林　峰，吳映璇，歐陽少倫，邵琳智，鄒　游，杜志峰

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局　檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東　廣州　510623；2.廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施

研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東　廣州　510623;3.愛博才思亞太應(yīng)用支持中心，上海　200233)

基于液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)的嬰幼兒配方乳粉化學(xué)指紋圖研究

林峰1,2*，吳映璇1,2，歐陽少倫1,2，邵琳智1,2，鄒游1,2，杜志峰3

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東廣州510623；2.廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施

研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510623;3.愛博才思亞太應(yīng)用支持中心，上海200233)

摘要：在反相色譜條件下，采用液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)了18種嬰幼兒配方乳粉，并應(yīng)用主成分分析技術(shù)對(duì)大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，研究了不同數(shù)據(jù)提取參數(shù)對(duì)分析結(jié)果的影響，通過T值檢驗(yàn)篩選出3種罐標(biāo)顯示添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉的特征組分，提出了其中G號(hào)樣品的16個(gè)特征組分的化學(xué)信息，并構(gòu)建了相關(guān)的化學(xué)指紋圖。

關(guān)鍵詞：化學(xué)指紋圖；化學(xué)計(jì)量學(xué)；液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜；嬰幼兒配方乳粉

嬰幼兒配方奶粉是乳品安全中極為重要和敏感的乳品種類，關(guān)系著下一代的健康成長(zhǎng)。目前嬰幼兒配方乳粉的商品流通和貿(mào)易方式呈現(xiàn)多樣化的格局，尤其是嬰幼兒配方乳粉跨境電商貿(mào)易帶來的巨大利益，使嬰幼兒配方乳粉在該領(lǐng)域存在著假冒名牌的安全風(fēng)險(xiǎn)，因此需要建立一套嬰幼兒配方乳粉的鑒別、溯源檢測(cè)技術(shù)。目前對(duì)嬰幼兒配方奶粉的檢測(cè)集中在營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定以及安全衛(wèi)生檢測(cè)方面，難以表征產(chǎn)品整體特征，也得不到研究對(duì)象的特征標(biāo)記物，無法達(dá)到溯源分辨的目的。因此，需要研究更為全面的嬰幼兒配方奶粉鑒別檢測(cè)技術(shù)路線。

化學(xué)指紋圖譜是一種從整體上研究復(fù)雜物質(zhì)體系的技術(shù)工具，能全面反映研究對(duì)象組成成分的特征信息,采用化學(xué)指紋圖譜分析技術(shù)得到的研究對(duì)象的綜合信息,比通過單一或幾種成分測(cè)定的結(jié)果更豐富、更全面，適用于成分復(fù)雜、有效成分不明確的物質(zhì)的偽劣鑒別和質(zhì)量控制,是國(guó)內(nèi)外普遍接受的一種質(zhì)量評(píng)價(jià)模式。目前化學(xué)指紋圖譜技術(shù)主要用于中藥和天然藥物的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制,近年來開始應(yīng)用于食品領(lǐng)域,包括酒類、茶葉、植物油等食品的鑒別和溯源[1-10]。以往的化學(xué)指紋圖譜研究采用的檢測(cè)技術(shù)多為傳統(tǒng)的單一檢測(cè)技術(shù)，所得到的數(shù)據(jù)信息量少，不能充分反映和表達(dá)檢測(cè)對(duì)象的化學(xué)特征。近年來色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，包括液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)開始應(yīng)用于化學(xué)指紋圖譜的研究[10]，其所具有的高分離、高分辨能力可獲得研究對(duì)象更為豐富的化學(xué)信息。主成分分析(Principal component analysis ,PCA)是一種常用的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，目前已廣泛用于各種組學(xué)研究，將主成分分析數(shù)據(jù)處理技術(shù)應(yīng)用于化學(xué)指紋圖譜的提取過程，可大大提高研究對(duì)象的化學(xué)指紋圖的特征性和有效性[1,9-16]。

嬰幼兒配方奶粉組成復(fù)雜，包括了原料乳自身含有的各種營(yíng)養(yǎng)成分和乳粉加工過程加入的各種添加劑，同時(shí)也含有產(chǎn)奶動(dòng)物生長(zhǎng)飼養(yǎng)過程帶入或產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)(包括外源性和內(nèi)源性物質(zhì))，這些化學(xué)物質(zhì)提供了嬰幼兒配方奶粉的化學(xué)特征信息，足以構(gòu)建能充分表征嬰幼兒配方奶粉的化學(xué)指紋圖。本文嘗試采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)分析技術(shù)，研究添加水解蛋白成分的嬰幼兒配方乳粉的化學(xué)成分，并構(gòu)建了相關(guān)的化學(xué)指紋信息集。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

AB 5600四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)，配有電噴霧離子源(ESI)及島津LC-20AD液相色譜儀；3-18K高速低溫離心機(jī)(Sigma公司)。乙腈、甲酸為HPLC級(jí)，其他試劑為分析純；內(nèi)標(biāo):雙氟沙星-d3,純度大于99%(WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH)。

數(shù)據(jù)處理軟件：MarkerView 1.2.1.1(美國(guó)AB Sciex公司)。

1.2色譜條件

Atlantic T3柱(3 μm，150 mm×2.1 mm i.d.，Waters公司);流動(dòng)相:A為5 mmol/L甲酸乙腈溶液,B為5 mmol/L甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～1 min,5% A；1～18 min,5%～100% A；18～23 min,100% A；流速0.30 mL/min;柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

1.3質(zhì)譜條件

離子化模式：ESI(+)；一級(jí)質(zhì)譜全掃描，掃描范圍：m/z100～1 000；二級(jí)質(zhì)譜全掃描，掃描范圍：m/z50～1 000；霧化氣壓力379 kPa、氣簾氣壓力207 kPa、輔助加熱氣壓力448 kPa;輔助加熱氣溫度600 ℃,電離電壓:5.5 kV,去簇電壓：80 V。

1.4實(shí)驗(yàn)材料

20種市售乳粉，分別以字母A～U編組(字母I除外)，其中包括18種1階段嬰幼兒配方乳粉(分別源自11個(gè)品牌或子品牌)。編號(hào)B樣品罐標(biāo)顯示添加了經(jīng)適度水解的乳清蛋白和酪蛋白，G樣品罐標(biāo)顯示添加了部分水解牛奶蛋白,Q樣品罐標(biāo)顯示添加了部分水解乳清蛋白；另2種分別為全脂乳粉、脫脂乳粉。

1.5樣品處理

稱取0.5 g試樣于50 mL 塑料離心管中(平行樣個(gè)數(shù)n=4),加入 8 mL(65±5)℃溫水，渦旋混勻2 min,加入8 mL 乙腈飽和正己烷脫脂,渦旋30 s,10 000 r/min 低溫(4 ℃)高速離心10 min,棄去正己烷層,重復(fù)脫脂1次,加入10 mL 乙腈,渦旋1 min,用乙腈-水(1∶1)定容至25 mL,混勻,以10 000 r/min 低溫(4 ℃)離心5 min,分別吸取950 μL 上清液、50 μL內(nèi)標(biāo)液至1.5 mL 離心管中,渦旋混勻，樣液經(jīng)0.2 μm 有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。為避免儀器條件波動(dòng)對(duì)結(jié)果的影響，80個(gè)樣品以隨機(jī)排列方式進(jìn)樣。

1.6數(shù)據(jù)提取、過濾與分析

1.6.1數(shù)據(jù)提取測(cè)定數(shù)據(jù)全部導(dǎo)入MarkerView 軟件,設(shè)置色譜保留時(shí)間為0.8～24.0 min，保留時(shí)間窗5%，質(zhì)量偏差窗10.0 ppm，以雙氟沙星-d3作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度和色譜保留時(shí)間的校正,選擇平行樣均存在(n≥3)的組分進(jìn)入數(shù)據(jù)集組成，經(jīng)MarkerView 軟件處理獲得80個(gè)樣品的數(shù)據(jù)集。1.6.2主成分分析對(duì)數(shù)據(jù)集不指定分組，應(yīng)用MarkerView 軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)集進(jìn)行PCA處理；對(duì)數(shù)據(jù)集按樣品分組(同一樣品4份平行樣為1組)下進(jìn)行主成分-判別分析(PCA-DA)處理。

1.6.3T檢驗(yàn)分析應(yīng)用MarkerView 軟件，以感興趣的某1個(gè)樣品組對(duì)其它19個(gè)樣品組進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，獲得新的關(guān)注組分峰數(shù)據(jù)集，選取其中P≤0.05,log(fold change)絕對(duì)值=∞的組分峰作為該樣品初步的化學(xué)指紋圖數(shù)據(jù)源。

圖1　80個(gè)樣本的主成分分析結(jié)果(PC1 vs PC2)

2結(jié)果與討論

2.1主成分分析

在過往的一些食品真假鑒別中只是簡(jiǎn)單比較樣品間的某種儀器響應(yīng)值，但對(duì)于LC-TOF/MS采集得到的多維海量數(shù)據(jù)，傳統(tǒng)的簡(jiǎn)單比較法無法獲得樣本間的差異特征，不能有效識(shí)別樣本。PCA是一種線性降維方法，是對(duì)多變量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理的一種最古老的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，在分析化學(xué)中多用于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維、壓縮、變量的選擇以及去相關(guān)[17]。在PCA數(shù)據(jù)處理中一般是觀察貢獻(xiàn)最大的3個(gè)主成分(PC1，PC2，PC3)，選取主成分兩兩之間作二維投影圖，如PC1vsPC2(圖1a和1b)，可實(shí)現(xiàn)海量數(shù)據(jù)的降維，從而直觀地顯示樣本間的關(guān)系。

圖2　80個(gè)樣本的PC1分值(Square/Pareto)Fig.2　PC1 scores of 80 samples(Square/Pareto)

在對(duì)20種乳粉共計(jì)80份樣品的LC-TOF/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)無論選擇何種量綱(如No scaling，Mean Center，Autoscale，Pareto，Range Scale)或加權(quán)因子(如對(duì)數(shù)、開平方)，20種乳粉均分成非常明顯的二大樣品組，一組是3種添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉，另一組是剩余17種未添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉及普通乳粉。圖2為20種樣本的PC1分值圖，顯示了3種添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉(B，G，Q樣本)的PC1分值明顯高于其它17種樣品，表明應(yīng)用PCA數(shù)據(jù)處理技術(shù)可以有效識(shí)別添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉。

此外，從圖1c和d可觀察到，不同品牌的3種添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉之間存在一定的區(qū)別，當(dāng)改變量綱或加權(quán)因子時(shí)，添加水解蛋白的3組樣品會(huì)發(fā)生組內(nèi)平行樣的聚合度或組間離散度的輕微改變。

2.2主成分-判別分析

對(duì)20組樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行分組標(biāo)識(shí)，隨后進(jìn)行主成分-判別分析(PCA-DA)，分析結(jié)果顯示樣品組內(nèi)差異減少，組間差異顯著增大，在PCA中B和G兩組樣品分離不明顯，但通過PCA-DA處理后均實(shí)現(xiàn)了顯著的分離(見圖1c和d)。這是因?yàn)镻CA-DA是一種有監(jiān)督模式的主成分分析，在數(shù)據(jù)分析時(shí)考慮了樣品分組信息，并對(duì)可有效表達(dá)樣品組特征的質(zhì)譜峰進(jìn)行加權(quán)處理，從而顯著改善和增強(qiáng)樣品組間的分離。

2.3T檢驗(yàn)

由于參與數(shù)據(jù)分析的樣品組數(shù)量較大，與PCA方法相比采用T檢驗(yàn)更適合提取樣品的特征組分，分別將添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉對(duì)其它樣品組進(jìn)行T檢驗(yàn)分析(如B#vsothers)。

在T檢驗(yàn)中，通常以P≤0.05,log(fold change)的絕對(duì)值=2作為條件來選擇特征數(shù)據(jù)點(diǎn)，log(fold change)為正值的組分可視為表征目標(biāo)樣品的特征組分，log(fold change)為負(fù)值的組分則可視作是表征其它19種非目標(biāo)樣品的特征組分。由于參與分析的樣品組數(shù)量較大，即使log(fold change)=2，篩選出的組分仍缺乏特征性，即非目標(biāo)樣品組也含有目標(biāo)樣品組的特征組分，因此需設(shè)置更為嚴(yán)格的T值檢驗(yàn)參數(shù)方能提取出具有唯一性的目標(biāo)樣品特征組分。數(shù)據(jù)處理結(jié)果表明，只有將log(fold change)值設(shè)置為∞，方可篩選出目標(biāo)樣品含有的具唯一性的特征組分。最終確定先以P≤0.05條件提取數(shù)據(jù)，再?gòu)某醪教崛〕龅臄?shù)據(jù)中以log(fold change)=∞為條件進(jìn)一步提取出目標(biāo)樣品的特征組分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)最終的化學(xué)特征組分?jǐn)?shù)據(jù)的P值均小于10-10，表明對(duì)于來源復(fù)雜的嬰幼兒配方乳粉，在進(jìn)行樣品差異性表達(dá)分析時(shí)不能單純依從一般性的數(shù)據(jù)提取條件，而應(yīng)采用更為“苛刻”的數(shù)據(jù)提取條件方能獲得理想的數(shù)據(jù)分析結(jié)果。表1描述了1個(gè)標(biāo)稱添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉(G樣品)的化學(xué)指紋圖信息。

對(duì)20種樣品進(jìn)行LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式掃描，可以觀察到表1所列G樣品的16個(gè)化學(xué)特征組分均只出現(xiàn)在G樣品的MRM圖中(見圖3,圖中組分編號(hào)與表1相同)，而其它樣品中均未檢出，表明這16個(gè)化學(xué)特征組分可充分表征G樣品并構(gòu)成其化學(xué)指紋圖。

圖3　G號(hào)樣品中16個(gè)組分的MRM提取離子流圖

No.Quasi-moleculeionforexperimentalvaluem/ztR/minChargePossibleformulaQuasi-moleculeionfortheoreticalvaluem/zMasserrorppmQualitativeionpairm/z1322.14341.51C12H23N3O5S322.14310.9322.1/223.12235.14285.11C8H18N4O4235.140111.5235.1/136.13484.75445.12C54H73N5O7S2484.7548-0.8484.8/361.74343.19745.53C42H78N18O8S2343.19701.2343.2/244.25498.74825.82C46H77N9O7S4498.7487-1.0498.7/390.76654.66506.03C84H140N18O35654.66490.2654.7/583.37263.13896.41C14H18N2O3263.1390-0.4263.1/136.18772.36156.51C32H41N19O5772.36110.5772.4/545.29433.75316.62C41H71N9O7S2433.7532-0.2433.8/116.110439.72986.82C35H59N17O8S439.7299-0.2439.7/217.111965.56587.01C41H88N8O9S4965.56302.9965.6/751.412380.73927.22C30H61N15O6S380.7398-1.6380.7/322.213981.50057.41C43H80N8O9S4981.50040.1981.5/360.214400.20157.62C32H50N18O5S400.2039-6.0400.2/120.115765.32958.31C34H48N6O14765.3301-0.8765.3/321.216770.48098.41C39H67N3O12770.47981.4770.5/360.2

3結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，可實(shí)現(xiàn)添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉化學(xué)指紋圖的構(gòu)建和有效表征，為嬰幼兒配方乳粉的安全檢測(cè)帶來了新的技術(shù)思路。

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Research on the Chemical Fingerprinting of Infant Formula Powder Based on Liquid Chromatography-Quadrupole/Time-of-Flight Mass Spectrometry and Chemometrics

LIN Feng1,2*,WU Ying-xuan1,2,OUYANG Shao-lun1,2,SHAO Lin-zhi1,2，ZOU You1,2,DU Zhi-feng3

(1.Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou510623,China;2.Key Laboratory of Animals and Plants and Food Import and Export of Technical Measures in Guangdong Province,Guangzhou510623,China;3.AB SCIEX Asia Pacific Application Support Center,Shanghai200233,China)

Abstract：18 infant formula powder samples were analyzed by RP LC-Q-TOF MS,and potential chemical markers were filtered by PCA.Different parameters for pretreatment on the results of data analysis were studied.The characteristic components of partially hydrolyzed protein in infant formula powder were found by T-test.The chemical information of 16 characteristic components in G sample was proposed,and the correspongding chemical fingerprinting was constructed.

Key words：chemical fingerprinting；chemometrics；liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry(LC-Q/TOF-MS);infant formula powder

收稿日期：2015-08-18；修回日期：2015-09-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)檢總局項(xiàng)目(2012IK150)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A040401064)

*通訊作者：林峰，研究員，研究方向：食品中痕量有機(jī)污染物分析，Tel：020-38290337，E-mail：linf@gdciq.gov.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.020

中圖分類號(hào)：O657.63;TS252.51

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1004-4957(2016)04-0487-05