賈洪巖，林　芳，王立敏，劉　丹

(1.沈陽藥科大學(xué)基于靶點的藥物設(shè)計與研究教育部重點實驗室，遼寧沈陽110000;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

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甘草次酸對人胃癌HGC－27的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用①

賈洪巖1，2，林芳1，王立敏2，劉丹1

(1.沈陽藥科大學(xué)基于靶點的藥物設(shè)計與研究教育部重點實驗室，遼寧沈陽110000;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

摘要:目的:研究18β－甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)對人胃癌細(xì)胞HGC－27生長抑制作用及對細(xì)胞凋亡的影響。方法:分別以12.5、25、50、100和200 μM的GA處理HGC－27細(xì)胞，MTT法檢測不同時間點(24、48和72h)的細(xì)胞增殖抑制率，以AO/EB法初步觀察GA誘導(dǎo)HGC－27凋亡的情況，以Annexin V－FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡率確定凋亡的發(fā)生。結(jié)果: GA能抑制HGC－27細(xì)胞生長，且呈劑量依賴性，GA可以引起HGC－27細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞膜發(fā)泡、等凋亡特征，提示了凋亡的參與，通過Annexin V/PI雙染色法最終確定GA可劑量依賴性地引起HGC－27的凋亡。結(jié)論: GA可抑制人胃癌細(xì)胞HGC－27增殖，其作用機(jī)制可能與GA引起HGC－27凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞:甘草次酸; HGC－27細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

胃癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，在許多惡性腫瘤當(dāng)中，其發(fā)病率高居第二位。在臨床上，利用Ki－67、RAB5A、VHL、Survivin以及HGF等的表達(dá)情況來診斷早期胃癌的發(fā)生［1～3］。多數(shù)早期胃癌的治療均采取局部切除的方法，而對于晚期胃癌，手術(shù)切除后仍有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的可能，其術(shù)后5年生存率始終保持在30%左右。近幾年的研究表明，中藥不管是在腫瘤的早期或者中期作為手術(shù)、化療以及介入治療的一種輔助手段，還是在腫瘤的晚期由于患者失去了最佳手術(shù)機(jī)會且對化療的耐受力下降或者進(jìn)行介入治療時其作為一種必要的治療手段均在臨床上表現(xiàn)出了優(yōu)越的效果［4，5］。18β－甘草次酸是中草藥甘草的一種重要有效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘草次酸具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗肝毒素、抗腫瘤、抗?jié)?、抗病毒以及抗炎等多種生理活性［6～9］。GA對一些腫瘤細(xì)胞生長具有一定的抑制作用［10，11］，有關(guān)甘草次酸對胃癌細(xì)胞HGC－27生長作用的報道較少，對其抗腫瘤的確切機(jī)制亦不清楚，本研究觀察甘草次酸對胃癌細(xì)胞系HGC－27細(xì)胞生長的抑制作用，探討其可能的作用機(jī)制，為胃癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

藥品與主要儀器: GA:購于Sigma公司; CO2培養(yǎng)箱:德國賀利氏公司;酶標(biāo)儀:美國Bio－Rad公司;熒光顯微鏡:德國Leica公司;流式細(xì)胞儀:美國Becton Dickson公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

HGC－27細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %胎牛血清100μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、0.2% NaHCO3的RPMI－1640培養(yǎng)液中的中，置于37℃、5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25 %的胰酶消化傳代。

1.2.2顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的觀察

取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，并且在培養(yǎng)24h后加入甘草次酸終濃度為25、50、100μM的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)24h后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.3 MTT法

細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿的80%時棄去培養(yǎng)液，在消化和離心后收集細(xì)胞，加入新鮮的培養(yǎng)液，慢慢吹打培養(yǎng)液使其成單細(xì)胞懸液;之后將單細(xì)胞懸液稀釋至細(xì)胞數(shù)為2×105個/mL，吹均勻后，將96孔板中的每孔加入100μL的單細(xì)胞懸液，然后放于培養(yǎng)箱中，24h后加藥處理，每個濃度設(shè)置四個復(fù)孔，與細(xì)胞共同孵育24h、48h和72h后，每孔分別加入50μL 2mg/mL的MTT溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h;甩板后倒扣于濾紙上，在濾紙充分吸干殘留的液體后，每孔分別加入200μL的DMSO，然后放于振蕩器上振蕩10min以使得藍(lán)色結(jié)晶物溶解;用酶標(biāo)儀在570nm處測其吸光度值，設(shè)200μL DMSO為空白對照。

由以下公式計算細(xì)胞生長的抑制率:

抑制率(%) = 1－(對照細(xì)胞OD值－加藥細(xì)胞OD值) /對照細(xì)胞OD值×100%

將藥物濃度的對數(shù)值與細(xì)胞的存活率作線性回歸，可求出藥物對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)生長抑制濃度及IC50值。

1.2.4 AO/EB雙染熒光試驗

取處于對數(shù)生長期的HGC－27細(xì)胞，以每孔的細(xì)胞密度為2×105個/mL接種于24孔板中，每孔800μL。然后分別用濃度為25、50、100μM的藥物處理后，收集細(xì)胞，離心，棄去上清液，重懸于100μL 的PBS中，然后加入AO/EB等體積混合液16μL (100 μg/mL AO，100μg/mL EB)，混勻后，吸一滴混合液于潔凈的載玻片上，用蓋玻片封片，放于熒光顯微鏡下觀察并拍照。EB拒染并出現(xiàn)細(xì)胞膜發(fā)芽、發(fā)泡、核皺縮以及凋亡小體的細(xì)胞則被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。

1.2.5 Annexin V－FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡

在36 h時收集各組的HGC－27細(xì)胞，用PBS洗滌2次，按Annexin V－FITC /PI試劑盒的說明書操作。在1h內(nèi)利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率，采用Cell Quest V 3.2軟件來獲取和分析數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察對照組細(xì)胞生長旺盛，形態(tài)成梭形或者多邊形，貼壁生長牢固，折光率較高，細(xì)胞膜生長完整。甘草次酸處理過的HCG－27細(xì)胞隨著濃度的增加增殖變慢且細(xì)胞逐漸變小變圓，折光變差等，部分細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)瓶中。甘草次酸濃度越高，上述表現(xiàn)越明顯。見圖1。

A.對照; B.甘草次酸25μM; C.甘草次酸50μM; D.甘草次酸100μM圖1　不同濃度GA作用24 h后顯微鏡觀察細(xì)胞變化

A.對照; B.甘草次酸25 μM; C.甘草次酸50 μM; D.甘草次酸100 μM圖2　AO/EB檢測不同濃度GA作用48 h后HGC－27形態(tài)變化

2.2 GA對HGC－27細(xì)胞生長抑制情況

分別以12.5、25、50、100和200μM的GA處理HGC－27細(xì)胞，MTT法檢測不同時間點(24、48和72h)的細(xì)胞增殖抑制率，GA隨著作用時間的增加對HGC－27有一定的生長抑制作用，并且隨著時間的延長具有時間依賴性，見表1。

表1　藥物處理不同時間GA對HGC－27的IC50

2.3 GA對HGC－27的AO/EB染色結(jié)果

通過對先前細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和GA對HGC－27的抑制作用，提示GA對HGC－27可能具有促進(jìn)凋亡的作用，而細(xì)胞凋亡時，形態(tài)學(xué)的變化是重要的特征之一。圖2是不同濃度的GA作用在HGC－27細(xì)胞48h后熒光染色的結(jié)果。對照組細(xì)胞的細(xì)胞核形狀規(guī)則，染色均一。而GA處理組隨著濃度的升高出現(xiàn)了細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞膜發(fā)泡、邊緣化等明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變。

2.4細(xì)胞凋亡改變

Annexin V－FITC/PI雙染色后流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組及25、50、100 μM的GA作用36h后早期凋亡率分為別0.72%、1.06 %、9.5%、17.58%。與對照組相比證明GA可以誘導(dǎo)HGC－27早期凋亡，見圖3。

A對照組B 25 μM組C 50 μM組D 100 μM組圖3　不同濃度GA作用36 h后HGC－27細(xì)胞流式凋亡分析

3　討論

通過光學(xué)顯微鏡我們初步觀察到GA可以抑制胃癌細(xì)胞HGC－27生長，MTT法檢測GA對HGC－27細(xì)胞72h的IC50為59.32μM，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)，憑經(jīng)驗推測可能有凋亡發(fā)生，繼續(xù)采用AO/EB法初步提示凋亡確實存在。進(jìn)而，Annexin V－FITC/PI法用來檢測細(xì)胞早期凋亡時膜上的磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，該指標(biāo)一直作為細(xì)胞凋亡判斷的金指標(biāo)，我們的實驗結(jié)果證實了GA確實誘導(dǎo)了凋亡，且呈劑量依賴性。與文獻(xiàn)報道GA具有多種抗腫瘤活性相一致，GA具抗惡性胃癌細(xì)胞的作用，我們認(rèn)為在治療和預(yù)防早期胃癌可能有應(yīng)有前景。有報道稱，如果可以聯(lián)合用藥的幾種藥物之間存在協(xié)同效應(yīng)，那么其不僅可以減輕藥物副作用，同時可以增強(qiáng)藥物的療效［6］。甘草次酸屬于較溫和的天然產(chǎn)物，安全性高，高振北等［12］報道，全反式維甲酸與甘草次酸聯(lián)合應(yīng)用，則可以協(xié)同抑制PGCL3細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞)的侵襲和轉(zhuǎn)移。本文發(fā)現(xiàn)甘草次酸單獨(dú)應(yīng)用有一定抗胃癌效果，這為開發(fā)其和相關(guān)藥物聯(lián)用研究提供了一定的參考價值。但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。開發(fā)甘草次酸與其他藥物合用治療胃癌，可能更具有臨床價值。

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(收稿日期:2015－05－24)

通訊作者:王立敏(1973～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E－mail: wlmtong@163.com。

作者簡介:①賈洪巖(1990～)女，黑龍江綏化人，在讀碩士研究生。

中圖分類號:R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0088－03