△pH=起始pH－離心后pH［8］。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用單因素方差對各組總體均數(shù)之間進(jìn)行分析比較(Analysis of variance)。

2　結(jié)果

2.1變鏈菌在不同濃度蜂膠溶液和GSE溶液中的抑制情況見表1～2。

表1　不同濃度蜂膠溶液對S.m的抑制情況

表2　不同濃度GSE對S.m的抑制情況

由以上二表可判定，蜂膠MIC值為0.37500mg/mL，GSE的MIC值為0.04688mg/mL。

2.2不同濃度GSE溶液和蜂膠溶液混合液抑制變鏈菌的情況

見表3，由表中數(shù)據(jù)計算出分級抑制濃度指數(shù):蜂膠與GSE聯(lián)用時，其MIC值為0.09375mg/mL，GSE與蜂膠聯(lián)用時，其MIC值為0.04688mg/mL，可得FICI =0.82。表明蜂膠與GSE聯(lián)用時為相加作用。

表3　蜂膠－GSE混合液抑制S.m光密度值(±s)

表3　蜂膠－GSE混合液抑制S.m光密度值(±s)

＊P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，與陰性對照組比較

GSE(mg/ml)蜂膠(mg/mL) 〗0.37500　0.18750　0.09375　0.04688 0.37500　0.237±0.07＊　0.244±0.02＊　0.249±0.09＊　0.799±0.03＊0.18750　0.252±0.02＊　0.306±0.11＊　0.363±0.10＊　0.813±0.12＊0.09375　0.301±0.14＊　0.327±0.05＊　0.802±0.04＊　0.890±0.04＊0.04688　0.325±0.09＊　0.340±0.16＊　0.924±0.02＊　0.981±0.13＊0.02344　0.670±0.18＊　0.917±0.01＊　0.975±0.03＊　1.002±0.01＊陽性對照　0.305陰性對照　1.584空白對照0.108

2.3混合液對S.m黏附作用的影響

從表中可看出隨著混合液濃度的增加，變形鏈球菌的黏附抑制率逐漸升高［9］。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組各濃度組與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，實驗組各濃度組間也存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

表4　　蜂膠－GSE混合液對S.m黏附的影響(±s)

表4　　蜂膠－GSE混合液對S.m黏附的影響(±s)

＊P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，與陰性對照組比較.

混合液濃度　1/16MIC　1/8MIC　1/4MIC　1/2MIC　　空白對照(TPY) 0.258±0.013黏附抑制率(%)吸光度值　0.236±0.027　0.210±0.014　0.178±0.012　0.147±0.090＊10.28　19.49　34.36　47.54　?。?/p>

2.4混合液對S.m產(chǎn)酸能力的影響

結(jié)果顯示:隨混合液濃度的增加S.m的產(chǎn)酸能力明顯降低。各濃度組與陰性對照組均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

表5　蜂膠－GSE混合液對S.m產(chǎn)酸的影響(±s)

表5　蜂膠－GSE混合液對S.m產(chǎn)酸的影響(±s)

＊P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，與陰性對照組比較。

混合液濃度　0.0625MIC　0.125MIC　0.25MIC　0.5MIC　　空白對照(TPY) .0202　3.27±0.0215 △pH值　3.23±0.0198　3.18±0.0217　3.05±0.0245　2.81±0

3　討論

根據(jù)實驗結(jié)果判定蜂膠MIC值為0.37500mg/mL，GSE的MIC值為0.04688mg/mL，GSE與蜂膠聯(lián)用時，其MIC值為0.04688mg/mL，蜂膠與GSE聯(lián)用時，其MIC值0.09375mg/mL，根據(jù)公式計算得FIC =0.82。這表明蜂膠與GSE聯(lián)用時為相加作用［10］。本實驗還觀察了蜂膠和GSE混合液對S.m產(chǎn)酸的作用，實驗發(fā)現(xiàn)隨著混合液濃度的增加，S.m的△pH值降低，濃度為1/16MIC時抑制產(chǎn)酸能力最弱，濃度為1/2MIC △pH最小，其表明此時產(chǎn)酸量降低，抑制產(chǎn)酸能力增強。說明混合液能明顯抑制S.m產(chǎn)酸［11］。

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(收稿日期:2015－03－17)

通訊作者:項劍虹(1967～)女，黑龍江牡丹江人，在讀碩士研究生，副主任醫(yī)師。E－mail: xiangjianhong1967@163.com。

作者簡介:①楊清嶺(1962～)女，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

中圖分類號:R378.1+2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B

文章編號:1008－0104(2016) 02－0075－02