徐江霞，龔淑琪，萬振華，鄧連瑞，洪建華(、南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330003；、江西省口腔醫(yī)院，江西南昌330006)

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新型乙肝定量PCR試劑檢測性能驗(yàn)證

徐江霞1，龔淑琪1，萬振華1，鄧連瑞1，洪建華2
(1、南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330003；2、江西省口腔醫(yī)院，江西南昌330006)

摘要:目的驗(yàn)證一種新型乙肝定量PCR試劑檢測性能。方法參照ISO15189:2012要求，設(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn)對新型乙肝定量PCR試劑檢測性能評價(jià)指標(biāo)驗(yàn)證。結(jié)果①正確度驗(yàn)證：比對實(shí)驗(yàn)顯示新型試劑與傳統(tǒng)試劑（上?？迫A）相關(guān)性較好（y= 1.0259x+0.4857，R2=0.9534）；新型試劑參加2014年衛(wèi)生部室間質(zhì)評正確率100%。②精密度驗(yàn)證：新型試劑檢測高（106）、低（104）濃度樣本的批內(nèi)及批間CV值均小于10%。③可報(bào)告范圍驗(yàn)證：新型試劑在102～108范圍內(nèi)具有較好線性（y=-0.951x+ 9.1937，R2=0.99892>0.99）。④定量檢測限：新型試劑檢測原倍（103）、2倍、4倍稀釋血清的CV值均小于15%，定量檢測限可達(dá)到500IU/ml左右。結(jié)論新型試劑各項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)與廠家聲明一致，符合PCR檢測要求，具有較好的檢測性能。

關(guān)鍵詞：正確度；精密度；可報(bào)告范圍；檢測限

中國是乙型肝炎感染大國，約有10%的人群為乙肝病毒攜帶者，乙肝熒光定量PCR檢測是用于乙肝疾病診斷及療效的重要指標(biāo)之一[1，2]。目前國內(nèi)用于乙肝熒光定量PCR檢測的試劑絕大部分采用傳統(tǒng)的煮沸裂解法提取核酸，其有操作費(fèi)時(shí)、樣本需要量大、易形成氣溶膠造成實(shí)驗(yàn)室污染以及易導(dǎo)致核酸丟失等問題[3]。近年來，一種新型的免核酸提取單管PCR反應(yīng)開始應(yīng)用，比如湖南圣湘生物開發(fā)的“一步法”乙肝熒光定量PCR檢測試劑，即采用一種先進(jìn)的核酸釋放技術(shù)取代傳統(tǒng)試劑的煮沸裂解法提取核酸，將微量的核酸釋放劑與標(biāo)本在PCR反應(yīng)管內(nèi)混合數(shù)分鐘后直接加入PCR反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)[4，5]。此新技術(shù)已獲得國家批準(zhǔn)，與傳統(tǒng)試劑相比，具有操作簡便、快速、節(jié)約樣本、減少核酸污染及核酸丟失等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用于臨床將大大提高基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室檢測效率，減少實(shí)驗(yàn)室污染。但目前該技術(shù)在我省各大醫(yī)院臨床應(yīng)用尚不多見，其臨床應(yīng)用的檢測性能仍有待驗(yàn)證。本研究參照ISO15189：2012[6]中有關(guān)“臨床檢驗(yàn)定量檢測方法的確認(rèn)和性能驗(yàn)證”的要求，擬開展一系列臨床評價(jià)實(shí)驗(yàn)用于驗(yàn)證新型“一步法”乙肝定量PCR試劑的檢測性能。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，本研究設(shè)計(jì)驗(yàn)證的性能指標(biāo)將包含：正確度、精密度、可報(bào)告范圍、檢測限。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來源本室日常檢測血清標(biāo)本；混合陰性血清由傳統(tǒng)試劑（上?？迫A）和新型試劑（湖南圣湘）驗(yàn)證均為陰性的血清樣本混合組成；2014年衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心HBV DNA室間質(zhì)評樣本。

1.2儀器及試劑BIO-RAD實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX-96），乙肝定量PCR試劑（湖南圣湘、上?？迫A）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1正確度驗(yàn)證⑴比對實(shí)驗(yàn)：取40份日常血清標(biāo)本（血清標(biāo)本要求包含陰性、陽性樣本，陽性樣本濃度均勻分布在試劑說明書聲明的檢測線性范圍內(nèi)），取新型試劑和傳統(tǒng)試劑同時(shí)檢測（單次分析），嚴(yán)格按照試劑說明書操作，比較兩試劑檢測結(jié)果的相關(guān)性，繪制直線回歸方程。⑵參加室間質(zhì)量評價(jià)考核：采用新型試劑檢測2014年衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心10份HBV DNA室間質(zhì)評樣本，觀察回饋正確率是否與廠家聲明一致（100%）。

1.3.2精密度驗(yàn)證⑴批內(nèi)不精密度：在一次擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中采用新型試劑分別檢測高濃度（106）、低濃度（104）水平血清樣本各一份，每個(gè)樣本重復(fù)檢測10次，計(jì)算均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及CV值，觀察CV值是否小于廠家聲明（<10%）。⑵批間不精密度：采用新型試劑連續(xù)五日重復(fù)檢測上述高濃度（106）、低濃度（104）水平血清樣本，計(jì)算五日均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及CV值，觀察CV值是否小于廠家聲明（<10%）。

1.3.3可報(bào)告范圍驗(yàn)證根據(jù)新型試劑說明書提供的可報(bào)告范圍為5×102～5×109IU/ml，取本室（新型試劑）已檢測到的一高濃度陽性血清樣本（≥108IU/ml），用混合陰性血清10倍梯度稀釋至101左右濃度，采用新型試劑檢測，每個(gè)稀釋度重復(fù)檢測3次，取均值繪制直線回歸方程，觀察檢測線性范圍是否與廠家聲明一致。

1.3.4檢測限驗(yàn)證檢測限包括空白檢測限、檢出限、定量檢測限[7]。根據(jù)試劑說明書提供的定量檢測限為500IU/ml，本研究主要設(shè)計(jì)驗(yàn)證定量檢測限是否與廠家聲明一致。取新型試劑檢測的103左右的樣本，用混合陰性血清按原倍、2倍、4倍、8倍稀釋后，采用新型試劑檢測，每個(gè)稀釋度均做3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及CV值。CV值小于1/2允許誤差（15%）對應(yīng)的濃度水平即為定量檢測限，驗(yàn)證其是否與廠家聲明500IU/ml的定量檢測限一致。

2　結(jié)果

2.1正確度驗(yàn)證

2.1.1比對實(shí)驗(yàn)比較新型試劑與本室使用的傳統(tǒng)試劑（上海科華）對40份日常血清標(biāo)本的檢測結(jié)果的相關(guān)性，結(jié)果顯示（圖1）兩種試劑檢測結(jié)果相關(guān)性較好，回歸直線方程為y=1.0259x+ 0.4857，R2=0.9534>0.95，說明兩種試劑具有較好的延續(xù)性。

圖1　圣湘試劑與科華試劑比對實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析

2.1.2室間質(zhì)評考核正確率驗(yàn)證采用新型試劑檢測2014年衛(wèi)生部HBV DNA室間質(zhì)評樣本，回報(bào)結(jié)果（表1）顯示全年10份樣本正確率100%。

2.2精密度驗(yàn)證

2.2.1批內(nèi)不精密度新型試劑批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線（圖2）呈光滑的“S”型曲線，樣本擴(kuò)增效率高且重復(fù)性好。定量結(jié)果（表2）顯示高濃度（106）和低濃度樣本（104）的批內(nèi)CV值均小于10%。

2.2.2批間不精密度高濃度（106）和低濃度（104）樣本的連續(xù)5日檢測CV值均小于10%。見表2。

表1　2014年我室參加衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評回報(bào)結(jié)果

表2　新型試劑批內(nèi)及批間不精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2　新型試劑批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

2.3可報(bào)告范圍驗(yàn)證新型試劑檢測梯度稀釋樣本的擴(kuò)增曲線（圖3）間隔均勻，平滑優(yōu)美。根據(jù)定量結(jié)果繪制直線方程（圖4），結(jié)果顯示新型試劑在102～108范圍內(nèi)具有較好線性（y=－0.951x+9.1937，R2=0.99892>0.99）。

2.4定量檢測限驗(yàn)證新型試劑檢測的原倍（103左右）、2倍、4倍、8倍稀釋后定量結(jié)果（表3）顯示：原倍、2倍、4倍稀釋的CV值均小于15%，說明試劑定量檢測限可達(dá)到500IU/ml左右。

圖3　新型梯度稀釋實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線

圖4　新型梯度稀釋實(shí)驗(yàn)線性方程

表3　新型試劑定量檢測限驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3　討論

本研究選擇的性能驗(yàn)證指標(biāo)包括：正確度、精密度、可報(bào)告范圍和定量檢測限。正確度即評價(jià)測量均值與真值的接近程度，本研究依據(jù)CLIS EP15-A2[8]文件要求，首先以日常檢測標(biāo)本為研究對象，采用新型試劑和我室既往使用的傳統(tǒng)方法試劑同時(shí)檢測，比較兩種試劑檢測結(jié)果偏移是否在可接受范圍。結(jié)果顯示兩種試劑具有較好的相關(guān)性（R2>0.95），說明新型試劑與傳統(tǒng)試劑具有較好的延續(xù)性，可替代傳統(tǒng)方法試劑。再參照文獻(xiàn)[9，10]，以全年衛(wèi)生部室間質(zhì)評樣本為研究對象，采用新型試劑檢測，比較檢測均值與回報(bào)靶值之間的偏移是否與廠家聲明一致。精密度即多次重復(fù)檢測結(jié)果的一致性，包括批內(nèi)和批間精密度。依據(jù)CLIS EP05-A2[11]文件要求，結(jié)合文獻(xiàn)[10]，本研究設(shè)計(jì)比較新型試劑對高、低濃度樣本單次實(shí)驗(yàn)中10次重復(fù)檢測結(jié)果及連續(xù)5d重復(fù)檢測結(jié)果的變異度（CV值）是否小于廠家聲明?？蓤?bào)告范圍即檢測線性范圍，依據(jù)CLIS EP06-A[12]文件提供的估計(jì)可報(bào)告范圍要求，并參閱文獻(xiàn)[9，10]，本研究選擇與廠家聲明的檢測高限接近的高濃度血清樣本，10倍梯度稀釋至與廠家聲明的檢測低限接近的低濃度水平，計(jì)算不同濃度水平檢測結(jié)果的線性回歸方程。檢測限即檢測靈敏度，根據(jù)CLIS EP17-A2[7]文件對檢測限的最新描述，檢測限將包括空白限、檢出限和定量限三個(gè)方面。本研究參考溫冬梅[13]等對甲胎蛋白的研究，選擇一低值樣本（103左右）倍比稀釋至試劑說明書給出的定量檢測限接近的濃度，采用新型試劑重復(fù)檢測，觀察多次重復(fù)檢測結(jié)果的變異度是否在可接受范圍，由此驗(yàn)證新型試劑的定量檢測限是否與廠家聲明一致。本研究通過上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證新型試劑具有較好的檢測性能，其擴(kuò)增效率好，擴(kuò)增曲線優(yōu)美平滑；正確度、精密度、可報(bào)告范圍及定量檢測限等均與廠家聲明相符。

此外，本研究結(jié)果顯示新型試劑定量結(jié)果普遍比傳統(tǒng)試劑要高，并且重復(fù)性要優(yōu)于傳統(tǒng)試劑，這與陸金春[4]、李成德[5]、陳雪初[14]、葉劍榮[15]等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，分析其原因可能來自以下兩方面：⑴新型一步法試劑DNA提取效率高，樣本核酸全部轉(zhuǎn)入擴(kuò)增，DNA沒有任何損失；⑵傳統(tǒng)試劑采用煮沸裂解法提取HBV DNA，提取過程中吸除上清液時(shí)很容易帶走核酸，DNA損失較多，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，定量結(jié)果偏低。

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·實(shí)驗(yàn)研究·

(收稿日期2016-01-27；修回日期2016-03-17)

通信作者：龔淑琪，1979年12月出生，女，碩士學(xué)位，副主任醫(yī)師（臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)），研究方向：中藥抗感染免疫。

作者簡介：徐江霞，1965年2月出生，女，碩士學(xué)位，主任技師，主要研究方向：臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。

基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20155359）

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.007

中圖分類號(hào)：R512.6+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-1129(2016)02-0149-03