張廣慧 吳紅英 靳 瑾 周則衛(wèi) 劉培勛 龍 偉

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所 天津 300192）

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植物凝集素PHA-L對小鼠急性輻射防護(hù)作用

張廣慧 吳紅英 靳 瑾 周則衛(wèi) 劉培勛 龍 偉

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所 天津 300192）

摘要觀察植物凝集素PHA-L對小鼠急性輻射損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。采用動物30d存活率實驗，即小鼠全身輻照至吸收劑量為7.2Gy后觀察其存活情況；利用外周血和免疫學(xué)實驗，小鼠全身照射至吸收劑量為7.2 Gy后測外周血白細(xì)胞數(shù)(White blood cell, WBC)、股骨有核細(xì)胞數(shù)(The number of nucleated cells in bone marrow, BMNC)、骨髓DNA含量以及各臟器指數(shù)；對小鼠進(jìn)行9.0 Gy腹部照射，取小腸組織做病理切片觀察。結(jié)果顯示，照射給藥組小鼠30 d存活率比單純照射組均有提高，特別是高劑量組提高約60%；與單純照射組相比，照射給藥高劑量組的白細(xì)胞數(shù)、骨髓DNA含量和脾結(jié)節(jié)數(shù)均有提高，分別從0.74±0.16、1.02± 0.17和9.80±6.46提高到1.18±0.40、1.22±0.17和18.10±6.87，數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，并且PHA-L對臟器也有一定的保護(hù)作用；與單純照射組相比，照射給藥高劑量組小鼠腸道組織損傷恢復(fù)明顯。提示植物凝集素PHA-L對急性輻射損傷具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞輻射損傷，植物凝集素PHA-L，放射性腸炎

基金資助：國家自然科學(xué)基金青年項目(81202153)、教育部博士點新教師基金(20121106120042)、天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃青年項目(14JCQNJC10900)和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所發(fā)展基金(1523)資助

第一作者：張廣慧，女，1987年5月出生，2011年畢業(yè)于泰山醫(yī)學(xué)院，現(xiàn)為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所碩士研究生，研究方向為輻射防護(hù)食品藥品研究，E-mail: iamzgh@yeah.net

Supported by National Natural Science Foundation of China(81202153), Doctoral Found of Ministry of Education(20121106120042), Tianjin application foundation and research in cutting-edge technologies program(14JCQNJC10900), and Development Fund of

Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences(1523)

First author: ZHANG Guanghui (female) was born in May 1987 and graduated from Taishan Medical University in 2011. Now she is a master candidate at Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, majoring in radiation protection food

and drug research. E-mail: iamzgh@yeah.net

Received 29 October 2015; accepted 26 November 2015

CLC R979.6, TL7

隨著清潔無污染的核能得到廣泛的開發(fā)和應(yīng)用，尤其是核電站的建設(shè)數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢，使得核輻射事故的發(fā)生也呈現(xiàn)增加趨勢，特別是日本福島核電站事故的發(fā)生，造成了嚴(yán)重的放射性環(huán)境污染和人員傷亡。隨著腫瘤患者的增加，放療治療也給患者帶來一定的輻射損傷[1-4]。電離輻射作用于機(jī)體后，一是直接作于細(xì)胞核內(nèi)的DNA 分子[5]，造成DNA分子斷裂或堿基對錯誤結(jié)合，引起急性輻射損傷；二是間接作用于水分子，繼而生成自由基，自由基的化學(xué)性質(zhì)活潑，有極強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力，再作用于生物大分子，造成長期輻射損傷[6-7]。此外，輻射還會造成一些酶活性的改變，影響細(xì)胞的正常代謝途徑，致使代謝紊亂，進(jìn)而使免疫、神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能改變[8]。人體自身存在一套完整的氧化還原系統(tǒng)包括多種抗氧化酶[9-10]，可清除體內(nèi)多余的自由基，使體內(nèi)自由基水平保持一個動態(tài)平衡。因此，提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)抗氧化酶的活性和修復(fù)損傷的DNA是目前開發(fā)抗輻射損傷藥物主要的研究思路。

植物凝集素是一類從植物中提取的，具有特異糖結(jié)合活性的蛋白，具有一個或多個可以與單糖或寡糖特異可逆結(jié)合的非催化結(jié)構(gòu)域，因其能凝集紅血球，故名凝集素[11]。PHA-L是從紅腰豆中提取的凝集素。PHA-L作為一種有絲分裂原在生物及免疫學(xué)實驗方面有所應(yīng)用。本研究通過動物實驗發(fā)現(xiàn)植物凝集素PHA-L對小鼠急性輻射損傷具有保護(hù)作用，并通過細(xì)胞實驗推測這一作用發(fā)生可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與動物

PHA-L購自Medicago公司，用生理鹽水配制成溶液以待使用。

C57BL/6雄性小鼠（SPF級）由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供，合格證號[SCXK（京）2011-0012]，體重18～20 g。每籠5只飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動物實驗中心SPF級動物房（飼養(yǎng)設(shè)施合格證號：SVXK津2009-0002）。

1.2 主要儀器

照射源為加拿大Atomic Energy公司生產(chǎn)的137Cs g-射線輻照儀，劑量率為1.0 Gy/min，血細(xì)胞計數(shù)儀BC-2800vet，紫外分光光度計ZW0307060610，電子精密天平PL203。

1.3 30 d存活率實驗

1.3.1 動物實驗與分組

將80只ICR雄性小鼠分為5組，即正常對照組、單純照射組、照射給藥高、中和低3個劑量組(2.5、5.0、10 mg/kg)，每組16只。對照組給予假照射，單純照射組和照射給藥組小鼠接受全身7.2 Gy照射，照射給藥組照射前3 d每天腹腔注射給藥1次，共3次，第3次給藥后1 h照射，以后每天按原方案給藥，連續(xù)7次。

1.3.2 觀察指標(biāo)

每天觀察記錄各組小鼠的存活情況，并計算出小鼠的30 d存活率、平均存活時間和保護(hù)指數(shù)。30 d存活率(%)=（照射后每組小鼠的存活數(shù)/每組小鼠總數(shù)）×100%，根據(jù)公式計算保護(hù)指數(shù)，保護(hù)指數(shù)=[(ab+30c)/n]/[(ab+30c )/n]。式中：a、a分別為給藥組與單純照射組死亡鼠平均存活天數(shù)；b、b分別為給藥組與單純照射組死亡小鼠數(shù)；c、c分別為給藥組與單純照射組的30 d存活只數(shù)；n、n分別為給藥組與單純照射組總小鼠數(shù)。

1.4 外周血及臟器指數(shù)實驗

1.4.1 實驗動物分組及給藥方式

20只C57BL/6雄性小鼠分為單純照射組和照射給藥組，每組10只。對照組給予假照射，給藥組均接收7.2 Gy全身照射，照射條件同上，照射給藥組給藥方案同上，按高劑量10 mg/kg給藥。

1.4.2 造血系統(tǒng)指標(biāo)

白細(xì)胞數(shù)(White blood cell, WBC)：照射后第7天，小鼠摘眼球取血20 mL，加入到100 mL EDTA-2Ka的抗凝劑中，用全自動血液細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞數(shù)。股骨有核細(xì)胞數(shù)(The number of nucleated cells in bone marrow, BMNC)：小鼠稱重后，頸部脫臼處死，取小鼠一側(cè)股骨，用股骨有核細(xì)胞醋酸液(3%)反復(fù)沖洗骨髓腔，混勻后，取少許滴入計數(shù)板，在電子顯微鏡下計算股骨有核細(xì)胞數(shù)。DNA含量測定：取小鼠另一側(cè)股骨，用氯化鈣溶液按上述方法沖洗骨髓，放置、離心、棄上清后，加高氯酸反應(yīng)液，混勻、加熱、冷卻、過濾，濾液在268 nm處測吸光度(A)值。

1.4.3 免疫指標(biāo)

脾結(jié)節(jié)(CFU-S)照射后第7天，頸椎脫臼處死小鼠，解剖將其脾臟取出放入固定液中，約24 h后取出，肉眼觀察計數(shù)脾臟表面突出的結(jié)節(jié)數(shù)(CFU-S)。臟器指數(shù)：解剖小鼠取胸腺、脾、胰、肝臟、腎、心臟和性腺，稱質(zhì)量，按下列公式計算胸腺、脾、胰、肝、腎、心和性腺指數(shù)。

臟器指數(shù)=(臟器重量/體重)×1 000。

1.5 腸道輻射損傷觀察

1.5.1 動物分組及給藥方式

30只C57BL/6雄性小鼠按體重隨機(jī)分為空白對照組(Control)、單純照射組(IR)、照射給藥組(IR+PHA-L)，每組10只?？瞻讓φ战M給予假照射，其他兩組接收9.0 Gy腹部照射，照射給藥組給藥方案同上，按高劑量10 mg/kg給藥。

1.5.2 病理切片觀察

照射后第3天小鼠脫頸處死，取小腸組織處理，10%中性甲醛固定，24 h后脫水并制作石蠟塊。之后采用傳統(tǒng)實驗方法進(jìn)行HE染色，通過形態(tài)學(xué)變化觀察小腸的輻射損傷程度與恢復(fù)情況。

1.6 數(shù)據(jù)處理

小鼠30 d生存實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad 5生存分析，其余數(shù)據(jù)均以±s表示，用SPSS19.0軟件包分析數(shù)據(jù)，使用Student-Newman-Keuls進(jìn)行多組間顯著性差異分析，p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 30 d存活率

觀察記錄30 d內(nèi)小鼠存活情況，用GraphPad5法計算生存率并作圖。實驗結(jié)果見圖1和表1。與單純照射組相比，PHA-L在10 mg/kg的給藥劑量，能顯著提高小鼠30 d存活率，提高幅度約60%，其保護(hù)指數(shù)為1.88，并且能夠明顯延長小鼠的平均生存天數(shù)。中劑量5 mg/kg也有一定的保護(hù)作用。表明PHA-L對受照小鼠輻射損傷有較好的整體保護(hù)作用。

表1　受照小鼠平均生存時間與保護(hù)指數(shù)Table 1　Average survival time and index of mice after radiation

2.2 血象和免疫實驗結(jié)果

血象和免疫實驗結(jié)果列于表2和表3。由表2可知，與單純照射組相比，PHA-L以10 mg/kg的劑量給藥時，可明顯提高受照小鼠的白細(xì)胞數(shù)、股骨有核細(xì)胞數(shù)、骨髓DNA含量和脾結(jié)節(jié)數(shù)，表明PHA-L對輻射小鼠的造血系統(tǒng)有較好的保護(hù)作用；由表3可知，與單純照射組相比，PHA-L可提高輻射小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和肝指數(shù)，提示PHA-L對受照小鼠的免疫系統(tǒng)也有一定的保護(hù)作用。綜上，PHA-L能夠在一定程度上減輕輻射對造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的損傷作用。

表2　PHA-L對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的保護(hù)作用Table 2　 Protective effects of PHA-L on hematopoietic system in irradiated mice

表3　PHA-L對輻射損傷小鼠臟器的保護(hù)作用Table 3　Protective effects of PHA-L on organs in irradiated mice

2.3 腸道病理切片觀察

各實驗組腸道病理切片觀察結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，當(dāng)給藥劑量為10 mg/kg時，PHA-L能顯著改善電離輻射導(dǎo)致的小腸粘膜絨毛水腫及絨毛結(jié)構(gòu)脫落，對小腸的電離輻射損傷具有明顯的保護(hù)與促進(jìn)再生作用。

3 討論

植物凝集素是來源于植物的一類能凝集細(xì)胞和沉淀單糖或多糖復(fù)合物的非免疫來源的非酶蛋白質(zhì)。由于其對于單糖或糖復(fù)合物特異性結(jié)合的能力，使得其在如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、植物防御等諸多信號過程中均具有重要作用。同時植物凝集素具有細(xì)胞凝集、抗病毒、抗真菌、促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞的增值以及誘導(dǎo)凋亡等多種能力[8,12]。近年來，隨著研究的深入，植物凝集素新的生物功能不斷被發(fā)現(xiàn)，特別在對Toll樣受體的作用方面[13]，可激活TLP4受體。Xu等[14]運(yùn)用脂多糖刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW264.7 和人巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)大量自噬體形成，在將 T L R 4 抑制后自噬體形成明顯減少，說明TLR4 在識別 LPS 后能夠觸發(fā)自噬反應(yīng)。所以植物凝集素PHA-L或許能夠引發(fā)自噬效應(yīng)，隨后我們還做了PHA-L的自噬誘導(dǎo)實驗，發(fā)現(xiàn)PHA-L表現(xiàn)出很強(qiáng)烈的自噬效應(yīng)（未發(fā)表資料）。

植物凝集素PHA-L可有效減少受照小鼠急性期死亡率，延長照射小鼠生存時間，提示植物凝集素PHA-L對受照射小鼠有較好的整體防護(hù)作用。0～10 Gy電離輻射主要引起造血系統(tǒng)損傷，外周血白細(xì)胞數(shù)顯著下降[15-16]，我們研究了植物凝集素PHA-L對受照射小鼠造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)其可提高受照小鼠的白細(xì)胞數(shù)、骨髓DNA含量、股骨有核細(xì)胞數(shù)和脾結(jié)節(jié)數(shù)，提示植物凝集素PHA-L有升白作用，對免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用，我們認(rèn)為這可能與其免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，植物凝集素PHA-L能顯著改善電離輻射導(dǎo)致的小腸粘膜絨毛水腫及絨毛結(jié)構(gòu)脫落，這表明PHA-L對腸道輻射損傷有明顯的保護(hù)作用。PHA-L可引發(fā)自噬效應(yīng)，自噬是細(xì)胞在適應(yīng)各種生存壓力下的重要反應(yīng)， 同時能夠通過快速而相對簡單的過程清除胞內(nèi)微生物而參與免疫反應(yīng)[17]。腸道細(xì)胞在受到輻射作用的直接損傷之后，DNA斷裂，又或發(fā)生DNA修復(fù)，這些作用可能導(dǎo)致細(xì)胞的畸變，繼而負(fù)累整個腸道系統(tǒng)。這時候細(xì)胞的自噬將加大機(jī)體對損傷細(xì)胞的主動清除，為受傷組織的重生修復(fù)掃清道路。PHA-L的自噬誘導(dǎo)作用可能有助于促進(jìn)小鼠腸道細(xì)胞對輻射損傷細(xì)胞的清除，加速腸道組織的修復(fù)。雖然有關(guān)自噬與放射性腸炎之間的關(guān)系鮮有報道，但這種新的藥理機(jī)制闡明也有可能為腸道輻射損傷的藥物研究提供新的方向。

植物凝集素PHA-L可激活Toll受體，其下游主要激活NF-κB信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路持續(xù)激活是腫瘤福射抗性的重要分子機(jī)制，這一機(jī)制提供了研究新型抗輻射損傷藥物的新思路：即通過激活NF-κB細(xì)胞信號通路可以增強(qiáng)機(jī)體的抗福射損傷作用。植物凝集素PHA-L的抗輻射作用的機(jī)制可能與激活NF-κB通路有關(guān)。

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Protective effects of the plant lectin PHA-L on acute radiation injuries in mice

ZHANG Guanghui WU Hongying JIN Jin ZHOU Zewei LIU Peixun LONG Wei
(Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300192, China)

ABSTRACTThe aim is to observe the protective effects of plant lectin PHA-L against radiation injuries and the relative mechanism. 30 d survival experiment was used to observe the survival condition of mice 30 d after irradiation with 7.2 Gy γ-rays. Blood and immunological experiments of mice were carried out to observe WBC (White blood cell), femoral nucleated cells, bone marrow DNA content and organs index after irradiation with 7.2 Gy γ-rays. Intestine pathological section of mice irradiated on abdomen with 9.0 Gy γ-rays was prepared to observe the pathology of intestine. The results showed that compared with the irradiation group, the survival rate of mice treated with PHA-L increased, especially for the high dose group (60% lifted); compared with the irradiation group, whitebook=47,ebook=16blood cell count, bone marrow DNA content and spleen nodules of mice administered with high dose group increased from 0.74±0.16, 1.02±0.17 and 9.80±6.46 to 1.18±0.40, 1.22±0.17 and 18.10±6.87 respectively, which were statistically significant (p<0.05). Moreover, PHA-L also had some protective effect on the organ. In pathology observation, the intestines of mice treated with PHA-L recovered significantly as well. Therefore, plant lectin PHA-L can protect mice from radiation injuries, yet the mechanism needs further study.

KEYWORDSRadiation damage, Plant lectin PHA-L, Radiation intestine

Corresponding author:Ph.D. LONG Wei, associate professor, E-mail: longway@irm-cams.ac.cn

收稿日期：初稿2015-10-29；修回2015-11-26

通訊作者：龍偉，博士，副研究員，E-mail: longway@irm-cams.ac.cn

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.020203

中圖分類號R979.6，TL7